一种全集成核酸检测微流控芯片及其使用方法与流程

本发明涉及核酸扩增检测
技术领域：
，尤其涉及一种全集成核酸检测微流控芯片及其使用方法。
背景技术：
：微流控芯片是以微机电加工技术为基础，由微管路在芯片上形成网络，以可控微流体贯穿整个系统并完成各种生物和化学过程的一种技术。在微流控芯片技术发展早期，芯片毛细管电泳是其主流技术，所用芯片结构简单，功能单一；近年来，微流控芯片开始向功能化、集成化方向飞速发展，诸如核酸扩增反应、免疫反应、细胞裂解等重要的生物和化学过程成为新的热点。随着产业的发展，微流控芯片的应用领域从实验室逐步扩展到临床医院，这就需要开发满足临床应用的全集成核酸检测微流控芯片。通常的核酸检测流程是：称量样本，使用试剂盒手工提取核酸，再将提取后的核酸与扩增试剂混合，放入pcr仪内扩增反应，之后进行数据分析。流程复杂，人工操作容易失误，耗时长效率低。为解决这些问题，微流控芯片做了很多尝试，例如cn200710158570.3、cn201510191236.2，但这些芯片均只能实现核酸检测的部分功能，且没有考虑临床用户的实际需求，很难实用化。临床医院对核酸检测微流控芯片的要求有：1、能处理复杂样本。临床上的简单样本包括鼻咽拭子、尿液、血液；复杂样本包括痰液、组织、粪便等固液混合态样本。复杂样本在核酸提取前必须进行前处理，去除干扰物并液化样本。2、包含全部流程和试剂。核酸检测流程包含四大模块：前处理-核酸提取-核酸扩增-检测分析。临床用户需要流程自动化，这样微流控芯片就要包含所有流程和配套试剂，实现样本进-结果出。3、密闭性强。核酸检测与生化、免疫检测不同的是在核酸扩增中容易产生气溶胶污染，导致假阳性结果，因此整个微流控芯片需要密闭化。另外，核酸检测的一个主要临床应用是检测传染病，样本的高传染性使得检验人员极易感染，这也要求芯片密闭化。4、成本低。微流控芯片作为一种新型医疗耗材，是面向普通临床患者，患者对检测项目价格很敏感，这就要求芯片制造成本低、材料成本低，尽量降低患者负担。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种全集成核酸检测微流控芯片及其使用方法，提供一种能集成处理复杂样本，密闭性好，结构简单的核酸检测微流控芯片。本发明是这样实现的：一种全集成核酸检测微流控芯片，包括盖片、基片、底片、样本盒和泡罩，所述盖片和底片将所述基片的两面贴合，所述基片设有出样口、通道、样本盒凹槽、至少一个泡罩凹槽和至少一个反应池，所述通道分别与样本盒凹槽、各泡罩凹槽和各反应池连通，各反应池与出样口连接；所述样本盒设在样本盒凹槽上，所述样本盒凹槽与至少一个反应池连接，所述泡罩设在所述泡罩凹槽上，所述泡罩内放置试剂，所述各泡罩凹槽分别与样本盒凹槽、至少一个反应池连接。使用时，先将样本放在样本盒中，使样本依次经过样本盒凹槽和各反应池，反应所需的试剂经由泡罩凹槽进入反应池，与样本进行反应，反应后得到检测前溶液，经过出样口排出，进入检测仪器中进行检测。由于复杂样本在核酸提取前必须进行前处理，去除干扰物并液化样本，采用上述技术方案，在各反应池中将负责样本处理后，使其具备检测条件，本发明将复杂样本的处理过程简单化，是一种全集成处理复杂样本的微流控芯片。作为本发明的进一步改进，所述基片上设有旋转阀和泵接口，所述旋转阀设有转换孔；将旋转阀旋转，使转换孔的一端与至少一个泡罩凹槽连接，转换孔的另一端与至少一个反应池连接；所述泵接口的一端与通道连接，所述泵接口的另一端与外部仪器连接。采用上述技术方案，通过旋转阀解决了泡罩内试剂对各反应池的流通问题，不需要单独设置多个通闭阀，节省了零件数量以及芯片的空间位置，降低了这种全集成核酸扩增微流控芯片的生产成本；所述泵接口为芯片的通道提供动力，使通道内流体的流动更加顺畅、快速。作为本发明的进一步改进，所述反应池包括废液池、吸附池、磁珠捕获池和扩增池，所述样本盒凹槽、吸附池、磁珠捕获池、扩增池和出样口依次连接，所述磁珠捕获池与废液池连接，所述吸附池内设有磁珠。