集成式太赫兹超结构纳米生物芯片及其应用和方法与流程

本发明属于医学检测领域，涉及集成式太赫兹超结构纳米生物芯片，还涉及该生物芯片的应用和方法。

背景技术：

在原发上皮肿瘤形成和生长的早期，肿瘤细胞便可以通过血流播散到远处器官，这类在外周血中存在的肿瘤细胞被统称为循环肿瘤细胞(circulatingtumorcells，ctcs)。目前的研究认为ctcs是恶性肿瘤出现血路转移的主要生物学基础，其数量的多少与患者的预后关系密切。当外周血中的循环肿瘤细胞数目达到一定阈值后，恶性肿瘤转移的发生几率将大大增加。如果在转移灶出现前就能预测患者将要发生转移，就可以采取更加积极主动的治疗措施，极大的提高癌症患者的生存率。因此对这些循环肿瘤细胞通过不同技术进行早期的富集、检测和分析被认为是对癌症患者进行的实时“液体活检”，其临床指导意义十分巨大。但是由于外周血中的ctcs数目较少，精确分离检测十分困难，因此限制了ctcs相关检测的临床应用。目前包括免疫磁珠法、膜过滤法、密度梯度离心法、流式细胞分析法等在内的传统的ctcs检测方法虽具有较好的检测灵敏度但也存在样本处理复杂、操作过程繁琐、检测时间较长等技术缺陷。为解决上述难题，近些来出现了基于微流体学原理的ctcs检测芯片技术，即利用流体动力学中的惯性聚焦作用进行快速ctcs分选检测，虽然提高了检测速度，但是检测灵敏度较低。综上所述，目前的ctcs检测策略往往只能采取折中方案，高敏感性的方法通常不够快速，而快速分析方法往往敏感度不够。此外，ctcs检测面临的更加关键问题在于:无法判定检测到的细胞是存活的还是凋亡的，而只有功能细胞才能够促成转移灶的形成。因此，有必要寻求能够有效解决上述技术瓶颈的跨学科ctcs检测新技术与新方法。

近年来快速发展的太赫兹(thz)波检测技术有望挑战检测ctcs的难题，thz波是指频率在0.1～10thz的电磁波，在电磁波谱中位于毫米波与红外波段之间。thz波对于许多生物物质均具有特殊的响应，当其照射于生物分子时，可有效产生共振吸收从而提供特征识别指纹谱，此外thz波对水分子极其敏感，可用于组织与细胞的区分。同时，1thz的光子能量仅为4.14mev，thz波在穿透细胞时不会发生有害的电离作用。因此thz波检测技术是一种纯物理的安全有效的无损伤、无标记检测技术，近些年来其在生物医学检测领域的应用越来越广。zhang等人的研究表明thz波具有检测细胞凋亡状态的能力，他们将口腔癌细胞scc4培养在自行设计的thz超材料传感器上，通过测量超材料共振峰的相对位移来判断细胞的状态，其结果与流式细胞仪的结果存在线性关系。为了验证thz波对细胞生存状态的表征能力，证实了thz超材料传感技术应用于细胞生存状态检测的可行性，thz超材料传感技术具备实现在同一时间节点对ctcs进行直接检测和生存状态判断的物理特征和独特优势。

现有的thz超材料传感技术尽管具备检测培养肿瘤细胞的能力，但是要达到直接检测外周血中的ctcs和判断其生存状态的目的，还需要解决两个关键技术问题：快速高效的血液样本预处理和具备单细胞级的检测灵敏度。

针对问题一：可通过具有较高分选速度的微流体ctcs检测芯片技术进行血液样本的预处理，但其基于流体动力学的分选原理使得其分选效率较低，同时起分选作用的流体管道结构与thz波的检测光斑直径不匹配，导致了前期样本预处理和后续thz检测步骤必须分离进行，这使得判断ctcs生存状态的真实性难以保证。

针对问题二：现有的thz超材料传感技术不具备单细胞级别的检测灵敏度，同时还没有与ctcs检测芯片技术匹配的惯用方法。

所以有必要针对上述问题研发出一种能在快速高效的处理血液样本的同时具备单细胞级的检测灵敏度的集成式thz纳米细胞芯片，兼顾检测速度和灵敏度，以实现对ctcs的实时、有效检测和凋亡状态的真实判断。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种集成式太赫兹超结构纳米生物芯片，将具有高效分选效率的滤过膜结构和毫米级微流体管腔结合，然后在原有的thz超材料传感技术的基础上，设计适合于循环肿瘤细胞的具有高分选效率、高分选速度和单细胞级别灵敏度的检测芯片；本发明的目的之二在于提供集成式太赫兹超结构纳米生物芯片在检测肿瘤细胞中的应用；本发明的目的之三在于提供集成式太赫兹超结构纳米生物芯片的使用方法。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

