用于解析多环芳烃污染场地微生物群落结构的土壤DNA提取方法与流程

本发明属于土壤微生物分子生态学技术领域，具体涉及一种用于解析多环芳烃污染场地微生物群落结构的土壤dna提取方法。

背景技术：

在我国迅速推进工业化的过程中，由于人们环保意识的缺乏导致我们赖以生存的环境受到严重的破坏，土壤作为人类赖以生息的自然资源也未能幸免，土壤环境污染问题越来越尖锐。其中，具有强烈致癌、致畸、致突变作用的多环芳烃(polycyclicaromatichydrocarbons,多环芳烃)污染现象十分普遍。以煤炭为主要原料进行生产活动的煤化工企业及炼焦企业是土壤受多环芳烃污染的重要因素之一，越来越多曾从事过类似生产活动的场地已被诊断为多环芳烃重污染场地。近年来的研究结果表明，多环芳烃是我国焦化类污染场地土壤中最为典型的有机污染物，土壤中多环芳烃的总含量超过1％。例如，北京某焦化厂原厂址土壤中16种多环芳烃总含量的最大检出浓度为14363.7mg/kg，平均浓度为190.4mg/kg；其中，苯并(a)芘最大检出量比北京市《场地土壤环境风险评价筛选值》超标430倍，最终确定的多环芳烃污染土壤待修复体积巨大。

对土壤环境中多环芳烃污染的控制和治理，目前的研究绝大多数集中在实验室大量的批试验研究，主要还基于实验室富集、筛选、纯培养的基础之上，而对于实地污染场地环境中的微生物活性及群落结构的研究还非常有限。由于微生物的群落结构与其功能具有复杂的对应关系，特定的群落结构决定了其特定的功能，因此，利用现代分子生物学技术查明多环芳烃污染场地环境中的微生物群落结构，并利用一些手段维持微生物群落的结构和降解活性，从而为高效、稳定地生物降解污染场地中多环芳烃污染提供必要的生物学依据和重要的理论指导。

传统的纯培养方法虽然可以检测环境中的活菌，但是越来越多的研究表明环境样品中的绝大部分微生物是不能在实验室被分离和纯培养的。然而，把分子生物学技术运用在土壤微生物生态学的研究中，使人们可以避开传统的分离培养过程，通过dna水平上的研究，直接探讨土壤微生物的群落结构及其与环境的关系，即一门新的学科—土壤微生物分子生态学。由于绝大多数分子生物学方法都是以提取研究对象的微生物基因组总dna为前提，从环境样品中高效抽提和纯化基因组总dna是研究微生物群落结构及其多样性的最为基础、最为关键的技术问题之一，因此建立一种快速、灵敏、稳定的环境样品基因组总dna的提取方法具有重要现实意义。

获得高质量的土壤微生物基因组总dna是土壤微生物分子生态学最为关键的步骤之一。来自环境中的样品含有非常复杂的成分，尤其是土壤中的腐殖酸类物质在提取过程中很难去除，直接影响后续的pcr扩增。目前已报道的从不同环境样品中提取微生物基因组总dna的方法，都存在着一定的局限性。且由于遭受多环芳烃污染的环境中土壤微生物数量和种类要远远低于健康的土壤；因此从多环芳烃污染场地中土壤样品中进行微生物基因组总dna的提取方法的探索就显得十分必要，这对于从微生物分子生态学角度更深层次的研究环境土壤微生物与环境污染的关系，从而指导环境污染环境的生物修复提供了基础和可能性。