所述样本盒凹槽用于样本的前处理，所述吸附池和磁珠捕获池用于样本的核酸提取，所述扩增池用于样本的核酸扩增反应，所述出样口与检测仪器连接，所述泡罩内设有反应所需的试剂。采用上述技术方案，使全集成核酸扩增微流控芯片集成了核酸检测反应的前处理-核酸提取-核酸扩增-检测分析四大流程，包含了反应所需的试剂，实现样本进-结果出的目标。作为本发明的进一步改进，所述样本盒包括盒本体和样本盒密封层，所述盒本体通过所述样本盒密封层与样本盒凹槽连接；所述样本盒凹槽内设有凸起，所述凸起处在所述样本盒密封层的下方。下压样本盒时，样本盒密封层被凸起刺破，样本从样本盒下端进入样本盒凹槽，开始样本的处理过程。采用上述技术方案，保证了核酸检测整个过程的密闭性，减少了外界对样本的影响，以及样本对检测人员的传染危害。作为本发明的进一步改进，所述泡罩包括泡罩本体和泡罩密封层，所述泡罩本体通过所述泡罩密封层与泡罩凹槽连接；所述泡罩凹槽内设有凸起，所述凸起处在所述泡罩密封层的下方；所述泡罩本体在受压时发生变形。挤压泡罩时，泡罩变形，泡罩内的试剂对泡罩密封层施加向下的压力，使泡罩密封层被凸起刺破，试剂从泡罩下端进入泡罩凹槽，参与样本的处理过程。采用上述技术方案，保证了核酸检测整个过程的密闭性，减少了外界对样本的影响，以及样本对检测人员的传染危害。作为本发明的进一步改进，所述样本盒凹槽设有过滤膜，所述吸附池、磁珠捕获池均设有搅拌子。所述过滤膜对样本进行过滤，所述搅拌子使反应均匀、快速地进行，保证了样本的检测效果。本发明的另一个目的是提供一种全集成核酸检测微流控芯片的使用方法，包括以下步骤：步骤s1,用户将样本加入样本盒中，使样本进入到样本盒凹槽中；使用外部仪器挤压泡罩，向样本盒凹槽内加入试剂，获得处理后样本；步骤s2,外部仪器通过泵接口推动处理后样本，使处理后样本依次通过吸附池、磁珠捕获池和扩增池，在通过各反应池时，根据反应需要，使用外部仪器挤压泡罩，向反应池中加入相应的试剂，最终获得检测前溶液；步骤s3，步骤s2获得的检测前溶液经由出样口，进入检测仪器，进行检测分析。由于复杂样本在核酸提取前必须进行前处理，去除干扰物并液化样本，采用上述技术方案，在各反应池中将负责样本处理后，使其具备检测条件，本发明将复杂样本的处理过程简单化，是一种全集成处理复杂样本的微流控芯片。进一步的，所述步骤s2还包括:所述样本盒凹槽设有过滤膜，所述吸附池、磁珠捕获池均设有搅拌子；所述磁珠从吸附池进入磁珠捕获池后，所述吸附池中的溶液进入废液池。所述过滤膜对样本进行过滤，所述搅拌子使反应均匀、快速地进行，保证了样本的检测效果。所述磁珠将样本中的核酸带进磁珠捕获池，将不含核酸的溶液排进废液池，减少了废液排出设备的应用，简化了核酸检测微流控芯片的结构，减少了废液对环境、检测人员的污染危害。采用上述技术方案，保证了核酸检测整个过程的快速、均匀反应以及密闭性，减少了样本对检测人员的传染危害。进一步的，所述扩增池包括依次连接的一级扩增池、称量池、二级扩增预混合池和二级扩增池，所述磁珠捕获池与一级扩增池连接，所述二级扩增池与出样口连接。本发明使用两级核酸扩增反应，目的是：一级核酸扩增反应是利用通用引物扩增待检测核酸片段，提高检测灵敏度；二级核酸扩增反应是利用特异性引物扩增不同种类核酸片段，特异性地检测不同目的指标。采用上述技术方案，将核酸的扩增反应分成一级、二级两个反应场所进行，使扩增反应完全，提高了检测准确度。进一步的，所述全集成核酸检测微流控芯片还包括薄膜式扩增芯片，所述薄膜式扩增芯片包括依次贴合的薄膜底片、薄膜中间层和薄膜盖片，所述薄膜式扩增芯片设有二级扩增反应所需的试剂，所述二级扩增池与出样口均设在薄膜式扩增芯片上。采用上述技术方案，利用了薄膜时扩增芯片的厚度小，因此温度传导效率高的优点，提高了外部加热装置对薄膜式扩增芯片的温度控制效率，有利于核酸扩增反应的进行，提高了检测准确度。与现有技术相比，本全集成核酸检测微流控芯片及其使用方法具备以下优点：1.能集成处理复杂样本，本发明通过样本盒、泡罩和各反应池的有序设置，使复杂样本从样本前处理到样本的检测全集成，节省了检测前处理时间，提高了检测工作效率。