1、集成式太赫兹超结构纳米生物芯片，包括微流控滤膜分选芯片结构和thz超结构信号检测模块，所述微流控滤膜分选芯片结构与thz超结构信号检测模块通过设置有阻隔阀门ⅱ的通道连接；

所述微流控滤膜分选芯片结构包括过滤与孵育腔室，设置于过滤与孵育腔室上部的入口通道和设置于过滤与孵育腔室下部的出口通道ⅰ，所述入口通道和出口通道ⅰ内分别设置有滤膜阀门和阻隔阀门ⅰ，所述滤膜阀门由聚氯乙烯微孔过滤膜ⅰ和阀门开关ⅰ组成；所述阻隔阀门ⅰ由无孔径特氟龙膜和阀门开关ⅱ组成，所述过滤与孵育腔室内部靠近出口通道处设置有聚氯乙烯微孔过滤膜ⅱ；

所述thz超结构信号检测模块的底部设置有包被捕获抗体的thz超结构信号检测芯片，thz超结构信号检测模块一端设置有出口通道ⅱ，且靠出口通道ⅱ处设置有聚氯乙烯微孔过滤膜ⅲ。

本发明优选的，所述thz超结构信号检测芯片由高阻硅基底上阵列排布的金或银制备的杯口状超结构组成，所述杯口状超结构内直径为150μm，外直径为160μm，线宽为5μm，深度为4μm，杯口超结构之间间距为10μm。所述金或银也可以用其他金属材质，但使用金或银效果最优。

本发明更优选的，所述微流控滤膜分选芯片结构和thz超结构信号检测模块的腔室面积均为5mm×7mm，深度为100μm。

本发明更优选的，所述聚氯乙烯微孔过滤膜ⅰ规格为0.5mm×1mm，孔径为20μm，所述无孔径特氟龙膜的规格为0.5mm×1mm，所述聚氯乙烯微孔过滤膜ⅱ规格为0.5×5mm，孔径为20μm，所述聚氯乙烯微孔过滤膜ⅲ的规格为0.5mm×5mm，孔径为20μm。

本发明最优选的，所述入口通道和出口通道ⅰ的直径为1mm，长度为100μm，所述聚氯乙烯微孔过滤膜ⅱ设置于距离出口通道ⅰ1mm处；所述出口通道ⅱ的直径为1mm，长度为100μm，所述聚氯乙烯微孔过滤膜ⅲ设置于靠近出口通道ⅱ1mm处。

2、所述集成式太赫兹超结构纳米生物芯片在检测肿瘤细胞中的应用。

优选的，所述肿瘤细胞为循环肿瘤细胞。更优选的，所述循环肿瘤细胞为乳腺癌mda-mb-231细胞。

3、所述集成式太赫兹超结构纳米生物芯片的使用方法，包括如下步骤：

(1)将待检测样本用流体注射泵注入过滤和孵育腔室内，滤除红细胞；

(2)然后向thz超结构信号检测模块中注入含标记抗体的纳米金颗粒溶液，孵育，使纳米颗粒上标记的抗体与肿瘤细胞相连接；

(3)向过滤和孵育腔室内注入pbs缓冲液，使过滤和孵育腔室中的液体进入thz超结构信号检测模块，并排除未结合肿瘤细胞的纳米颗粒；

(4)将thz超结构信号检测模块孵育，使细胞-纳米颗粒聚合物被thz超结构信号检测芯片阵列上的捕获抗体固定，随后注入pbs缓冲液冲洗白细胞；

(5)从thz超结构信号检测模块中通入氟油，置换腔室内的水层；

(6)将thz超结构信号检测模块用红外线发射器激发纳米颗粒产生局域表面等离子体共振，然后进行thz波检测。

本发明优选的，包括如下步骤：

(1)开启滤膜阀门和阻隔阀门ⅰ，关闭阻隔阀门ⅱ，将待检测样本用流体注射泵注入过滤和孵育腔室内，滤除红细胞；

(2)关闭滤膜阀门，开启阻隔阀门ⅰ，从出口通道ⅰ注入含标记抗体的纳米金颗粒溶液，将集成式太赫兹超结构纳米生物芯片置于37℃下孵育60min，使得纳米颗粒上标记的抗体与肿瘤细胞相连接；

