本发明属于低聚果糖制备
技术领域：
，具体涉及利用介孔二氧化硅载体固定化内切菊粉酶的方法。
背景技术：
：目前，源于菊粉的低聚果糖，作为一种功能糖，广泛应用于医药保健业、食品工业等领域。低聚果糖能够促进双歧杆菌的增殖、低致龋性、难消化性及类似膳食纤维等作用，现已成为一种具有独特生理活性的食物配料。低聚果糖是一般由菊粉，经内切菊粉酶生物降解后制备而成。因此，内切菊粉酶是制备低聚果糖的核心与关键，直接影响低聚果糖的产品品质。内切菊粉酶，作为一种关键的低聚果糖生产的生物助剂，是能够水解β-2，1-d-果糖苷键的一类酶，学名为β-2，1-d-果聚糖酶。菊粉可通过菊粉酶降解的方法制备得到果糖和低聚果糖。菊粉酶是一类催化菊糖水解的复合酶类，由内切菊粉酶与外切菊粉酶组成。菊粉是在菊粉酶系中内切菊粉酶和外切菊粉酶的协同作用下被彻底降解成单糖的。而菊粉酶水解菊粉制备低聚果糖的机理是菊粉多糖在内切酶的作用下主要形成低聚果糖。菊粉酶的来源很广，其中微生物来源的菊粉酶种类多，热稳定性好，适于发酵生产。近年来，科研人员致力于筛选和构建新的产酶菌种，对现有菌种进行改造，采用先进的发酵产酶技术，以及对酶分子的修饰，以获取高酶活、热稳定性好的工业生产低聚果糖用生物助剂。纳米尺度的材料由于具有特殊的表面效应、体积效应、量子尺寸效应和宏观量子隧道效应等，在声、光、电、磁、热性能方面呈现了新的特性，在全球范围引起了科学产业的极大关注。与传统大尺寸材料相比，纳米材料还具有大比表面积、表面易于修饰、与酶分子尺寸相近等优点，作为一种新型的酶固定化载体在生物
技术领域：
得到了广泛的关注。纳米复合材料是由不同性能的纳米材料复合而成，可以有效解决单一纳米材料固定化酶所面临的问题，在保持酶活和增强酶的稳定性等方面有较为突出的表现。技术实现要素：本发明要解决的技术问题是提供一种利用介孔二氧化硅载体固定化内切菊粉酶的方法，以改善现有技术中固定化菊粉酶使用批次少、酶活低的缺点。为解决以上技术问题，本发明采用如下技术方案：一种利用介孔二氧化硅载体固定化内切菊粉酶的方法，包括如下步骤：(1)取p1232～5g于反应器中，加入水10～50ml、浓盐酸10～15ml，搅拌至澄清，再滴加正硅酸乙酯10～30g，搅拌10～24h，在反应釜中结晶，得到介孔二氧化硅；(2)取步骤(1)得到的介孔二氧化硅1～10g、aptes5～20ml、甲苯100～150ml，在50～100℃下反应10～24h，过滤，用乙醇洗涤，干燥，得到氨基修饰的介孔二氧化硅载体；(3)将步骤(2)得到的氨基修饰的介孔二氧化硅载体加入戊二醛水溶液中，反应3～10h，过滤，用水洗涤滤出物，再将滤出物加入内切菊粉酶溶液中，在30～40℃条件下反应8h，抽滤，得到固定化内切菊粉酶。p123是指一种三嵌段共聚物，全称为：聚环氧乙烷-聚环氧丙烷-聚环氧乙烷三嵌段共聚物，其分子式为：peo-ppo-peo。aptes是指3-氨丙基三乙氧基硅烷。步骤(3)中，所述的戊二醛水溶液中戊二醛的体积浓度为2％～4％，优选3％。步骤(3)中，所述内切菊粉酶溶液为溶解有内切菊粉酶、ph为6～8的磷酸缓冲液，优选ph6.5～7.5。其中，所述内切菊粉酶溶液中，内切菊粉酶的浓度为0.5～5mg/l，优选1.5～3mg/l。上述利用介孔二氧化硅载体固定化内切菊粉酶的方法制备得到的固定化内切菊粉酶在本发明的保护范围之内。上述固定化内切菊粉酶在制备低聚果糖中的应用在本发明的保护范围之内。有益效果：本发明公开了一种利用介孔二氧化硅载体固定化内切菊粉酶的方法，得到的固定化内切菊粉酶具有稳定性好、酶活高的特点。具体实施方式根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。本发明中使用的内切菊粉酶购自上海晶都生物技术有限公司。实施例1：介孔二氧化硅的制备。取p1232～5g于反应器中，加入水10～50ml、浓盐酸10～15ml，搅拌至澄清，再滴加正硅酸乙酯10～30g，搅拌10～24h，在反应釜中结晶，得到介孔二氧化硅。实施例2：氨基修饰的介孔二氧化硅载体的制备取介孔二氧化硅1～10g、aptes5～20ml、甲苯100～150ml，在50～100℃下反应10～24h，过滤，用乙醇洗涤，干燥，得到氨基修饰的介孔二氧化硅载体。实施例3：内切菊粉酶的固定化。将氨基修饰的介孔二氧化硅载体加入戊二醛水溶液中，反应3～10h，过滤，用水洗涤滤出物，再将滤出物加入内切菊粉酶溶液中，在30～40℃条件下反应8h，抽滤，得到固定化内切菊粉酶。实施例4：戊二醛浓度对固定化菊粉酶的酶活影响。固定化载体制备和固定化方法参考实施例1～3，所不同的是，在固定化酶时，戊二醛体积浓度为0、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％。表1戊二醛浓度对固定化菊粉酶的酶活影响戊二醛浓度(ml/ml)固定化内切菊粉酶酶活(u/g)02130.0052550.012870.023550.033690.043280.05284实施例5：固定化时间对固定化内切菊粉酶的酶活影响。固定化载体制备和固定化方法参考实施例1～3，所不同的是，在固定化酶时，固定化时间为1h、2h、4h、8h、10h、12h。表2固定化时间对固定化内切菊粉酶的酶活影响固定化时间(h)固定化内切菊粉酶酶活(u/g)12642289435683911036312355实施例6：内切菊粉酶浓度对固定化内切菊粉酶的酶活影响。固定化载体制备和固定化方法参考实施例1～3，所不同的是，在固定化酶时，0.5mg/l、1mg/l、2mg/l、3mg/l、4mg/l、5mg/l。表3内切菊粉酶浓度对固定化内切菊粉酶的酶活影响内切菊粉酶浓度mg/l固定化内切菊粉酶酶活(u/g)0.527112842331336742665253综上，按照最优的方法得到的固定化内切菊粉酶的酶活是391u/g，酶活回收率是85％。实施例7：固定化内切菊粉酶催化制备低聚果糖。固定化内切菊粉酶6g，置于菊粉浓度为50g/l的磷酸缓冲液中，在30℃下催化6～12h，检测反应液中菊粉水解率为100％，水解液中低聚果糖的种类分布如下：当前第1页12