2.包含全部流程和试剂，核酸检测流程包含四大模块：前处理-核酸提取-核酸扩增-检测分析。本发明通过泡罩内放置与各反应池对应的试剂，使这种核酸检测微流控芯片包含了核酸检测所需的全部流程和试剂，节省了检测前处理时间，提高了检测工作效率。3.密闭性好，本发明通过样本盒密封层、泡罩密封层和废液池的设置，保证了核酸检测整个过程的密闭性，减少了外界对样本的影响，以及样本对检测人员的传染危害。4.结构简单，本发明通过旋转阀的设置，解决了泡罩内试剂对各反应池的流通问题，不需要单独设置多个通闭阀，节省了零件数量以及芯片的空间位置，结构简单，降低了这种全集成核酸扩增微流控芯片的生产成本。附图说明图1是一种全集成核酸检测微流控芯片的结构图。图2是一种全集成核酸检测微流控芯片的结构图。附图说明：1-盖片，2-基片，201-样本盒凹槽，202-泡罩凹槽，203-旋转阀，204-泵接口，205-废液池，206-吸附池，207-磁珠捕获池，208-称量池，209-一级扩增池，210-二级扩增预混合池，3-底片，4-样本盒，5-泡罩，6-薄膜式扩增芯片。具体实施方式为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面结合附图及具体实施例对本发明进一步说明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中，芯片制作技术和使用方法均为微流控芯片领域和生物检测领域的常规技术和方法。实施例1一种全集成核酸检测微流控芯片，包括盖片、基片、底片、样本盒和泡罩，所述盖片和底片将所述基片的两面贴合，所述基片设有出样口、通道、样本盒凹槽、至少一个泡罩凹槽和至少一个反应池，所述通道分别与样本盒凹槽、各泡罩凹槽和各反应池连通，各反应池与出样口连接；所述样本盒设在样本盒凹槽上，所述样本盒凹槽与至少一个反应池连接，所述泡罩设在所述泡罩凹槽上，所述泡罩内放置试剂，所述各泡罩凹槽分别与样本盒凹槽、至少一个反应池连接。使用时，先将样本放在样本盒中，使样本依次经过样本盒凹槽和各反应池，反应所需的试剂经由泡罩凹槽进入反应池，与样本进行反应，反应后得到检测前溶液，经过出样口排出，进入检测仪器中进行检测。由于复杂样本在核酸提取前必须进行前处理，去除干扰物并液化样本，采用上述技术方案，在各反应池中将负责样本处理后，使其具备检测条件，本发明将复杂样本的处理过程简单化，是一种全集成处理复杂样本的微流控芯片。进一步的，所述基片上设有旋转阀和泵接口，所述旋转阀设有转换孔；将旋转阀旋转，使转换孔的一端与至少一个泡罩凹槽连接，转换孔的另一端与至少一个反应池连接；所述泵接口的一端与通道连接，所述泵接口的另一端与外部仪器连接。采用上述技术方案，通过旋转阀解决了泡罩内试剂对各反应池的流通问题，不需要单独设置多个通闭阀，节省了零件数量以及芯片的空间位置，降低了这种全集成核酸扩增微流控芯片的生产成本；所述泵接口为芯片的通道提供动力，使通道内流体的流动更加顺畅、快速。进一步的，所述反应池包括废液池、吸附池、磁珠捕获池和扩增池，所述样本盒凹槽、吸附池、磁珠捕获池、扩增池和出样口依次连接，所述磁珠捕获池与废液池连接，所述吸附池内设有磁珠。所述样本盒凹槽用于样本的前处理，所述吸附池和磁珠捕获池用于样本的核酸提取，所述扩增池用于样本的核酸扩增反应，所述出样口与检测仪器连接，所述泡罩内设有反应所需的试剂。采用上述技术方案，使全集成核酸扩增微流控芯片集成了核酸检测反应的前处理-核酸提取-核酸扩增-检测分析四大流程，包含了反应所需的试剂，实现样本进-结果出的目标。进一步的，所述样本盒包括盒本体和样本盒密封层，所述盒本体通过所述样本盒密封层与样本盒凹槽连接；所述样本盒凹槽内设有凸起，所述凸起处在所述样本盒密封层的下方。下压样本盒时，样本盒密封层被凸起刺破，样本从样本盒下端进入样本盒凹槽，开始样本的处理过程。采用上述技术方案，保证了核酸检测整个过程的密闭性，减少了外界对样本的影响，以及样本对检测人员的传染危害。