(3)开启阻隔阀门ⅱ，从过滤和孵育腔室的入口通道和出口通道ⅰ注入pbs缓冲液，使过滤和孵育腔室中的液体进入thz超结构信号检测模块，排除未结合肿瘤细胞的纳米颗粒；

(4)将thz超结构信号检测模块置于37℃孵育60min，使细胞-纳米颗粒聚合物被thz超结构信号检测芯片阵列上的捕获抗体固定，随后在出口通道ⅰ和出口通道ⅱ内注入pbs缓冲液冲洗白细胞；

(5)从检测腔室的出口通道通入氟油，以20μl/min的流速冲刷至少5min，置换thz超结构信号检测模块内的水层；

(6)关闭阻隔阀门ⅱ，将thz超结构信号检测模块用红外线发射器激发纳米颗粒产生局域表面等离子体共振，然后进行thz波检测。

更优选的，所述肿瘤细胞为循环肿瘤细胞。

本发明的有益效果在于：本发明公开了集成式太赫兹超结构纳米生物芯片，摒弃了传统的基于流体动力学分选原理的微米级微流体管腔结构，将具有高效分选效率的滤过膜结构和毫米级微流体管腔结合，利用过滤膜分选和抗体捕获固定原理，并设计与thz波光斑相匹配的5×7mm微流体管腔，使之专门适用于ctcs的thz检测。

为了提高检测灵敏度，构建了“杯口状”的三维thz超结构信号检测模块，使检测信号强度较以前提高至少3个数量级，与纳米颗粒信号放大系统联用，最大限度的提高检测的信号强度，达到适用于ctcs检测的检测灵敏度(1-10cell/ml)。

本发明还公开了集成式太赫兹超结构纳米生物芯片检测循环肿瘤细胞的方法，采用氟油冲刷置换水分子的方法解决ctcs周围水分子对thz波检测信号的强烈干扰问题。氟油对thz波的吸收远远低于水和其他惰性有机溶剂，以氟油作为ctcs的溶剂可降低检测过程中的信号损失，极大提高输出thz波检测信号的强度，从而增强检测灵敏度。

利用本发明公开的集成式太赫兹超结构纳米生物芯片检测肿瘤细胞，仅用流体注射泵和微流控阀门结构组合控制的检测方法替代传统滤过膜技术中复杂的加样、过滤和冲刷等操作步骤，同时提高了分选效率和分选速度，可实现快速高效的血液样本预处理，与检测装置集成与同一微流体芯片内，可实现集成化、自动化和便携式的ctcs检测。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

图1为集成式太赫兹超结构纳米生物芯片结构图。

图2为改进的集成式太赫兹超结构纳米生物芯片结构图。

图3为thz超结构信号检测芯片结构图。

图4为集成式太赫兹超结构纳米生物芯片检测原理图。

图5为纳米颗粒信号放大系统原理图。

图6为不同溶剂在thz频段的吸收系数。

图7为氟油作为溶剂检测肿瘤细胞爬片结果。

图8为乳腺癌细胞悬液检测结果。

具体实施方式

下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。

实施例1、集成式太赫兹超结构纳米生物芯片

用于循环肿瘤细胞检测的集成式太赫兹超结构纳米生物芯片，结构如图1所示，包括微流控滤膜分选芯片结构1和thz超结构信号检测模块2，其中微流控滤膜分选芯片结构1与thz超结构信号检测模块2通过通道3连接，且在通道中间设置有阻隔阀门ⅱ10；所述微流控滤膜分选芯片结构1包括过滤与孵育腔室5，设置于过滤与孵育腔室5上部的入口通道9和设置于过滤与孵育腔室下部的出口通道ⅰ8，所述入口通道9和出口通道ⅰ8内分别设置有滤膜阀门4和阻隔阀门ⅰ7，滤膜阀门4由孔径为20μm的聚氯乙烯微孔过滤膜ⅰ和阀门开关组成，开启时通道内液体可无阻隔通过，关闭时只有直径小于20μm的物体才能通过，阻隔阀门ⅰ7由无孔径特氟龙膜和阀门开关组成，开启时液体可无阻隔通过，关闭时完全阻断液体流通。此外，过滤与孵育腔室内部靠近出口通道处设置有聚氯乙烯微孔过滤膜ⅱ7，材料与作用和滤膜阀门中的滤膜一致；所述thz超结构信号检测模块的底部设置有thz超结构信号检测芯片11，thz超结构信号检测模块一端设置有出口通道ⅱ12，靠近出口通道ⅱ13处设置有聚氯乙烯微孔过滤膜ⅲ12。

