一种一步法提取质粒DNA的试剂盒和方法与流程

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种一步法提取质粒dna的试剂盒和方法。

背景技术：

质粒dna是基因工程最常见的运载体，也正逐渐成为基因治疗研究中最重要的基因传递系统，它可以把目的dna片段通过重组dna技术，送进受体细胞中并进行繁殖和表达。质粒dna的提取和纯化是分子生物学的基本步骤之一，涉及基因克隆、基因序列分析、核酸疫苗、基因治疗和各种基因重组等领域，其提取的效率和质量对后续分子生物学实验(酶切、pcr扩增和测序等)的成败有密切的、直接的关系。

研究发现，所提取的质粒一般有超螺旋、线形和开环(双链环状的质粒dna有部分解链所形成)三种构象。进行琼脂糖凝胶电泳实验时三种构象的质粒电泳速度为超螺旋质粒>线形质粒>开环质粒，以超螺旋质粒电泳速度最快，线形质粒在中间，而开环质粒在最后。更重要的是，在用质粒转染真核细胞时，超螺旋质粒的转染效率最高，所以质粒提取中要求超螺旋质粒含量要在90％以上，这也是对作为核酸疫苗重组质粒的要求，超螺旋质粒的含量是判断质粒提取好坏的一个重要指标。

从原核生物中提取和纯化质粒dna的经典方法，步骤依次为：菌体裂解、质粒分离和纯化。配套方法的，目前国内外很多生物试剂公司如碧云天、生工、天根等都研制推出了质粒提取的试剂盒，这些试剂盒以碱裂解结合纯化柱来分离提取质粒，利用质粒与硅胶纯化柱的吸附作用纯化质粒。其中的菌体裂解步骤，多采用碱裂解法，碱裂解法质粒dna纯化技术是1979年由birnboim&doly发明，其操作包括三种溶液处理，需要第一步悬浮菌体，第二步碱和sds变性裂解和第三步质粒复性，然后才能上离心柱，提取过程一般需要20分钟左右的时间，实验周期相对较长，且超螺旋质粒含量低，影响了研究者的实验进程；德国eppendorf公司发明一步法质粒提取法，基于溶菌酶裂解细菌，使用含有溶菌酶和去污剂的裂解液裂解细胞，裂解产物澄清无粘性，裂解后可直接与过滤膜结合，然后通过快速离心的清洗和洗脱得到超螺旋的质粒dna。该提取方法虽然方便，快捷和重复性好，但不适合于低拷贝质粒的提取和丰富培养基培养大肠杆菌质粒的提取，而大肠杆菌质粒又是目前常用的质粒之一，因此，该方法的应用具有较大的局限性。

可见，目前提取质粒的方法即产品，存在多方面的诸多不足，如提取效率低，周期长，影响实验进程；局限性较强，不具有普适性等，研究开发普适性好、高效、可靠的提取试剂及方法对质粒提取、基因工程具有重要意义。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种一步法提取质粒dna的试剂盒和方法，用以解决现有质粒dna提取实验周期长、提取物中超螺旋质粒含量低、成本高、局限性大的技术问题。本发明基于溶菌酶、rnasea法，并采用独特的快速裂解缓冲液，实现了一步法裂解菌体即上柱，将质粒提取周期缩短到5min，且超螺旋质粒含量在90％以上，提高了实验效率，为后续实验提供了高质量的质粒，具有高效、快速、简洁的特点。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是，一种一步法提取质粒dna的试剂盒，包括裂解试剂、漂洗液和洗脱缓冲液，所述裂解试剂中包括溶菌酶、rnasea和裂解缓冲液。

进一步的，所述裂解缓冲液的组成是：每100ml中包括月桂酰基丙基甜菜碱5～10g、氯化钙1～2.5g、二甲基亚砜1～5g、甘油1～2.5g、3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐1～2.5g、三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐1-2.5g、三羟甲基氨基甲烷1～2.5g、盐酸胍1～3.5g、异硫氰酸胍1～2.5g、尿素5-10g、乙二胺四乙酸二钠1～2.5g，其余为水。