进一步的，所述泡罩包括泡罩本体和泡罩密封层，所述泡罩本体通过所述泡罩密封层与泡罩凹槽连接；所述泡罩凹槽内设有凸起，所述凸起处在所述泡罩密封层的下方；所述泡罩本体在受压时发生变形。挤压泡罩时，泡罩变形，泡罩内的试剂对泡罩密封层施加向下的压力，使泡罩密封层被凸起刺破，试剂从泡罩下端进入泡罩凹槽，参与样本的处理过程。采用上述技术方案，保证了核酸检测整个过程的密闭性，减少了外界对样本的影响，以及样本对检测人员的传染危害。进一步的，所述样本盒凹槽设有过滤膜，所述样本盒、吸附池、磁珠捕获池均设有搅拌子。所述过滤膜对样本进行过滤，所述搅拌子使反应均匀、快速地进行，保证了样本的检测效果。实施例2在实施例1的基础上，一种全集成核酸检测微流控芯片的使用方法，包括以下步骤：步骤s1,用户将样本加入样本盒中，使样本进入到样本盒凹槽中；使用外部仪器挤压泡罩，向样本盒凹槽内加入试剂，获得处理后样本；步骤s2,外部仪器通过泵接口推动处理后样本，使处理后样本依次通过吸附池、磁珠捕获池和扩增池，在通过各反应池时，根据反应需要，使用外部仪器挤压泡罩，向反应池中加入相应的试剂，最终获得检测前溶液；步骤s3，步骤s2获得的检测前溶液经由出样口，进入检测仪器，进行检测分析。由于复杂样本在核酸提取前必须进行前处理，去除干扰物并液化样本，采用上述技术方案，在各反应池中将负责样本处理后，使其具备检测条件，本发明将复杂样本的处理过程简单化，是一种全集成处理复杂样本的微流控芯片。进一步的，所述步骤s2还包括:所述样本盒凹槽设有过滤膜，所述吸附池、磁珠捕获池均设有搅拌子；所述磁珠从吸附池进入磁珠捕获池后，所述吸附池中的溶液进入废液池。所述过滤膜对样本进行过滤，所述搅拌子使反应均匀、快速地进行，保证了样本的检测效果。所述磁珠将样本中的核酸带进磁珠捕获池，将不含核酸的溶液排进废液池，减少了废液排出设备的应用，简化了核酸检测微流控芯片的结构，减少了废液对环境、检测人员的污染危害。采用上述技术方案，保证了核酸检测整个过程的快速、均匀反应以及密闭性，减少了样本对检测人员的传染危害。进一步的，所述扩增池包括依次连接的一级扩增池、称量池、二级扩增预混合池和二级扩增池，所述磁珠捕获池与一级扩增池连接，所述二级扩增池与出样口连接。本发明使用两级核酸扩增反应，目的是：一级核酸扩增反应是利用通用引物扩增待检测核酸片段，提高检测灵敏度；二级核酸扩增反应是利用特异性引物扩增不同种类核酸片段，特异性地检测不同目的指标。采用上述技术方案，将核酸的扩增反应分成一级、二级两个反应场所进行，使扩增反应完全，提高了检测准确度。采用上述技术方案，将核酸的扩增反应分成一级、二级两个反应场所进行，使扩增反应完全，提高了检测准确度。进一步的，所述全集成核酸检测微流控芯片还包括薄膜式扩增芯片，所述薄膜式扩增芯片包括依次贴合的薄膜底片、薄膜中间层和薄膜盖片，所述薄膜式扩增芯片设有二级扩增反应所需的试剂，所述二级扩增池与出样口均设在薄膜式扩增芯片上。采用上述技术方案，利用了薄膜时扩增芯片的厚度小，因此温度传导效率高的优点，提高了外部加热装置对薄膜式扩增芯片的温度控制效率，有利于核酸扩增反应的进行，提高了检测准确度。与现有技术相比，本全集成核酸检测微流控芯片及其使用方法具备以下优点：1.能集成处理复杂样本，本发明通过样本盒、泡罩和各反应池的有序设置，使复杂样本从样本前处理到样本的检测全集成，节省了检测前处理时间，提高了检测工作效率。2.包含全部流程和试剂，核酸检测流程包含四大模块：前处理-核酸提取-核酸扩增-检测分析。发明通过泡罩内放置与各反应池对应的试剂，使这种核酸检测微流控芯片包含了核酸检测所需的全部流程和试剂，节省了检测前处理时间，提高了检测工作效率。3.密闭性好，本发明通过样本盒密封层泡罩密封层和废液池的设置，保证了核酸检测整个过程的密闭性，减少了外界对样本的影响，以及样本对检测人员的传染危害。4.结构简单，本发明通过旋转阀的设置，解决了泡罩内试剂对各反应池的流通问题，不需要单独设置多个通闭阀，节省了零件数量以及芯片的空间位置，结构简单，降低了这种全集成核酸扩增微流控芯片的生产成本。