一种用于PCR的四温区管式控温装置及包含该装置的反应仪的制作方法

本发明涉及分子生物学器材，更特别地，涉及一种三段式四温区的管式控温装置，以及包含该管式控温装置的pcr仪。

背景技术：

dna的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链dna在多种酶的作用下可以变性解旋成单链，在dna聚合酶的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。dna在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制dna的变性和复性，加入设计引物，dna聚合酶、dntp就可以完成特定基因的体外复制。

pcr(聚合酶链式反应)是利用dna在95℃高温时变性会变成单链，低温(经常是60℃左右)时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至dna聚合酶最适反应温度(72℃左右)，dna聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5’-3’)的方向合成互补链。基于聚合酶制造的pcr仪实际就是一个温控设备，能在变性温度，复性温度，延伸温度之间很好地进行控制。

自perkin–elmercetus公司第一台pcr仪问世以来，现已有几十家不同的厂家在国内外生产和销售pcr仪。在短短的几年间，pcr仪经过几代的发展，不断采用新技术，并且进一步朝方便、实用、高智能化和自动化的方向发展。pcr技术的基本原理类似于dna的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。pcr由变性、退火和延伸三个基本反应步骤构成：①模板dna的变性：模板dna经加热至95℃左右一定时间后，使模板dna双链或经pcr扩增形成的双链dna解链，形成单链，以便引物的结合，为下轮反应作准备；②模板dna与引物的退火(复性)：模板dna经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板dna单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：dna模板/引物复合物在taqdnase等嗜热聚合酶的作用下，以dntp为反应原料，目的序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板dna链互补的半保留复制链，重复上述步骤就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2-4分钟，2-3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。

毛细管电泳(capillaryelectrophoresis,ce)又叫高效毛细管电泳(hpce),是近年来发展最快的分析方法之一。1981年jorgenson和lukacs首先提出在75μm内径毛细管柱内用高电压进行分离,创立了现代毛细管电泳。1984年terabe等建立了胶束毛细管电动力学色谱。1987年hjerten建立了毛细管等电聚焦，cohen和karger提出了毛细管凝胶电泳。1988-1989年出现了第一批毛细管电泳商品仪器。短短几年内,由于ce符合了以生物工程为代表的生命科学各领域中对多肽、蛋白质(包括酶，抗体)、核苷酸乃至脱氧核糖核酸(dna)的分离分析要求,得到了迅速的发展。

目前，pcr技术虽然得到了很大的发展，但是所有的pcr仪都是通过以下方法来控制pcr反应的：将装有pcr反应体系的pcr管置于固定的控温底座的控温孔中，并紧贴控温孔的内壁，通过控制控温孔壁的温度来控制pcr管及其内部所装的反应体系的温度。这类装置虽然已经普遍化，然而它存在着一些不可克服的缺点。

首先，耗时长。正常的pcr反应一般包括30个循环，其中变性30s、退火30s、延伸30s/kb。加上初始变性5min，终末延伸10min，扩增1kb的片段只需要一个半小时左右的时间。然而，在pcr仪上进行反应时，我们发现，扩增1kb的片段往往需要至少超过2小时的时间。其原因在于，pcr仪中样品的位置是固定的，所以，必须操控控温底座的温度改变至反应进行到的阶段所需要的温度。30个循环，每次循环有3次变温，也就是说需要进行90次左右的变温。这接近100次的升降温过程需要消耗大量的时间。

其次，升降温看似逆过程，而事实上降温比升温的困难度更高，为了便于降温，pcr仪中还不得不设置风扇，增大了pcr仪的体积，提高了成本。

再次，根据当前的pcr仪的原理和设置，为了保证pcr体系内的热传导效率，pcr体系不能太大，单独的pcr反应的体系不能超过200微升，这就限制了特定基因的大量制备。pcr仪器扩大扩增的通量主要依靠增大反应的孔的数目，目前高通量的pcr仪器已经做到了384孔，可以同时扩增或者定量384个样品，但是面对上千或者上万的样品的扩增和检测，就比较困难了。