优选的，所述裂解缓冲液的组成是：每100ml中包括月桂酰基丙基甜菜碱10g、氯化钙1.1g、二甲基亚砜2.5g、甘油1g、3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐1.25g、三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐1.36g、三羟甲基氨基甲烷1.65g、盐酸胍2.39g、异硫氰酸胍1.18g、尿素6g、乙二胺四乙酸二钠1.86g，其余为水。

进一步的，所述裂解缓冲液在使用前按照裂解缓冲液：溶菌酶冻干粉：10mg/ml的rnasea为100ml：250:350mg：1.5-2.5ml的比例混合，形成裂解试剂。

优选的，所述裂解缓冲液：溶菌酶冻干粉：10mg/ml的rnasea为100ml：300mg：2ml。

更优选的，所述试剂盒中还包括硅基质膜吸附柱。

本发明还提供一种一步法提取质粒dna的方法，所述方法包括以下步骤：

①质粒的扩增：取1～2ml过夜培养的大肠杆菌菌液以10000-13000r/min离心1min，弃上清，得菌体沉淀物；

②菌体裂解：向菌体沉淀物中加入400-600μl预冷的裂解试剂，所述裂解试剂中包括溶菌酶、rnasea和裂解缓冲液，涡旋振荡20-50s至菌体沉淀物完全溶解，得菌体裂解物；

③质粒dna的纯化。

进一步的，所述步骤②中裂解缓冲液的组成是：每100ml中包括月桂酰基丙基甜菜碱5～10g、氯化钙1～2.5g、二甲基亚砜1～5g、甘油1～2.5g、3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐1～2.5g、三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐1-2.5g、三羟甲基氨基甲烷1～2.5g、盐酸胍1～3.5g、异硫氰酸胍1～2.5g、尿素5-10g、乙二胺四乙酸二钠1～2.5g，其余为水。

进一步的，所述步骤②裂解试剂的配制方法是：使用前按照裂解缓冲液：溶菌酶冻干粉：10mg/ml的rnasea为100ml：250:350mg：1.5-2.5ml的比例混合均匀所形成。

进一步的，所述步骤③质粒dna的纯化方法是：将菌体裂解物转入硅基质膜吸附柱中，以10000-13000r/min离心吸附20s-1min，弃废液；再向硅基质膜吸附柱中加入200-400μl漂洗液，以10000-13000r/min脱盐离心20-50s，弃废液；加入50～100μl洗脱缓冲液，10000-13000r/min洗脱离心20-50s，得到质粒dna溶液。

上述技术方案中，提供一种一步法提取质粒dna的试剂盒和方法，试剂盒和方法是基于溶菌酶、rnasea和裂解缓冲液提取质粒dna，试剂盒中包括裂解试剂、漂洗液和洗脱缓冲液，关键在于，所述的裂解试剂中包括溶菌酶、rnasea和裂解缓冲液。溶菌酶在室温下可部分破坏大肠杆菌细胞壁中的n-乙酰胞壁酸和n-乙酰氨基葡糖之间的β-1,4糖苷键，rnasea可去除大部分rna，结合本发明独特的裂解缓冲液，一方面保证了溶菌酶和rnasea活性的充分发挥，提高了裂解效率，另一方面可以使质粒dna与蛋白质充分分离并快速从大肠杆菌细胞中释放出来，同时还能提高质粒dna与离心吸附柱的结合效率，溶菌酶、rnasea及裂解缓冲液混合后，在裂解缓冲液的协同作用下，整个质粒dna提取过程由传统的20min缩短到5min左右，大大节省了实验研究者的时间，提高了实验效率，同时超螺旋质粒dna含量在90％以上，为后续实验的成功提高了可靠保证。

本发明方法具有如下优点：(1)本发明独特的裂解缓冲液能协同增效溶菌酶、rnasea，实现快速高效分离质粒与蛋白，并从大肠杆菌中释放，同时破裂细胞壁，实现高效快速去除杂质，大大提高了裂解效率，提高了提取效率。(2)整个质粒dna提取过程仅5min左右，大大节省了实验研究者的时间，提高了实验效率，同时超螺旋质粒dna含量在90％以上，为后续实验的成功提高了可靠保证。

