常温保存核酸标本的方法及其产品与使用方法与流程

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种常温保存核酸标本的方法及其产品与使用方法。

背景技术：

随着分子生物学检测技术的飞速发展，核酸的检测在各种领域发挥会着重要的作用。在检测的同时，也有大量的核酸标本需要被保存。这些保存下来的核酸有可能用于科学研究，或者随着科技的进步发挥更大的作用。

常见的核酸包括dna和rna，其中dna比较稳定，可长期保存；rna极不稳定，若想长期保存需逆转录成cdna，多数实验室只保存3～6个月。

目前，保存核酸样本多采用低温冻存的方法，比如低温冰箱(多为-30℃或-80℃)、冷库或者液氮保存，这样做看似顺理成章，但是实际中还是存在一些可探讨的问题：

第一，低温保存首先需要占用大量的冰箱，很占空间，其次不管是冰箱还是冷库，都需要大量的耗电，这既是经济负担，又是能源负担，还是环保负担；

第二，用液氮保存核酸的报道比较少，因为液氮属于消耗品，需要经常补充，这就使得这种保存方法的价格相对昂贵，而且还存在一定的安全隐患；

第三，dna虽然很稳定，但是随着时间的推移其自身也在不断发生着降解，多数报道的理论上限是十年。rna则更加明显，提取操作中稍有不慎，保存3个月都很困难。

但是，如果分析核酸的理化性质和降解酶的活性就不难发现，其在完全被干燥的状态下，可以延长核酸的保存时间，甚至被长期保存。比如有文献报道，在70年代用fta卡保存的人的全血样本中(干血片)，有人提取了rna并成功进行了下游实验；还有报道，由于条件的限制，在非洲检测hiv病毒(一种rna病毒)的常规方法是用fta卡保存血液样本，干燥后运输到本地实验室检测进行检测；dna效果更佳，尼安德特人基因的提取并测序，甚至是从恐龙化石中提取dna都已经不是新闻。类似的报道很多，这些都说明一个问题，即使是不纯(和其它物质混合在一起的状态)，只要是在完全被干燥的状态下，核酸就能被长期常温保存。那么如果是比较纯的核酸呢，则结果未知。因此，还需要开发新型的保存核酸的方法。

技术实现要素：

针对现有技术中的缺陷，本发明目的在于提供一种常温保存核酸标本的方法及其产品与使用方法，以通过采用二氧化硅材质、氧化锆材质和和碳钢的微珠的表面为载体，利用核酸在高盐状态下，能与二氧化硅类物质亲和吸附，以及在干燥状态下能长期保存的特点，常温长期保存核酸；直接保存dna、新鲜或固定液处理过的细胞，均可以实现对核酸的长期保存，且保存效果好，保存方法简单。

为实现上述目的，本发明提供的技术方案为：本发明提供了一种常温保存核酸标本的方法，包括如下步骤：s1：将二氧化硅微珠、氧化锆微珠和碳钢微珠用酸清洗，然后等个数混合，放在容器中；s2：将核酸标本溶液加入容器中，混匀后干浴或干燥；s3：将s2得到的样本室温干燥保存，即可。需要说明的是，三种微珠均要进行酸洗，这样做的目的有三：(1)可以去除珠子表面的核酸，实现无核酸；(2)增加表面的粗糙感，增加附着力；(3)先使玻璃珠带上正电荷，抵消随后的负电，增强吸附性。

在本发明的进一步实施方式中，s1中，二氧化硅微珠、氧化锆微珠和碳钢微珠的个数均为10个，容器为1.5ml离心管或形状相似的容器。需要说明的是，将三种微珠共30个(1:1:1)，放在1.5ml离心管或形状相似的容器中，这样珠子数量和体积刚好，有利于水分的蒸发。