实施例3在实施例1和实施例2的基础上，本实施例结合图1-图2来说明本发明。如图1、图2所示，一种全集成核酸检测微流控芯片，包括盖片1、基片2、底片3、样本盒4和泡罩5，所述盖片1和底片3将所述基片2的两面贴合，所述基片2设有出样口、通道、样本盒凹槽201、至少一个泡罩凹槽202和至少一个反应池，所述通道分别与样本盒凹槽201、各泡罩凹槽202和各反应池连通，各反应池与出样口连接；所述样本盒4设在样本盒凹槽201上，所述样本盒凹槽201与至少一个反应池连接，所述泡罩5设在所述泡罩凹槽202上，所述泡罩5内放置试剂，所述泡罩凹槽202分别与样本盒凹槽201、至少一个反应池连接。在上述的技术方案中，所述盖片、底片用于和基片配合，形成封闭的反应池和通道。所述盖片、底片和基片的封接方式为热压封接、高强度化学胶粘接或激光焊接中的一种。进一步的，所述基片2上设有旋转阀203和泵接口204，所述旋转阀203设有转换孔；将旋转阀203旋转，使转换孔的一端与至少一个泡罩凹槽202连接，转换孔的另一端与至少一个反应池连接；所述泵接口204的一端与通道连接，所述泵接口204的另一端与外部仪器连接。进一步的，所述反应池包括废液池205、吸附池206、磁珠捕获池207、一级扩增池209、称量池208、二级扩增预混合池210和薄膜式扩增芯片6，所述样本盒凹槽201、吸附池206、磁珠捕获池207、一级扩增池209、称量池208、二级扩增预混合池210和薄膜式扩增芯片6依次连接，所述磁珠捕获池207与废液池205连接，所述出样口设在所述薄膜式扩增芯片6上，所述出样口与检测仪器连接。所述泵接口204设有接口密封层和防污染滤膜。在上述的技术方案中，其中，所述吸附池内设有磁珠，所述磁珠与固定化试剂混合在一起，粘附在吸附池内。所述吸附池、磁珠捕获池内均设有搅拌子，所述小搅拌子在外界磁力作用下旋转。其中，所述称量池包括称量腔和疏水透气介质，所述疏水透气介质的材质是聚四氟乙烯、聚偏氟乙烯或聚丙烯中的一种。其中，所述一级扩增池内有第一固态试剂，所述第一固态试剂包括酶和引物；所述二级扩增预混合池内设有第二固态试剂，所述第二固态试剂包括酶。进一步的，所述薄膜式扩增芯片包括依次贴合薄膜底片、薄膜中间层和薄膜盖片，所述薄膜式扩增芯片设有二级扩增反应所需的第三固态试剂，所述第三固态试剂包括引物，所述第三固态试剂的固态形式为干粉或凝胶。所述薄膜式扩增芯片设有二级扩增池，所述二级扩增池的一端与二级扩增预混合池连接，所述二级扩增池的一端的另一端与出样口连接。进一步的，所述样本盒包括盒本体和样本盒密封层，所述盒本体通过所述样本盒密封层与样本盒凹槽连接；所述样本盒凹槽内设有凸起，所述凸起处在所述样本盒密封层的下方。在上述的技术方案中，其中，所述样本盒中设有搅拌子和第四固态试剂，所述盒本体包括相互连接的盒盖和盒壳，所述盒盖与盒壳通过螺纹或卡扣连接。所述样本盒密封层为聚对苯二甲酸乙二酯、环烯烃类共聚物、铜箔或铝箔中的一种。所述盒壳和样本盒密封层的封接方式是热压封接、高强度化学胶粘接或激光焊接中的一种。其中，所述凸起可以是与所述基片连为一体的，也可以是分离的，连为一体的优点是可以一次加工成型，但注塑精度要求高；分离的优点是注塑精度无需太高，但生产过程繁琐。所述凸起的材质是塑料或金属中的一种，所述凸起通过镶嵌或粘接的方式与基片结合。其中，所述样本盒凹槽内还设有过滤膜，所述过滤膜用于过滤样本，所述过滤膜和所述样本盒凹槽的封接方式为热压封接或高强度化学胶粘接。其中，所述样本盒凹槽内还可以有膜压环，所述过滤膜和所述样本盒凹槽通过膜压环结合在一起。其中，所述样本盒凹槽内还可以有螺纹或卡扣，用于样本盒与样本盒凹槽的结合。其中，所述样本盒凹槽内还可以有密封环，在样本盒与样本盒凹槽结合后保证试剂不会泄露。进一步的，所述泡罩包括泡罩本体和泡罩密封层，所述泡罩本体通过所述泡罩密封层与泡罩凹槽连接；所述泡罩凹槽内设有凸起，所述凸起处在所述泡罩密封层的下方；所述泡罩本体在受压时发生变形。