附图说明

图1为实施例1中提取高拷贝质粒pbs的电泳检测图，图中泳道1为脱氧核糖核酸分子量标准(markerⅳ)，泳道2-5为使用本发明方法纯化的质粒dna。

图2为实施例2中提取低拷贝质粒pbr322的电泳检测图，图中泳道1为脱氧核糖核酸分子量标准(markerⅳ)，泳道2-5为使用本发明方法纯化的质粒dna。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围，实施例中涉及的试剂，如无特殊说明，可从商业途径获得，所涉及的操作，如无特殊说明，均为常规操作。

实验试剂的配制：

(1)裂解缓冲液的配制：

称取或量取月桂酰基丙基甜菜碱5～10g，氯化钙1～2.5g、二甲基亚枫1～5ml、甘油1～2.5ml、3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐1～2.5g、三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐1～2.5g、三羟甲基氨基甲烷1～2.5g、盐酸胍1～2.5g、异硫氰酸胍1～2.5g、尿素5～10g和乙二胺四乙酸二钠1～2.5g，加去离子水定容至100ml，搅拌均匀，即为试验用裂解缓冲液。

示例性或优选的，上述裂解缓冲液组成是：每100ml中包括月桂酰基丙基甜菜碱10g、氯化钙1.1g、二甲基亚砜2.5g、甘油1g、3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐1.25g、三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐1.36g、三羟甲基氨基甲烷1.65g、盐酸胍2.39g、异硫氰酸胍1.18g、尿素6g、乙二胺四乙酸二钠1.86g，其余为水。裂解缓冲液的组成中，月桂酰基丙基甜菜碱和氯化钙可以增加细菌细胞的通透性，使质粒更容易从细菌释放出来。二甲基亚砜和甘油可以对大肠杆菌细胞起到一定保护作用，减少细胞破裂所引起的基因组释放对质粒提取的干扰。3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐是一种非变性两性离子去垢剂，蛋白质裂解液，主要用于溶解膜蛋白，可以促使质粒释放出来。三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐和三羟甲基氨基甲烷构成裂解所用缓冲体系，低浓度盐酸胍，异硫氰酸胍和尿素为离液剂和强变性剂，联合进行大肠杆菌细胞快速裂解，同时为核酸与吸附膜提供结合条件。乙二胺四乙酸二钠可以螯和二价金属离子，从而抑制核酸酶对和dna的降解。

裂解缓冲液在使用前加入300mg溶菌酶冻干粉和2毫升10mg/ml的rnasea，形成裂解试剂。

(2)漂洗液组成：终浓度为20mmtris和200mmnacl的水溶液(ph8.5)；

(3)洗脱缓冲液组成：10mmtris(ph8)缓冲液。

实施例1从大肠杆菌培养物中提取高拷贝质粒pbs

①质粒的扩增：取1.5ml以lb培养基过夜培养的大肠杆菌菌液，以12000r/min离心1min，弃上清，得菌体沉淀物；

②菌体裂解：向菌体沉淀物中加入500μl预冷的裂解试剂，涡旋振荡30s至菌体沉淀物完全溶解，得菌体裂解物；

③质粒dna的纯化：将步骤②中的菌体裂解物室温放置2分钟后转入硅基质膜吸附柱中，以12000r/min离心吸附30s，弃废液；再向硅基质膜吸附柱中加入300μl漂洗液，以12000r/min脱盐离心30s，弃废液；最后再向硅基质膜吸附柱中加入80μl洗脱缓冲液，12000r/min洗脱离心30s，得到质粒dna溶液。

将所得到的质粒dna进行凝胶电泳检测，结果见附图1，其中泳道1对应的样品为脱氧核糖核酸分子量标准(markerⅳ)，泳道2-5对应的样品为上述以本发明的试剂盒和方法提取的质粒dna，从结果图可见，本发明提取的质粒dna含量高、纯度高、无杂质，最值得注意的是，本发明的方法及试剂盒从大肠杆菌培养物中提取高拷贝质粒pbs的总过程仅耗时5min，大大节省了实验者的时间，提高了实验效率。