本发明优选的，微流控滤膜分选芯片结构1和thz超结构信号检测模块2的腔室面积均为5mm×7mm，深度为100μm，滤膜阀门的聚氯乙烯微孔过滤膜ⅰ规格为0.5mm×1mm，无孔径特氟龙膜的规格为0.5mm×1mm，过滤与孵育腔室的聚氯乙烯微孔过滤膜ⅱ7规格为0.5×5mm，聚氯乙烯微孔过滤膜ⅲ12的规格为0.5mm×5mm。

优选的，将过滤和孵育腔室设计为六边形，结构如图2所示，采用该方法可使腔室内液体流动更加通畅，避免死腔，有助于血液样本的预处理。

更优选的，入口通道9和出口通道ⅰ8的直径为1mm，长度为100μm；聚氯乙烯微孔过滤膜ⅱ7设置于靠近出口通道ⅰ8的1mm处；出口通道ⅱ13的直径为1mm，长度为100μm，聚氯乙烯微孔过滤膜ⅲ12设置于靠近出口通道ⅱ1mm处。

进一步优选的，thz超结构信号检测芯片由高阻硅基底上多个阵列排布的金属材质制备杯口状超结构组成(图3)，金属材质可以为金和银，也可以为其他金属；杯口状超结构不同于传统的太赫兹超材料或者太赫兹天线等平面结构在x轴和y轴上进行信号放大，这种三维结构在z轴上进行信号的进一步放大，使得检测灵敏度再度提高两个数量级以上。杯口状超结构采用在太赫兹波段吸收系数及折射率数值较大的金属材料(金或银等)所制备，最大限度地增大表面等离子体共振时的太赫兹电磁波的电场强度，从而通过这种极端非对称的电磁环境极大提高检测灵敏度。其中单个杯口检测单元的内直径为150μm，外直径为160μm，线宽5μm，z轴深度为4μm，杯口超结构之间间距为10μm。通过有限元分析数值模拟方法，该结构在1.4thz左右具有明显吸收峰。杯口状超结构上预先包备有可专门捕获ctcs的捕获抗体，可在ctcs经过时将其固定于超结构附近。由于该杯口状超结构对于表面物质信息非常敏感，当ctcs被捕获抗体所捕获时，会导致太赫兹共振峰发生首次位移，通过位移量的大小可对细胞的数量进行检测。

检测原理如下(图4)：开始检测前，将待检测ctcs样本通入过滤与孵育腔室，然后向过滤与孵育腔室加入标记抗体的纳米金颗溶液，ctcs在过滤与孵育腔室中先连接的标记抗体的纳米金颗粒形成“细胞-纳米颗粒聚合物”，随后一起进入thz超结构信号检测模块被捕获抗体捕获。最后在检测腔室内注入氟油，冲刷掉检测腔室内的水层，并采用红外激发纳米金颗粒产生表面等离子体共振后进行thz光谱检测。由于纳米金颗粒在红外波段具有明显吸收峰，故当采用红外激发光源照射于纳米金颗粒时，可激发起周围的表面等离子体共振。因此通过连接抗体结合在ctcs周围的金纳米颗粒受到激发，周围氟油温度升高，使得样本的太赫兹吸收明显增强，其表面有效介电常数的改变导致共振吸收峰产生二次位移，ctcs检测信号得到进一步放大(图5)。