此外，毛细管检测技术(ce)实现了高通量检测，并且实现了自动化的操作，但是，目前的pcr仪由于结构和设置上的硬伤，不利于与毛细管检测形成一体化操作。

因此，需要一种新的pcr仪以及新的控温装置。

技术实现要素：

为解决以上问题，本发明提供了一种用于pcr的管式控温装置，其包括控温柱和反应管；

所述控温柱分为三个节，依次为包括初始变性节、循环节和终末延伸节，所述控温柱的所述三个节之间不导热，所述初始变性节横截面外周设置为初始变性恒温加热区，加热温度为90-98℃，所述终末延伸节的横截面外周设置为终末延伸恒温加热区，加热温度为70-75℃，所述循环节的横截面外周划分为四个恒温加热区，依次为变性区、冷却区、退火区和延伸区；

所述反应管包括入口、出口和管身，所述反应管的管身在长度方向上分为三个域，从入口至出口方向按顺序依次为初始变性域、循环域和终末延伸域，所述管身的三个域分别相应地盘绕于所述控温柱的三个节上，并且所述初始变性域与所述循环域通过变性域连接管连通，所述循环域与所述终末延伸域通过延伸域连接管连通。

控温柱的三节可同轴设置或非同轴设置。

本发明的管式控温装置将控温柱分为三节，并将相应地将管身分为三个域，从而将pcr的初始变性阶段、循环阶段和终末延伸阶段分别在三个相对独立的部段中进行，减少了需要程序控制的步骤，避免了使用仅一个部段时需要控制泵或阀，以使pcr反应体系在循环反应前在变性区停留初始变性阶段所需的时间，以及在循环反应结束后在延伸区停留终末延伸阶段所需的时间。

循环节四个恒温加热区的划分，在变性区与退火区之间加入了冷却区。这个设置的原因是，变性温度为95℃左右，退火温度为60℃左右，从变性到退火需要降温，而降温事实上是一个比升温更难的过程。如果反应体系直接从95℃的环境进入的60℃的环境，那么其温度不大容易降到60℃，而会比该温度要高。为了克服这个缺点，我们在变性区与退火区之间加入了比较短的冷却区，冷却区的温度控制在45-50℃左右。当反应体系经过冷却区时，温度降低到退火温度附近并略低于退火温度，并立刻进入到退火区，反应体系温度立刻升高并回到退火温度，进行退火，预定时间后进入到延伸区。使得在反应管中形成一个pcr循环的三个阶段中所需的温度，并且在循环节中，这三个温区都是恒温，不需要在变性温度-退火温度-延伸温度之间进行循环切换。反应体系从变性区开始依次流过冷却区、退火区、延伸区，完成一次pcr的温度循环，从而每绕循环节运行一次即完成一个循环的pcr反应。因此，四温区的划分重点要解决的是从变性到退火的降温难的问题。

在一个实施方案中，所述控温柱的三个节均为圆柱形或圆筒形，直径相等或不等。圆柱形便于反应管管身与控温柱的贴合，不产生空隙，从而更有效地传热。还可根据需要调节三节的各自的直径，以得到合适的长度，从而使得在反应过程中泵保持均匀转速即可，无需控制泵改变转速。

在一个优选实施方案中，所述变性域连接管与所述循环域的连接处位于所述延伸区与所述变性区的分界处，或者位于所述变性区与所述冷却区的分界处。该设置使得反应体系从初始变性域进入到循环域后即进入循环阶段，或者，由于循环阶段的第一步是变性，恰好与初始变性阶段所需的温度相同，所以可将第一个循环的变性位置整合至初始变性域中，到循环域时，直接进入退火区。

在一个优选实施方案中，所述延伸域连接管与所述循环域的连接处位于所述延伸区与所述变性区的分界处。

在一个实施方案中，所述延伸域连接管有三个以上的分枝，其中一个分枝与所述终末延伸域连接，其他分枝分别与所述循环域在距所述变性域连接管不同螺圈数处连接，并且所述延伸域连接管与所述循环域的连接处设置有阀。阀可具有两种状态，第一种状态为使所述阀两边的螺圈连通(反应体系向下一个螺圈移动)；第二种状态为使循环域在阀的位置与相应的延伸域连接管分枝连通(反应体系离开循环域并通过延伸域连接管进入终末延伸域)。设置阀的状态使反应体系经过特定的圈数并从相应的延伸域连接管分枝进入到终末延伸域中，从而在循环阶段进行特定的pcr反应循环数。例如，循环域可在循环节上盘绕30-60圈，并在距变性域连接管不同的圈数处设置成通过延伸域连接管的分枝与终末延伸域连接，设置阀的状态使反应体系经过特定的圈数并从相应的分枝进入终末延伸域，从而进行特定的pcr反应循环数。