实施例2从大肠杆菌培养物中提取高拷贝质粒pbs

①质粒的扩增：取1.5ml以mug培养基培养基过夜培养的大肠杆菌菌液，以12000r/min离心1min，弃上清，得菌体沉淀物；

②菌体裂解：向菌体沉淀物中加入500μl预冷的裂解试剂，涡旋振荡30s至菌体沉淀物完全溶解，得菌体裂解物；

③质粒dna的纯化：将步骤②中的菌体裂解物室温放置2分钟后转入硅基质膜吸附柱中，以12000r/min离心吸附30s，弃废液；再向硅基质膜吸附柱中加入300μl漂洗液，以12000r/min脱盐离心30s，弃废液；最后再向硅基质膜吸附柱中加入80μl洗脱缓冲液，12000r/min洗脱离心30s，得到质粒dna溶液。

将所得到的质粒dna进行凝胶电泳检测，结果发现，本发明提取的质粒dna含量高、无杂质，5min即可快速高效的从大肠杆菌培养物中提取高拷贝质粒pbs，实验效率。

实施例3从大肠杆菌培养物中提取低拷贝质粒pbr322

①质粒的扩增：取1ml以lb培养基过夜培养的大肠杆菌菌液，以12000r/min离心1min，弃上清，得菌体沉淀物；

②菌体裂解：向菌体沉淀物中加入500μl预冷的裂解试剂，涡旋振荡30s至菌体沉淀物完全溶解，得菌体裂解物；

③质粒dna的纯化：将步骤②中的菌体裂解物室温放置2分钟后转入硅基质膜吸附柱中，以12000r/min离心吸附30s，弃废液；再向硅基质膜吸附柱中加入300μl漂洗液，以12000r/min脱盐离心30s，弃废液；最后再向硅基质膜吸附柱中加入80μl洗脱缓冲液，12000r/min洗脱离心30s，得到质粒dna溶液。

将实施例3所得到的质粒dna进行凝胶电泳检测，结果见附图2，其中泳道1对应的样品为脱氧核糖核酸分子量标准(markerⅳ)，泳道2-5对应的样品为实施例3以本发明的试剂盒和方法提取的质粒dna，可见，本发明提取的质粒dna含量高、无杂质，从大肠杆菌培养物中提取低拷贝质粒pbr322的总过程仅耗时5min，大大节省了实验者的时间，提高了实验效率。

实施例4从大肠杆菌培养物中提取低拷贝质粒pbr322

①质粒的扩增：取1ml以mug培养基过夜培养的大肠杆菌菌液，以12000r/min离心1min，弃上清，得菌体沉淀物；

②菌体裂解：向菌体沉淀物中加入500μl预冷的裂解试剂，涡旋振荡30s至菌体沉淀物完全溶解，得菌体裂解物；

③质粒dna的纯化：将步骤②中的菌体裂解物室温放置2分钟后转入硅基质膜吸附柱中，以12000r/min离心吸附30s，弃废液；再向硅基质膜吸附柱中加入300μl漂洗液，以12000r/min脱盐离心30s，弃废液；最后再向硅基质膜吸附柱中加入80μl洗脱缓冲液，12000r/min洗脱离心30s，得到质粒dna溶液。

将实施例4所得到的质粒dna进行凝胶电泳检测，结果发现本发明提取的质粒dna含量高、无杂质。

本发明不仅能用于高拷贝和低拷贝质粒的提取，也适用于不同培养基培养大肠杆菌质粒的提取，提取质粒的成功率比目前常规方法提高25-50％，更重要的是大大节省了实验研究者的时间，提高了实验效率。纯化的质粒dna纯度大大提高，可适用于各种常规操作，包括酶切、pcr、测序、连接、转化、文库筛选、体外翻译、转染一些常规的传代细胞等。本发明与德国eppendorf公司一步法质粒提取相比，通过优化快速裂解缓冲液，增加了大肠杆菌细胞的通透性，使质粒更易释放，尤其是低拷贝质粒。同时快速裂解缓冲液增加了质粒与吸附膜的结合效率，从而提高了低拷贝质粒得率，且纯度更高。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。