在本发明的进一步实施方式中，s2中，干浴为在生物安全柜中45～55℃干浴，中间混匀2～3次。

在本发明的进一步实施方式中，s2中，干燥为在真空干燥箱中干燥，干燥时间为6～30h。需要说明的是，干燥时间优选为24h。

在本发明的进一步实施方式中，s2中，核酸标本溶液的体积不少于100μl。需要说明的是，加入的核酸标本溶液的体积应该不少于微球的总体积。

在本发明的进一步实施方式中，s2中，核酸标本溶液为dna溶液或细胞悬液。需要说明的是，如果是固定液处理的细胞，应该先用pbs洗涤后再重悬。

在本发明的进一步实施方式中，dna溶液中，dna的量大于300ng；细胞悬液中，细胞数为(1～10)×10⁷个。

在本发明的进一步实施方式中，dna溶液的溶剂为te缓冲液；细胞悬液是采用pbs重悬细胞制备而成。

本发明还保护同时上述常温保存核酸标本的方法保存得到的核酸标本。需要说明的是，完成后将核酸标本室温干燥保存，最好是阴凉通风处。

本发明还提供了保存得到的核酸标本的使用方法，包括如下步骤：将保存的附有dna样本的微珠直接扩增；或将保存的附有细胞样本的微珠用dna提取试剂盒进行dna提取，然后进行扩增；或将保存的附有细胞样本的微珠用rna提取试剂盒进行rna提取，将提取得到的rna反转录成cdna，然后进行下游实验。需要说明的是，对于dna保存标本，可以取出一粒微珠直接扩增，也可以取出几粒微珠进行预混液的制备(根据浓度)；对于细胞或固定液处理后的细胞保存的标本，需要gdna时可以用试剂盒提取或取出微珠，直接扩增，方法与dna样本大致相同；需要rna时则需要试剂盒提取，并且反转录成cdna并进行下游实验。

本发明提供的技术方案，具有如下的有益效果：(1)本发明提供的常温保存核酸标本的方法，以二氧化硅(玻璃)材质、氧化锆(陶瓷)材质和碳钢材质的微珠的表面为载体(三种微珠单独或者混合均可)，利用核酸在高盐状态下，能与二氧化硅类物质亲和吸附，以及在干燥状态下能长期保存的特点，常温长期保存核酸；(2)本发明提供的常温保存核酸标本的方法，直接保存dna效果很好，而且保存后的dna可以直接进行pcr扩增；直接保存rna并反转录所得到cdna的扩增效果一般，但可以通过干燥新鲜或固定液处理过的细胞，实现对rna的长期保存，需要时重新提取并且逆转录即可，下游实验效果也很理想；当然从干燥后的新鲜细胞或固定液处理过的细胞中也可以提取dna，而且得率同样很佳；(3)本发明提供的常温保存核酸标本的方法，保存方法简单，成本低。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

图1为本发明实施例一中常温保存dna的琼脂糖凝胶电泳图；

图2为本发明实施例一中常温保存dna一年后的琼脂糖凝胶电泳图；

图3为本发明实施例二中氧化锆微珠常温保存新鲜的细胞的琼脂糖凝胶电泳图；

图4为本发明实施例二中二氧化硅微珠常温保存新鲜的细胞的琼脂糖凝胶电泳图；

图5为本发明实施例三中氧化锆微珠常温保存固定液处理过的细胞的琼脂糖凝胶电泳图；

图6为本发明实施例三中二氧化硅微珠常温保存固定液处理过的细胞的琼脂糖凝胶电泳图；

图7为本发明实施例四中提取常温保存新鲜的细胞的基因组dna的琼脂糖凝胶电泳图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只是作为示例，而不能以此来限制本发明的保护范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，数据为三次重复实验的平均值或平均值±标准差。

实施例一：常温保存dna

本实施例提供一种常温保存核酸标本的方法，包括步骤具体如下。

s1：将二氧化硅微珠、氧化锆微珠和碳钢微珠用酸清洗，然后各取10个微珠混合，放在1.5ml离心管中；

s2：将提取的不同的dna分别与te缓冲液混溶，分别制备得到dna溶液；将dna溶液分别加入1.5ml离心管中，干浴锅中55℃放置24h，中间混匀3次；

s3：完全干燥后，分别室温干燥保存。

4种附有不同dna的微珠，分别命名为te-1至te-4(溶剂是te)，每种珠子上含有dna的量约为te-1(312ng)；te-2(166ng)；te-3(139ng)；te-4(62～71ng)。

室温放置3天后，用8对不同的引物扩增。

te-1至te-3各取出一个氧化锆微珠做8.5份预混液，te-4取出两个氧化锆微珠做8.5份预混液。

20μl体系组成：10μl2×q5highfidelitymastermix

2μl引物

8μln-f水(先浸润磁珠10分钟左右)

反应条件：

98℃30s—(98℃10s-68℃10s-72℃20s)x35—72℃2min—4℃∞。

产物分析：3μl上样，2％琼脂糖凝胶，200v，电泳30min。

电泳得到的结果如图1所示。

时隔一年，再次实验：实验方法与之前完全相同，不同的是增加了8对引物，共计16对。电泳得到的结果如图2所示(1对应te-1，2对应te-2，3对应te-3，4对应te-4)。