技术实现要素：

针对现有技术中的不足，本发明的目的在于提供用于解析多环芳烃污染场地微生物群落结构的土壤dna提取方法。

为了实现上述目的，本发明采取的技术方案是：

用于解析多环芳烃污染场地微生物群落结构的土壤dna提取方法，所述方法的具体步骤如下：

步骤一、试剂配制；

步骤二、总dna提取。

所述试剂配制具体包括如下步骤

步骤(a)β-巯基乙醇-土壤预处理缓冲液：

50mmtris，20mmedta，100mmnacl，10mg/mlpvp，ph10；

配好后再添加体积比为1.5％的β-巯基乙醇，混匀；

步骤(b)1×pbs缓冲液：

8.00gnacl，0.20gkcl，1.44gna2hpo4，0.24gkh2po4，溶于1l灭菌的三蒸水，ph7.4；

步骤(c)dna提取缓冲液：

100mmtris，100mmedta，200mmnacl，1％pvp，2％ctab，ph8；

步骤(d)sds缓冲液：

100mmtris，200mmnacl，10％sds，ph8.5。

所述总dna提取具体包括如下步骤：

步骤(1)准确称取0.5000g土壤样品置于15ml离心管中，加入3mlβ-巯基乙醇-土壤预处理缓冲液，涡旋15min，室温下13000×g离心8min，弃去上清。

步骤(2)在土壤沉淀中再分两次各加入3ml土壤预处理缓冲液，按步骤1相同的方法再洗涤2次，均弃去上清。

步骤(3)将土壤沉淀转移至2ml离心管中，加入1.5mlpbs缓冲液，涡旋10min，室温下10000×g离心5min，弃去上清。

步骤(4)在土壤沉淀中再分两次各加入1.5mlpbs缓冲液，按步骤3相同的方法再洗涤2次，均弃去上清。

步骤(5)在此时的土壤沉淀的2.0ml离心管中，加入0.5000g灭菌玻璃珠(直径0.1～0.2mm和0.4～0.6mm等体积的玻璃珠混合物)和1.35mldna提取缓冲液。将离心管放入sartoriusstedimbiotech公司的b.braunmikro-dismembrators机械力细胞破碎仪中，振动频率调至2500rpm，振荡30s后停顿15s，再振荡30s后再停顿15s，最后还要振荡30s。经过3次30s的振荡后，土壤样品成为均匀悬液。

步骤(6)将土壤悬液转移至新的15ml离心管中，加入2mlsds缓冲液，温和涡旋10min，65℃水浴1h，每隔15min轻轻摇动几次。

步骤(7)室温下8000×g离心20min，收集中间的液相层。

步骤(8)剩余物中再加入1mldna提取缓冲液和1mlsds缓冲液，65℃水浴8min，室温下8000×g离心20min，同样收集中间的液相层。并与步骤7的液相层合并。

步骤(9)重复步骤8一次，收集到的液相层与上两次的合并。

步骤(10)室温下13000×g离心5min，收集上清液。

步骤(11)等体积的氯仿/异戊醇(24:1,v/v)抽提1次，室温下15000×g离心30min，收集上清液。

步骤(12)加入0.1倍体积的3mnaac(ph5.20)，上下颠倒混匀后，再加入0.7倍体积的异丙醇，置于-20℃的冰箱沉淀12h。

步骤(13)4℃15000×g离心20min，一次性倒掉上清液，沉淀即为dna。

步骤(14)dna沉淀加入1ml预冷的70％乙醇洗涤，轻轻摇开dna沉淀，4℃13000×g离心10min，一次性倒掉上清液。

步骤(15)dna沉淀室温干燥5～10min，让乙醇彻底挥发。

步骤(16)用30μlte缓冲液悬浮dna沉淀，然后将得到的dna样品置于-20℃的冰箱保存；至此，用于解析多环芳烃污染场地微生物群落结构的土壤dna提取完成。

其中，优选的，所述步骤(a)中的土壤预处理缓冲液中添加了体积比为1.5％的β-巯基乙醇，之所以加入β-巯基乙醇，利用的是β-巯基乙醇的抗氧化特性，这是因为土壤中存在太多的杂质(如酚类)，这些杂质会对dna提取过程中加入的各提取试剂产生抑制作用，为了更好的保证提取的dna质量，加入了具有抗氧化作用的β-巯基乙醇。