所述泡罩内储存有液态试剂，所述液态试剂包括裂解液、乙醇、清洗液和洗脱液试剂。所述的底片、基片和盖片的材质选自下述任意一种、任意几种组成的复合体或任意几种组成的混合体：金属、玻璃、石英、硅、陶瓷、高分子化合物、橡胶和硅铝酸盐化合物。优选的，所述的底片、基片和盖片的材质为高分子材料，所述高分子材料为聚碳酸酯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚对苯二甲酸乙二酯或环烯烃类共聚物中的至少一种。在上述的基础上，一种全集成核酸检测微流控芯片的使用方法，包括步骤b1-b12。步骤b1，样本准备。用户将样本加入样本盒中，扣紧盒盖,将样本盒插入基片，并旋转样本盒,使样本进入到样本盒凹槽中。旋转样本盒的目的有两个：(1)在卡扣或螺纹作用下，样本盒旋转后能与基片贴合紧密；(2)样本盒的底部为样本盒密封层，样本盒插入基片时，凸起可以穿透样本盒密封层，当旋转样本盒时，凸起可扩大穿透面积，增加后续试剂混合效果。步骤b2，样本前处理。使用外部仪器挤压泡罩，向样本盒凹槽内加入裂解液；加热2-20分钟,加热温度为50-100℃；同时仪器驱动搅拌子旋转,转速为100-3000rpm。此步骤的目的是(1)将复杂样本液化；(2)裂解样本，释放样本中的核酸。临床上的复杂样本包括痰液、组织、粪便等固液混合态样本，这些样本的前处理是一个难点，因为需要使用多种作用原理。使用的作用原理有：(1)化学裂解液的氧化还原作用，化学裂解液包括胍盐，所述胍盐包括异硫氰酸胍；(2)热裂解作用；(3)搅拌子旋转的机械剪切作用；(4)酶的生物降解作用。这些原理及对应操作不是必须全部具备的，根据实际样本配置即可。步骤b3，定量样本。外部仪器的泵推动100-5000ul的裂解后样本通过过滤膜，进入吸附池。此步骤的目的是：定量裂解后样本，以确定在最后步骤中的检测浓度。步骤b4，核酸吸附。外部仪器挤压泡罩，向吸附池内加入乙醇，乙醇的体积与裂解后样本体积比为0.3-2，优选为1；同时外部仪器驱动搅拌子旋转，形成磁珠悬浮液，混合时间为1-10分钟。此步骤的目的是：将裂解后样本与乙醇、磁珠充分混合，保证磁珠吸附核酸。步骤b5，磁珠捕获。外部仪器的泵作用推动磁珠悬浮液进入磁珠捕获池，磁珠被仪器的磁铁捕获，不含磁珠的溶液排进废液池。此步骤中，捕获-排液为间歇式，即悬浮液进入捕获池后会停止流动，待磁珠被捕获在池底后，再流动排出捕获池。这种间歇式比缓慢流动式效果好，磁珠捕获效率高、仪器控制简单。步骤b6，清洗。外部仪器挤压泡罩，向磁珠捕获池内加入清洗液a，体积为0.1-2ml，同时驱动小搅拌子旋转，时间0.1-10分钟；外部仪器挤压泡罩，向磁珠捕获池内加入清洗液b，体积为0.1-2ml，同时驱动小搅拌子旋转，时间0.1-10分钟；外部仪器挤压泡罩，向磁珠捕获池内加入清洗液c，体积为0.2-4ml，时间0.1-10分钟。此步骤的目的是：(1)去除细胞、蛋白等杂质；(2)去除乙醇。步骤b7，核酸洗脱。外部仪器挤压泡罩，向磁珠捕获池内加入洗脱液，体积为0.05-1ml，同时驱动小搅拌子旋转，同时加热0.1-10分钟。所述加热的温度为50-100℃。此步骤的目的是将磁珠上的核酸洗脱下来，加热和搅拌混合都是为了提高洗脱效率。步骤b8，一级核酸扩增反应。外部仪器的泵推动洗脱液进入一级扩增池，与池内的固态试剂混合，在外部仪器控制下进行核酸扩增反应。所述核酸扩增反应是聚合酶链式反应(pcr)、链替代扩增(sda)、连接酶链式反应(lcr)等。步骤b9，称量。外部仪器的泵推动一级扩增池内的一级核酸扩增产物进入称量池，获得所需体积的一级核酸扩增产物。所述所需体积为0.001-1ml；所述所需体积为称量池的体积。此步骤中，称量原理为：一级核酸扩增产物的部分试剂被疏水透气介质阻挡，只有所需试剂被保留在称量腔内，其余试剂仍在前面的反应池或通道内；当旋转阀切换流路后，再用其他试剂或空气将称量腔内试剂推入后续反应池。步骤b10，一级扩增产物稀释与混合。