比较图1和图2得到的结果，实验结果与之前几乎无差异，做扩增及后续的测序实验都没有问题。(注：1#标本只是电泳效果不佳，个别差异是由操作引起)。

实施例二：常温保存新鲜的细胞

本实施例提供一种常温保存核酸标本的方法，包括步骤具体如下。

s1：将二氧化硅微珠、氧化锆微珠和碳钢微珠用酸清洗，然后各取10个微珠混合，放在1.5ml离心管中；

s2：新鲜pb样本，根据细胞计数，取出含有5×10⁶个白细胞的全血，用5倍体积的红细胞裂解液(0.5x)裂解红细胞后，用100μlpbs重悬；将细胞悬液加入1.5ml离心管中，放在真空干燥箱中干燥；

s3：完全干燥后，室温干燥保存，每个珠子上含有约1×10⁵个白细胞或等量的dna。

pcr反应时每孔加2个氧化锆微珠或2个二氧化硅微珠，用7对不同的引物扩增。

20μl体系组成：10μl2×q5highfidelitymastermix

2μl引物

8μln-f水

反应条件：98℃30s—(98℃10s-68℃10s-72℃20s)x35—72℃2min—4℃∞。

产物分析：3μl上样，2％琼脂糖凝胶，200v，电泳30min。

电泳得到的结果如图3、如图4所示；其中图3的样本a5采用的是氧化锆微珠，图4的样本b5采用的是二氧化硅微珠。

实施例三：常温保存固定液处理过的细胞

(细胞)固定液是染色体核型分析样本制备的必用试剂，它是由甲醇和冰醋酸按照3:1的比例配制而成，固定后的细胞悬液(此时，gdna最完整的状态)可以长期保存在-30℃。

本实施例提供一种常温保存核酸标本的方法，包括步骤具体如下。

s1：将二氧化硅微珠、氧化锆微珠和碳钢微珠用酸清洗，然后各取10个微珠混合，分别放在1.5ml离心管中；

s2：取出500μl甲醇-冰醋酸细胞悬液(wbc共计2.5×10⁶)，置于1.5ml的ep管中，5000rpm离心3min；

细胞悬液将甲醇-冰醋酸全部吸出，用pbs缓冲液重悬(wbc有些损失)，8000rpm离心3min，吸出全部pbs缓冲液，再分别用100μlpbs和te缓冲液重悬；将细胞悬液分别加入1.5ml离心管中，分别放在真空干燥箱中干燥；

s3：完全干燥后，室温干燥保存，每个珠子上含有约不足5×10⁴个白细胞或等量的dna。

pcr反应时每孔加2个氧化锆微珠或2个二氧化硅微珠，用7对不同的引物扩增。

20μl体系组成：10μl2×q5highfidelitymastermix

2μl引物

8μln-f水

反应条件：98℃30s—(98℃10s-68℃10s-72℃20s)x35—72℃2min—4℃∞。

产物分析：3μl上样，2％琼脂糖凝胶，200v，电泳30min。

电泳得到的结果如图5、如图6所示；其中图5的样本a13、a14采用的是氧化锆微珠，图6的样本b13、b14采用的是二氧化硅微珠。

实施例四：将实施例二保存得到的核酸标本提取基因组dna

取实施例二干燥后的新鲜细胞悬液的微珠，经过试剂盒重新提取gdna(得率不低)，分别用t6(国产)酶和q5(进口)酶扩增，观察不同质量的试剂扩增有没有差别。

t6扩增条件：

q5扩增条件：

产物分析：3μl上样，2％琼脂糖凝胶，200v，电泳30min。

电泳得到的结果如图7所示。

本发明提供的技术方案，具有如下的有益效果：(1)本发明提供的常温保存核酸标本的方法，以二氧化硅(玻璃)材质、氧化锆(陶瓷)材质和碳钢的微珠的表面为载体(三种微珠单独或者混合均可)，利用核酸在高盐状态下，能与二氧化硅类物质亲和吸附，以及在干燥状态下能长期保存的特点，常温长期保存核酸；(2)本发明提供的常温保存核酸标本的方法，直接保存dna效果很好，而且保存后的dna可以直接进行pcr扩增；直接保存rna并反转录所得到cdna的扩增效果一般，但可以通过干燥新鲜或固定液处理过的细胞，实现对rna的长期保存，需要时重新提取并且逆转录即可，下游实验效果也很理想；当然从干燥后的新鲜细胞或固定液处理过的细胞中也可以提取dna，而且得率同样很佳；(3)本发明提供的常温保存核酸标本的方法，保存方法简单，成本低。

需要注意的是，除非另有说明，本申请使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域技术人员所理解的通常意义。除非另外具体说明，否则在这些实施例中阐述的部件和步骤的相对步骤、数字表达式和数值并不限制本发明的范围。在这里示出和描述的所有示例中，除非另有规定，任何具体值应被解释为仅仅是示例性的，而不是作为限制，因此，示例性实施例的其他示例可以具有不同的值。

在本发明的描述中，需要理解的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是两个以上，除非另有明确具体的限定。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，其均应涵盖在本发明的保护范围当中。