进一步优选的，将步骤(5)优化为在土壤沉淀的2.0ml离心管中，加入0.5000g灭菌玻璃珠(直径0.1～0.2mm和0.4～0.6mm等体积的玻璃珠混合物)和1.35mldna提取缓冲液。将离心管放入sartoriusstedimbiotech公司的b.braunmikro-dismembrators机械力细胞破碎仪中，振动频率调至2500rpm，振荡30s后停顿15s，再振荡30s后再停顿15s，最后还要振荡30s。经过3次30s的振荡后，土壤样品成为均匀悬液。上述操作采用了较为温和的玻璃珠机械力破碎微生物细胞的方法，可使得土壤悬液分散的更加均匀，微生物破壁更加彻底，使得dna释放的较为充分，且不会对dna形成大的剪切力，故提取到的基因组dna完整性较好。

本方法涉及的土壤中的多环芳烃污染，是我国焦化类污染场地土壤中最为典型的有机污染物。本发明的技术方案提供了一种应用于解析多环芳烃污染场地微生物群落结构的土壤dna提取方法，属于直接裂解法，其主要是通过化学的和机械的方法直接破碎土壤中的微生物细胞而使dna得以释放。该dna提取方法法破碎微生物细胞壁的效率较高，绝大多数的微生物都能被裂解，所得dna能较为真实地代表土壤样品中微生物的组成，这对于从微生物分子生态学角度更深层次的研究环境土壤微生物与环境污染的关系，从而指导多环芳烃污染土壤环境的生物修复提供了基础和可能性。

有益效果

提取方法简单、操作方便、适用性强、安全性高。提取的土壤微生物总dna的od260/od230及od260/od280的值接近于标准值，可直接应用于后续的分子生物学操作，以进一步解析多环芳烃污染场地土壤中微生物群落结构。

附图说明

图1：提取的多环芳烃污染土壤微生物基因组总dna琼脂糖凝胶电泳结果；

图2：本提取方法总dna的16srdna通用引物pcr扩增产物的琼脂糖凝胶水平电泳结果。

图1中9泳道和10泳道是本提取方法提取的dna的2个平行样品，m泳道为λdna/handmarker-s；

图2中m泳道为d2000dnamarker；9泳道和10泳道是本提取方法得到的总dna经pcr扩增后的2个平行样品；n泳道为阴性对照。

具体实施方式

实施例1

下面结合具体实例对本发明内容作进一步的解释和说明。

本实施例方法的供试土壤为某综合性焦化厂生产企业污染场地上的土壤，该企业以煤为主要原料，从上世纪五十年代开始生产煤气、焦炭和煤化工产品，该企业其各个生产车间内化石燃料的不完全燃烧及煤气、焦炭等化工产品的加工过程都可能导致多环芳烃类物质的排放，该企业已于本世纪初停产，多环芳烃在场地土壤中已留存五十余年，是典型的多环芳烃污染土壤。

使用的试剂配制方法

(1)β-巯基乙醇-土壤预处理缓冲液：

50mmtris，20mmedta，100mmnacl，10mg/mlpvp，ph10；

配好后再添加体积比为1.5％的β-巯基乙醇，混匀；

(2)1×pbs缓冲液：

8.00gnacl，0.20gkcl，1.44gna2hpo4，0.24gkh2po4，溶于1l灭菌的三蒸水，ph7.4；

(3)dna提取缓冲液：

100mmtris，100mmedta，200mmnacl，1％pvp，2％ctab，ph8；

(4)sds缓冲液：

100mmtris，200mmnacl，10％sds，ph8.5。

总dna提取

(1)准确称取0.5000g土壤样品置于15ml离心管中，加入3ml土壤预处理缓冲液，涡旋15min，室温下13000×g离心8min，弃去上清。

(2)在土壤沉淀中再分两次各加入3ml土壤预处理缓冲液，按步骤1相同的方法再洗涤2次，均弃去上清。

(3)将土壤沉淀转移至2ml离心管中，加入1.5mlpbs缓冲液，涡旋10min，室温下10000×g离心5min，弃去上清。

(4)在土壤沉淀中再分两次各加入1.5mlpbs缓冲液，按步骤3相同的方法再洗涤2次，均弃去上清。

(5)在此时的土壤沉淀的2.0ml离心管中，加入0.5000g灭菌玻璃珠(直径0.1～0.2mm和0.4～0.6mm等体积的玻璃珠混合物)和1.35mldna提取缓冲液。将离心管放入sartoriusstedimbiotech公司的b.braunmikro-dismembrators机械力细胞破碎仪中，振动频率调至2500rpm，振荡30s后停顿15s，再振荡30s后再停顿15s，最后还要振荡30s。经过3次30s的振荡后，土壤样品成为均匀悬液。