外部仪器的泵推动稀释液进入称量腔，稀释液的体积与称量的所需体积呈一定稀释比例，稀释液与称量腔内试剂一起进入二级扩增预混合池；这些试剂与二级扩增预混合池内的固态试剂混合，形成混合液。所述一定稀释比例为1-400，优选为10-200；所述稀释液可以是洗脱液。此步骤的目的是：将一级扩增产物稀释，准备进行二级扩增反应。步骤b11，二级核酸扩增反应。外部仪器的泵推动上述混合液进入薄膜式扩增芯片，在配套仪器控制下进行二级核酸扩增反应。步骤b12，检测分析。检测仪器检测薄膜式扩增芯片，得到不同种类指标的阴阳性、浓度等检测数据。本发明使用两级核酸扩增反应，目的是：一级核酸扩增反应是利用通用引物扩增待检测核酸片段，提高检测灵敏度；二级核酸扩增反应是利用特异性引物扩增不同种类核酸片段，特异性地检测不同目的指标。以上步骤可以根据样本种类、检测目的进行调整。例如取消步骤b9-b12，只进行一级核酸扩增反应与检测；例如对于血液等简单样本，可以取消步骤b3；例如可以取消步骤b4，可以进行定性检测；例如对于血液等简单样本，步骤b6中可以只清洗一次。采用实施例3全集成核酸检测微流控芯片及其使用方法，完全符合临床医院的使用需求：1、适合各种临床样本。临床上的简单样本包括鼻咽拭子、尿液、血液；复杂样本包括痰液、组织、粪便等固液混合态样本。本发明利用多种液化裂解原理，能快速前处理临床样本，高效提取核酸。2、全自动。这种全集成核酸检测微流控芯片集成了所有核酸检测相关流程，并包含配套试剂，真正实现了样本进-结果出(sample-in,answer-out)，自动化程度很高。3、安全密闭。这种全集成核酸检测微流控芯片密闭性强，在使用中不与外部空气直接连通，能避免假阳性结果，并保证检验人员健康。4、适合批量制造。这种全集成核酸检测微流控芯片采用塑料部件或金属材料，加工工艺采用注塑、胶粘等医疗器械行业常用工艺，容易批量生产，降低了产品价格、减少了患者负担。实施例4在实施例3的基础上，进一步的，样本盒、盖片、基片、底片的主体结构均通过注塑成型，材质为环烯烃类共聚物；泡罩通过冲压成型；薄膜式扩增芯片通过冲切成型；盖片厚度为2mm，底片厚度为0.2mm，盖片与基片、底片的封接方式为激光焊接。进一步的，盒盖、盒壳为同种材质，均是环烯烃类共聚物；样本盒密封层是聚碳酸酯薄膜，通过化学双面胶方式与盒壳结合。盒壳的上端有螺纹口设计，可与盒盖相配合。盒壳的下端有卡扣设计，可与基片或上盖相配合。样本盒内有磁力搅拌子，搅拌子为长条形，直径5mm，长度10mm。样本盒内有冻干的蛋白酶k，购自德国merck公司。进一步的，所述凸起的尺寸为3*5*3mm，与基片一体成型；所述过滤膜为0.45um孔径的混合纤维素过滤膜，所述过滤膜通过化学双面胶粘接的方式与与盒壳结合。进一步的，所述样本盒凹槽内有卡扣，与样本盒的盒壳相配合。所述样本盒的凹槽内有密封环，材质为硅橡胶，内径15mm，外径20mm。进一步的，所述吸附池内有磁珠，用于吸附dna，磁珠与固定剂混合后固定在吸附池底部，磁珠购自德国merck公司。所述吸附池内有磁力搅拌子，搅拌子为为橄榄形。进一步的，所述磁珠捕获池体积为300ul，高度为3mm。进一步的，所述称量腔体积为10ul；称量腔的顶端为疏水透气膜，为0.22um孔径的聚四氟乙烯膜，膜通过化学双面胶粘接的方式与基片结合。进一步的，所述一级扩增池体积为100ul，高度为0.2mm，位于基片的底部，贴近外部仪器的温控模块。所述一级扩增池内有冻干的taq酶、通用引物、反应试剂，这些试剂与固定剂混合后固定在池底部。其中，taq酶是从水生栖热菌thermusaquaticus(taq)中分离出的具有热稳定性的dna聚合酶。进一步的，所述二级扩增预混合池体积为280ul，高度为2.8mm，位于基片的上部。所述二级扩增预混合池内有冻干的taq酶、反应试剂，与固定剂混合后固定在池底部。进一步的，所述薄膜式扩增芯片内有引物，与固定剂混合后固定在薄膜式扩增芯片内部。进一步的，所述泵接口包含接口密封层、防污染滤膜。所述接口密封层为硅橡胶，厚度为0.2mm；所述防污染滤膜材质为聚丙烯，厚度为0.5mm。