本发明在检测前使用氟油置换ctcs周围的水层是一种降低thz背景吸收，提高检测信号强度的方法。氟油是一种在thz频段吸收极低的液态溶剂，由于水对thz波的吸收极强(室温下1thz处的吸收系数为250cm^-1左右)，thz检测信号在穿过生物样本时大部分均被其周围的水分子损耗，导致输出信号微弱，给液态生物样本检测带来极大干扰。如图6所示，氟油在室温下1thz处的吸收系数为4.5cm^-1左右，仅为纯水的1/50左右，因此在相同液层厚度的情况下thz波穿过氟油层时其能量损耗远远低于其穿过水层时。其他两种惰性有机溶剂：二甲基硅油和肉豆蔻酸异丙酯在室温下1thz处的吸收系数分别为16和11.5cm^-1左右，均大于氟油。因此，氟油在降低信号损失，消除水敏感性方面的能力更强。如图7所示，当肿瘤细胞周围为培养基(主要成分为水)时，thz波透过率极低且有细胞和无细胞时的thz透过率基本相同，有无细胞的差异难以区分。而当细胞周围为氟油时，thz波透过率明显提高且有细胞时的thz透过率明显低于无细胞覆盖时，细胞对thz波的响应得以体现。因此采用氟油替代水层的方法可降低thz检测信号在穿过ctcs样本时的信号损失，提高输出thz波检测信号的强度。

检测方法包括如下步骤：

(1)开启滤膜阀门和阻隔阀门ⅰ，关闭阻隔阀门ⅱ，将待检测样本用流体注射泵注入过滤和孵育腔室内，滤除红细胞；

(2)关闭滤膜阀门，开启阻隔阀门ⅰ，从出口通道ⅰ注入含标记抗体的纳米金颗粒溶液，将芯片置于37℃下孵育60min，使得纳米颗粒上标记抗体的与ctcs相连接；

(3)开启阻隔阀门ⅱ，从过滤和孵育腔室的入口通道和出口通道ⅰ注入pbs缓冲液，使过滤和孵育腔室中的液体进入thz超结构信号检测模块，多余的纳米颗粒被滤膜过滤排出，thz超结构信号检测模块中剩下细胞-纳米颗粒聚合物和白细胞；

(4)将芯片置于37℃孵育60min，使细胞-纳米颗粒聚合物被thz超结构信号检测芯片阵列上的捕获抗体固定，随后在两个出口通道内注入pbs缓冲液冲走白细胞；

(5)从thz超结构信号检测模块的出口通道通入氟油，冲刷置换腔室内的水层；

(6)关闭阻隔阀门ⅱ，打开红外线发射器激发纳米颗粒产生局域表面等离子体共振并进行thz波检测。

实施例2、不同浓度乳腺癌细胞悬液的检测

不同浓度乳腺癌细胞悬液的检测，具体步骤如下：

(1)采用培养的乳腺癌mda-mb-231细胞和正常人外周血配置不同浓度的肿瘤细胞样本作为ctcs的模型样本，其浓度梯度设置为10-10⁵cell/ml；

(2)开启滤膜阀门和阻隔阀门ⅰ，关闭阻隔阀门ⅱ；将样本用流体注射泵以50μl/min的流速注入过滤和孵育腔室内，滤除红细胞；

(3)关闭滤膜阀门，开启阻隔阀ⅰ，从出口通道ⅰ以30μl/min的流速注入含标记抗体的纳米金颗粒溶液，将芯片置于37℃下孵育60min，使得纳米颗粒上标记抗体的与乳腺癌mda-mb-231细胞相连接；

(4)开启阻隔阀门ⅱ，从过滤和孵育腔室的入口通道和出口通道ⅰ以50μl/min的流速注入pbs缓冲液，使过滤和孵育腔室中的液体进入thz超结构信号检测模块，多余的纳米颗粒被滤膜过滤排出，thz超结构信号检测模块中剩下细胞-纳米颗粒聚合物和白细胞；

(5)将芯片置于37℃孵育60min，使细胞-纳米颗粒聚合物被thz超结构信号检测芯片阵列上的捕获抗体(muc1抗体)固定，随后在两个出口通道内注入pbs缓冲液以50μl/min的流速冲走白细胞；

(6)从出口通道ⅱ通入氟油，以20μl/min的流速冲刷至少5min，置换thz超结构信号检测模块内的水层；

(7)关闭阻隔阀门ⅱ，打开红外线发射器激发纳米颗粒产生局域表面等离子体共振并进行thz波检测。

检测结果如图8所示，结果显示，随着mda-mb-231细胞悬液浓度的增大，共振峰频率位移值依次增大，细胞浓度与共振峰频率位移值成正相关。太赫兹超结构纳米生物芯片可实现不同浓度梯度(10-10⁵cell/ml)细胞悬液的定量检测，灵敏度为10cell/ml，达到适用于mda-mb-231细胞检测的检测灵敏度。

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。