(6)将土壤悬液转移至新的15ml离心管中，加入2mlsds缓冲液，温和涡旋10min，65℃水浴1h，每隔15min轻轻摇动几次。

(7)室温下8000×g离心20min，收集中间的液相层。

(8)剩余物中再加入1mldna提取缓冲液和1mlsds缓冲液，65℃水浴8min，室温下8000×g离心20min，同样收集中间的液相层。并与步骤7的液相层合并。

(9)重复步骤8一次，收集到的液相层与上两次的合并。

(10)室温下13000×g离心5min，收集上清液。

(11)等体积的氯仿/异戊醇(24:1,v/v)抽提1次，室温下15000×g离心30min，收集上清液。

(12)加入0.1倍体积的3mnaac(ph5.20)，上下颠倒混匀后，再加入0.7倍体积的异丙醇，置于-20℃的冰箱沉淀12h。

(13)4℃15000×g离心20min，一次性倒掉上清液，沉淀即为dna。

(14)dna沉淀加入1ml预冷的70％乙醇洗涤，轻轻摇开dna沉淀，4℃13000×g离心10min，一次性倒掉上清液。

(15)dna沉淀室温干燥5～10min，让乙醇彻底挥发。

(16)用30μlte缓冲液悬浮dna沉淀，然后将得到的dna样品置于-20℃的冰箱保存。

至此，得到了粗提的dna。

为了进一步开展后续的分子生物学操作，还需要进一步开展dna纯化工作。本方法粗提得到的dna的进一步纯化采用市场上较为常用的dna快速纯化/回收试剂盒(柱式)，纯化过程遵照试剂盒说明书，具体纯化过程如下：

(i)在粗提的dna溶液中加入3倍体积的溶液a(6mnaclo4，0.03mnaac，ph5.20，少量酚红)，15μl溶液b(3mnaac)，充分混匀。

(ii)将溶液转移均匀到试剂盒提供的离心柱中，室温静置2min，10000rpm离心1min。

(iii)倒掉液体，加入500μl溶液c(70％乙醇)于离心柱中8000rpm离心1min，倒掉液体。

(iv)重复步骤(iii)。

(v)12000rpm再次离心1min，甩干剩余液体以除去残余乙醇。

(vi)将离心柱置于一新的离心管中，室温敞开离心管盖放置10min，使乙醇挥发殆尽。

(vii)加入30μl溶液d(te缓冲液)，50℃水浴2min。

(viii)15000rpm离心1min，管底溶液即为纯化后的dna。将此纯化后的dna贮存于-80℃冰箱中，可长期保存。

纯化后的总dna琼脂糖凝胶水平电泳检测

琼脂糖凝胶水平电泳条件：

0.8％电泳级琼脂糖凝胶；

点样孔dna样品上样量：1μl6×loadingbuffer+6μldna样品；

marker为λdna/handmarker-s，marker上样量5μl；

电泳缓冲液为1×tae，100v恒压，运行1h；

将运行好的凝胶放入eb(10μg/ml)中染色20min，凝胶成像系统uv灯下记录成像结果。

本方法提取的多环芳烃污染场地土壤中微生物基因组总dna(纯化后)的琼脂糖凝胶水平电泳检测结果如图1所示。

从图1可以直观地看到，本方法能很好地获得多环芳烃污染土壤样品的基因组总dna，并且片段大小在23130bp左右，在提取过程中无明显降解和被剪切情况发生。

纯化后的总dna16srdna的pcr扩增产物检测

为了检测本方法所提取到的dna是否含有对下游操作的抑制性物质，本方法继续进行了针对纯化后总dna的16srdna的pcr扩增，并对pcr扩增结果进行1.2％琼脂糖凝胶水平电泳检测。