在一个实施方案中，所述循环节横截面外周的四个恒温加热区为固定长度的恒温加热区。所述变性区的温度为90-98℃，所述冷却区的温度为40-50℃，所述退火区的温度为55-70℃，所述延伸区的温度为70-75℃，所述反应管的入口位于所述变性区的靠所述冷却区的一端。四个恒温加热区的划分使得在反应管中形成一个pcr循环的三个阶段中所需的温度的同时解决了从变性到退火的降温难的问题。并且在该控温装置中，这四个温区都是恒温，不需要在变性温度-退火温度-延伸温度之间进行循环切换。反应体系从变性区开始依次流过冷却区、退火区、延伸区，完成一次pcr的温度循环，从而每绕控温柱运行一次即完成一个循环的pcr反应。

在一个优选实施方案中，所述管身的循环域根据所处恒温加热区分段，每圈螺旋相应地依次分成变性区段、冷却区段、退火区段和延伸区段，并且相邻的区段之间通过热绝缘材料制成的短管连通。通过在相邻的区段之间采取热绝缘的短管连通，更好地避免了管身的不同恒温区段之间的热传递。本发明中所谓的热绝缘材料是指热传导率较低的材料，而非绝对不导热的材料。

在一个优选实施方案中，所述控温柱表面具有与所述反应管管身相匹配的螺圈凹槽，所述管身嵌入所述螺圈凹槽中。该设置使得能够更好更精确地控制反应管管身的温度。在另一个优选实施方案中，所述螺圈凹槽对应的恒温加热区之间由热绝缘材料隔开。更好地隔离相邻恒温加热区之间的热传导。

在另一个实施方案中，所述循环节横截面外周由多个独立的恒温加热单元组成，每个所述恒温加热单元的温度受到独立的控制，并且所述多个独立的恒温加热单元被划分为四个恒温加热区。在不同的pcr反应循环中，所需的变性时间、冷却时间、退火时间和延伸时间可能不同，可根据需要调节各恒温加热区包含的恒温加热单元以及反应体系在管身中的移动速度，从而使得反应体系在相应的温度下停留所需要的反应时间。

本发明还涉及一种pcr仪，其包括上述管式控温装置，以及进样管、反应产物排出管和泵，所述进样管与所述反应管的入口连接，所述反应产物排出管与所述反应管的出口连接，所述泵驱动进入所述进样管的反应物向所述反应产物排出管移动。该pcr仪构建了与本领域原有的固定位置pcr反应机构完全不同的新反应机构，使得更有利于pcr反应，去除了变温固定位置pcr循环反应的温度切换过程中所需的升降温时间。根据pcr反应原理和所需的三个阶段，将控温装置分成三节，每节实现各自的功能，减少了反应过程中程序控制的介入，降低了仪器制造成本，并且也同时提高了耐用性。

在一个优选实施方案中，所述pcr仪中包括多个所述管式装置以及相应的进样管和反应产物排出管，并且每两个加热装置中延伸区的长度相同或不同。设置特定的变性区-冷却区-退火区-延伸区长度，使得可在循环过程中保持泵匀速，根据所需扩增的片段长度，在反应仪中选择不同的控温装置的得到不同的延伸时间。

在一个优选实施方案，所述pcr仪还包括控制器，所述泵和控温柱与所述控制器电连接，当所述延伸域连接管与所述循环域连接处设置有阀时，所述阀与所述控制器电连接。控制器可控制反应仪的各项参数，以使反应精确进行。

在本发明的管式控温装置中，通过控制控温柱的温度来控制反应管的温度。使反应体系从反应管入口进入，经过管身，反应体系的温度通过热传导而与所处位置的管身温度相同，并在该温度下进行反应。这样的管式控温装置可营造恒温反应和温度循环变化反应的反应环境。当将控温柱的循环节横截面外周划分为多个不同的恒温加热区后，本发明的管式控温装置尤其适于营造温度循环变化的反应环境，例如用于pcr，该控温装置不需要传统pcr仪中需要循环切换控温底座的温度的过程，为pcr反应节省的大量时间。同时，由于使用管式设计，使得本发明的控温装置在与泵结合后，十分有利于与前端的进样装置和后端的分离装置进行结合，由此来实现扩增dna片段从体系配制到pcr反应再到pcr反应产物的分离的全自动化。