进一步的，所述泡罩内储存有液态试剂，包含六种试剂，具体为清洗液a、清洗液b、清洗液c、洗脱液、乙醇和裂解液。所示底片上无结构，所述底片与外部仪器贴近。在上述的基础上，一种全集成核酸检测微流控芯片的使用方法，包括了步骤c1-c12。步骤c1，样本准备。用户将样本加入样本盒中，扣紧盒盖,将样本盒插入基片，并旋转样本盒,使样本进入到样本盒凹槽中，此时配套仪器检测样本体积，体积为4ml。步骤c2，样本前处理。使用外部仪器挤压泡罩，向样本盒凹槽内加入裂解液，体积为4ml，裂解液成分为盐酸胍，浓度为2m；外部仪器驱动搅拌子旋转，转速为1800rpm；外部仪器控制温度为52℃，保持5分钟，之后升温至90℃，保持5分钟。步骤c3，定量样本。外部仪器的泵推动2ml的裂解后样本通过过滤膜，进入吸附池。步骤c4，核酸吸附。外部仪器挤压泡罩，向吸附池内加入2ml乙醇，乙醇的体积与裂解后样本体积比为1；同时外部仪器驱动搅拌子旋转，形成磁珠悬浮液，混合时间为2分钟。步骤c5，磁珠捕获。外部仪器的泵作用推动磁珠悬浮液进入磁珠捕获池，磁珠被仪器的磁铁捕获，不含磁珠的溶液排进废液池,此步骤需要3分钟。步骤c6，清洗。外部仪器挤压泡罩，向磁珠捕获池内加入清洗液a，体积为1ml，同时驱动小搅拌子旋转，时间1分钟；外部仪器挤压泡罩，向磁珠捕获池内加入清洗液b，体积为1ml，同时驱动小搅拌子旋转，时间1分钟；外部仪器挤压泡罩，向磁珠捕获池内加入清洗液c，体积为0.5ml，时间0.5分钟。步骤c7，核酸洗脱。外部仪器挤压泡罩，向磁珠捕获池内加入洗脱液100ul，同时驱动小搅拌子旋转，同时加热5分钟。所述加热的温度为65℃。步骤c8，一级核酸扩增反应。外部仪器的泵推动推动100ul洗脱液进入一级扩增池，与池内的固态试剂混合，在外部仪器控制下进行核酸扩增反应，扩增参数为：变性95℃40s，退火42℃30s，延伸72℃60s，进行15个循环。步骤c9，称量。外部仪器的泵推动一级扩增池内试剂进入称量池，获得10ul体积的一级核酸扩增产物。步骤c10，一级扩增产物稀释与混合。外部仪器的泵推动270ul洗脱液进入称量腔，洗脱液的体积与称量的所需体积比例为27:1，即稀释比例为28倍，洗脱液与称量腔内试剂一起进入二级扩增预混合池，与二级扩增预混合池内的固态试剂混合，形成混合液。步骤c11，二级核酸扩增反应。外部仪器的泵推动混合液进入薄膜式扩增芯片，在配套仪器控制下进行二级核酸扩增反应。扩增参数为：变性95℃60s，退火45℃30s，延伸72℃60s，进行30个循环。薄膜式扩增芯片可同时检测金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌、艰难梭菌、布鲁氏菌、阪崎肠杆菌六种细菌。步骤c12，检测分析。检测仪器检测薄膜式扩增芯片，得到不同种类指标的阴阳线、浓度等检测数据。根据软件内预置的标准浓度曲线，对比得到金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌、艰难梭菌、布鲁氏菌、阪崎肠杆菌六种细菌的浓度。所述检测仪器为实时荧光pcr核酸扩增仪，实时荧光定量pcr(real-timequantitativepcr)技术是在pcr反应体系中加热特异性的荧光染料或探针，荧光信号的变化真实地反映了体系中模板的增加，通过检测荧光信号达到定量的目的。采用实施例4的全集成核酸检测微流控芯片及其使用方法，测得的检测结果如下表所示：表1细菌的浓度结果菌种指标阴阳性浓度cfu/ml金黄色葡萄球菌阳性100沙门氏菌阳性1000艰难梭菌阴性-布鲁氏菌阴性-阪崎肠杆菌阴性-大肠杆菌阴性-实施例4的技术方案，是根据实际核酸检测需要配置的，其优选了价格低廉、耐腐蚀的材料，其包含了试剂核酸检测所需的全部试剂，采用上述的技术方案，可以对复杂样本进行集成处理，提高检测效率。上述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。当前第1页12