pcr过程

利用提取到的该煤焦油污染的地下环境中微生物基因组总dna直接做模板dna，采用16srdna的通用引物8f(合成于上海生工生物工程技术服务有限公司)和1492r(合成于上海生工生物工程技术服务有限公司)，这对引物的工作浓度各为20μm，采用这对引物扩增的片断长度约为1450bp。此处的pcr反应体系为50μl(表1)。

引物1：8f(5′-agagtttgatcctggctcag-3′)，长度20bp；

引物2：1492r(5′-ggttaccttgttacgactt-3′)，长度19bp。

表1pcr反应体系

pcr扩增条件

为了增强pcr扩增的特异性，在配置pcr反应体系溶液的全过程中，所需的各试剂，均放置在冰上操作。为了监督pcr反应过程是否有外源dna污染，本研究中的每一次pcr反应，均设置不加模板dna的阴性对照，阴性对照的反应体系，除了用灭菌三蒸水代替模板dna之外，其余各项反应物组分添加的浓度和用量与其他样品均相同。经过30个循环后的pcr产物，需要进一步对其扩增产物进行1.2％琼脂糖凝胶水平电泳检测。

琼脂糖凝胶水平电泳条件：

1.2％电泳级琼脂糖凝胶；

点样孔pcr样品上样量：1μl6×loadingbuffer+5μlpcr产物；

marker为d2000dnamarker，marker上样量5μl；

电泳缓冲液为1×tae，120v恒压，运行40min；

将运行好的凝胶放入eb(10μg/ml)中染色20min，g-box凝胶成像及分析系统uv灯下记录成像结果。

pcr扩增产物的琼脂糖凝胶水平电泳结果

本提取方法得到的总dna的16srdna通用引物8f和1492r的pcr扩增产物的琼脂糖凝胶水平电泳检测结果如图2所示。

从图2可以直观地看到，本提取方法得到的总dna经pcr扩增后产物的目的dna条带清晰，且位置正确，与d2000dnamarker相比较，扩增出的片段长度介于1000～2000bp之间，大小约为1450bp，此结果可以说明，本提取方法的提取过程合理，均没有对下游pcr操作产生抑制作用的物质出现，本提取方法可行，可以得到大量用于后续分子生物学操作的目的dna。

纯化后的总dna产量和纯度的检测

dna产量和纯度的检测在eppendorf公司的biophotometerplus核酸蛋白测定仪上进行。将纯化后的dna溶液用te缓冲液稀释100倍后，放入biophotometerplus核酸蛋白测定仪中，调零后，分别读出dna浓度、od260/od280、od260/od230的数值，平行测定3次。

分析具体的数据可以看到，本提取方法的总dna产量为17.33(±0.02)μg/g。od260/od280＝1.69(±0.01)。由于od260/od280的值被用来表征dna纯度，纯dna的od260/od280值≈1.8(＞1.9，表明有rna污染；＜1.6，表明有蛋白质、酚类等的污染)，通常情况下，认为od260/od280值在1.6～1.8之间是比较理想的dna纯度。而本提取方法的od260/od280＝1.69(±0.01)介于1.6～1.8之间，表明所提取的dna经纯化后几乎不含有蛋白质、酚类等的污染，这也进一步验证了本方法在最初的细胞裂解步骤加入1.5％的β-巯基乙醇(利用其抗氧化作用)，其效果是非常明显的，可以很好地去除dna中的一些杂质，从而有利于后续的分子生物学操作。同理，od260/od230的值反映的是去除盐离子的程度，理论上，od260/od230的比值越高越好。本提取方法的od260/od230＝0.99(±0.01)，dna纯度满足后续实验的相关要求。最后应说明的是：显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明本申请所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本申请型的保护范围之中。