附图说明

图1为控温装置的一个实例的示意图；

图2为初始变性节与盘绕在其上的初始变性域的横截面视图；

图3为终末延伸节与盘绕在其上的终末延伸域的横截面视图；

图4为循环节与盘绕在其上的循环域的一个实例的横截面视图；

图5为循环节与盘绕在其上的循环域的另一个实例的横截面视图；

图6为循环节与盘绕在其上的循环域的另一个实例的横截面视图；图7为控温装置的一个实例的示意图；

图8为反应仪的一个实例的示意图。

附图中，各标号所代表的部件列表如下：

101、初始变性节，102、循环节，1020、恒温加热单元，1021、变性区，1022、冷却区，1023、退火区，1024、延伸区，103、终末延伸节，201、初始变性域，202、循环域，2021、变性区段，2022、冷却区段、2023退火区段，2024、延伸区段，2025、绝缘短管，203、终末延伸域，204、变性域连接管，205、延伸域连接管，3、入口，4、出口，5、进样管，6、反应产物排出管，7、阀。

具体实施方式

以下结合实例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

实施例1

如图1-6所示，本实施例的用于pcr的管式控温装置，其包括控温柱和反应管；

所述控温柱分为三个节，依次为包括初始变性节101、循环节102和终末延伸节103，所述控温柱的所述三个节之间不导热，同轴设置或非同轴设置，所述初始变性节101横截面外周设置为初始变性恒温加热区，加热温度为90-98℃，所述终末延伸节103的横截面外周设置为终末延伸恒温加热区，加热温度为70-75℃，所述循环节102的横截面外周划分为三个恒温加热区，依次为变性区1021、冷却区1022，退火区1023和延伸区1024。变性区1021的加热温度为90-98℃、冷却区1022的加热温度为40-50℃，退火区1023的加热温度为50-70℃，延伸区1024的加热温度为70-75℃。

所述反应管包括入口3、出口4和管身，所述反应管的管身在长度方向上分为三个域，从入口至出口方向按顺序依次为初始变性域201、循环域202和终末延伸域203。所述管身的三个域分别相应地盘绕于所述控温柱的三个节上，初始变性域201螺旋盘绕于初始变性节101上，循环域202螺旋盘绕于循环节102上，终末延伸域203螺旋盘绕于终末延伸节103上，并且所述初始变性域201与所述循环域202通过变性域连接管204连通，所述循环域202与所述终末延伸域203通过延伸域连接管205连通。

运行过程中，反应体系从入口3进入，依次经过初始变性域201、循环域202和终末延伸域203，并从出口4流出，反应体系的温度通过热传导而与所处位置的管身温度相同，并在该温度下进行反应。这样的管式控温装置可用于营造恒温反应和温度循环变化反应的反应环境。

反应体系在初始变性域201中完成pcr的初始变性阶段，在终末延伸域203中完成pcr的终末延伸阶段。在循环域中，三个恒温加热区的划分使得在反应管中形成一个pcr循环所需的三种温度的温区，并且在该控温装置中，这三个温区都是恒温，不需要在变性温度-退火温度-延伸温度之间进行循环切换。反应体系从变性区开始依次流过冷却区、退火区、延伸区，完成一次pcr的温度循环，从而每绕循环域运行一次即完成一个循环的pcr反应。

实施例2

如图5所示，本实施例的控温装置的循环域根据所处恒温加热区分段，每圈螺旋相应地形成四个恒温区段，依次为变性区段2021、冷却区段2022、退火区段2023和延伸区段2024，并且相邻的区段之间通过热绝缘材料制成的短管2025连通。通过在相邻的区段之间采取热绝缘的短管2025连通，更好地避免了循环域202的不同恒温区段之间的热传递。本实施例中所谓的热绝缘材料是指热传导率较低的材料，而非绝对不导热的材料。

实施例3

在一个更优选的方案中，所述控温柱表面具有与所述反应管管身相匹配的螺圈凹槽，所述反应管管身嵌入所述螺圈凹槽中。该设置使得能够更好更精确地控制反应管管身的温度。更优选地，所述螺圈凹槽对应的恒温加热区之间由热绝缘材料隔开，更好地隔离相邻恒温加热区之间的热传导。本实施例中所谓的热绝缘材料是指热传导率较低的材料，而非绝对不导热的材料。

实施例4

如图6所示，本实施例的控温装置的循环域横截面的外周由多个恒温加热单元1020组成，所述多个恒温加热单元1020在使用过程中会被按需要控制划分为四个恒温加热区，依次为变性区1021、冷却区1022、退火区1023和延伸区1024，每个恒温加热区中包括多个恒温加热单元1020，所述变性区1021中的恒温加热单元的温度为90-98℃，所述冷却区1022中的恒温加热单元的温度为40-50℃，所述退火区1023中的恒温加热单元的温度为55-70℃，所述延伸区1024中的恒温加热单元的温度为70-75℃，所述变性域连接管204与循环域的连接处位于所述变性区1021与所述退火区1024的分界处，并且所述延伸域连接管205与所述循环域202的连接处位于所述延伸区1024与所述变性区1021的分界处。该装置可用于pcr仪中，作为pcr反应的控温装置。

在不同的pcr反应循环中，所需的变性时间、退火时间和延伸时间不同，可根据需要调节各恒温加热区包含的恒温加热单元以及反应体系在管身中的移动速度，从而使得反应体系在相应的温度下停留所需要的反应时间。

实施例5

如图7所示，所述延伸域连接管205有三个以上的分枝，其中一个分枝与所述终末延伸域203连接，其他分枝分别与所述循环域202在距所述变性域连接管204不同螺圈数处连接，并且所述延伸域连接管205与所述循环域202的连接处设置有阀7。阀7可具有两种状态，第一种状态为使所述阀7两边的螺圈连通(反应体系向下一个螺圈移动)；第二种状态为使循环域202在阀7的位置与相应的延伸域连接管205分枝连通(反应体系离开循环域202并通过延伸域连接管205进入终末延伸域203)。设置阀7的状态使反应体系经过特定的圈数并从相应的延伸域连接管205分枝进入到终末延伸域203中，从而在循环阶段进行特定的pcr反应循环数。例如，循环域202可在循环节1023上盘绕30-60圈，并在距变性域连接管204不同的圈数处设置成通过延伸域连接管205的分枝与终末延伸域连接，设置阀的状态使反应体系经过特定的圈数并从相应的分枝进入终末延伸域，从而进行特定的pcr反应循环数。

实施例6

如图8所示，本实施例为本发明还涉及一种pcr仪，其包括上述管式控温装置，以及进样管5、反应产物排出管6和泵，所述进样管5与所述反应管的入口3连接，所述反应产物排出管6与所述反应管的出口4连接，所述泵驱动进入所述进样管5的反应体系向所述反应产物排出管6移动。

运行过程中，将反应体系加入至进样管5中，开启泵，泵驱动反应体系从进样管5经过反应管管身向反应产物排出管6运行，反应体系在经过反应管管身的过程中完成反应。

该pcr仪构建了与本领域原有的固定位置pcr反应机构完全不同的新反应机构，使得更有利于pcr反应，去除了变温固定位置pcr循环反应的温度切换过程中所需的升降温时间。根据pcr反应原理和所需的三个阶段，将控温装置分成三节，每节实现各自的功能，减少了反应过程中程序控制的介入，降低了仪器制造成本，并且也同时提高了耐用性。并且，在该反应仪中还可设置加压装置来控制反应管内部的压强，压强的提高可避免反应体系的蒸发。

实施例7

本实施例中的pcr仪中包括多个管式控温装置以及相应的进样管3和反应产物排出管4，并且每两个管式控温装置中延伸区1024的长度相同或不同。设置特定的变性区-冷却区-退火区-延伸区长度，使得可在循环过程中保持泵匀速，根据所需扩增的片段长度，在反应仪中选择不同的控温装置的得到不同的延伸时间。

优选地，所述上述pcr仪还包括控制器，所述泵和控温柱各节与所述控制器电连接，当所述循环域202与所述延伸域连接管205的连接处设置有阀7时，所述阀7与所述控制器电连接。控制器可控制反应仪的各项参数，以使反应精确进行。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。