一种固态通量培养装置及其应用的制作方法

本发明涉及一种固态通量培养装置及其应用，尤其涉及一种适用于丝状真菌的固态通量培养装置及其应用，属于固态培养发酵技术领域。

背景技术：

丝状真菌是属于耗氧类微生物，由于能够分泌丰富的胞外蛋白和次级代谢产物，而广泛应用于发酵食品、酶、色素、抗生素、有机酸和风味化合物的生产。对于丝状真菌的产物利用，主要是采用固态发酵和液体深层发酵技术。固态发酵是一种接近丝状真菌自然生长状态的发酵，能够耐受高浓度的营养盐，在含水量低的基质中生长迅速，染菌概率小，且以菌丝形式生长、不易孢子化，能够深入到料层中、穿入基质细胞内，有完整的酶系、可以利用多糖混合物，因此与液态深层发酵相比，能够获取更多的发酵产物。目前对于丝状真菌的固态发酵研究，主要集中在底物优化和菌种选育。底物优化是对固态发酵的工艺进行优化改造，以获得产品质量的提升；菌种选育是通过对生产菌株进行自然、化学、物理等方式进行诱变，以获得能够在固态发酵中提升产品质量的优良性状的目标菌株。但由于菌株突变的随机性以及后续筛选以及培养过程繁琐，往往导致菌种选育研究难度要远超过底物优化。传统的丝状真菌菌株选育过程，往往要经历多个步骤完成，在前期的筛选阶段主要借助固体琼脂平板以及结合显色底物和透明圈的方式，进行菌株的初步筛选。在后期的复筛过程，基本都是模拟正常工业生产培养基进行发酵应用和验证，在这个过程中通常采用三角瓶或小型曲盘固态曲料进行发酵分析，同时在固态培养过程中为了保证曲料充分混匀发酵，还要定时的进行多次三角瓶摇曲以及对曲盘进行翻曲操作；在后期进行固态发酵产物分析时，需要将曲料进行称重取出，浸提，并单独进行产物分析，整个过程工作量大、操作繁琐，不能实现丝状真菌菌种培养和筛选的通量化。而且三角瓶的固态发酵过程中还不能实现通气和湿度的可控，往往会造成三角瓶的发酵结果与实际固体的结果存在较大的偏差。

现有技术中，一种产阿维菌素高产菌的高通量筛选方法(201410562842.6)、一种好氧菌高产菌株的高通量筛选方法(201110197663.3)、一种红曲色素高产菌株的高通量筛选方法(201210393517.2)主要是从液态培养的角度来对好氧菌，包括放线菌和丝状菌进行液态通量培养，并结合酶标仪对发酵产物进行。丝状菌高通量筛选的悬浮培养方法(200910227839.8)是通过在液态培养基的基础上通过加入悬浮材料以及加入凝固剂的方式实现丝状菌的通量筛选培养，是液态培养的改进。一种固体发酵培养装置及方法(201510012258.8)、一种微生物固态制种及发酵装置(201310466186.5)、一种使用微生物固态培养装置进行微生物固态培养的方法(201310717824.6)、一种利用固态营养基质悬浮液培养丝状真菌的方法(00103542.8)是较为大型的固态培养装置，这些装置可以实现丝状真菌的大体积和大容量的固态培养或悬浮培养，但是不能实现固态培养的通量化和检测的通量化。一种高通量植物固液培养装置(201520663789.9)是针对植物进行液体、固体，半固体的高通量培养装置，该装置是基于离心管的基础上进行设计，所应用的主要是植物的培养。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种固态通量培养装置及其应用，该装置能实现通量筛选培养。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种固态通量培养装置，其包括培养板和设于所述培养板上的板盖；所述培养板包括培养板本体，所述培养板本体上设有多个培养孔，各个所述培养孔的内底部均设有与培养孔尺寸相匹配的多层纱布；各个所述培养孔的底部中间还开设有第一通孔，所述第一通孔内穿插有与第一通孔相匹配的鲁尔接头，所述鲁尔接头的接口位于所述培养板本体的外部；

所述板盖上设有多个第二通孔，所述第二通孔的分布位置与所述培养孔相一致。

本发明的固态通量培养装置采用了具有多孔的培养板，能在固态培养基上实现培养的通量化，对具有优势的产物进行通量筛选培养，具有明显的指向性。本发明的装置尤其适用培养耗氧性丝状真菌，且克服了传统丝状真菌固态发酵和菌种筛选培养过程中工作量大、操作繁琐，不能实现培养通量化的缺点。发明名称为“一种高通量植物固液培养装置”(申请号：201520663789.9)的专利申请虽然也涉及高通量培养，但其针对的对象是植物，与本发明针对的对象是有很大差别的，植物是进行光合作用，需要保证充足的二氧化碳，而丝状真菌是需要保证充足的氧气，需要保证充分的通气和加湿，而且丝状真菌的生长周期短。

本发明的装置不仅筛选培养的通量强大，而且还能结合排枪和酶标仪实现检测上的通量化。

进一步地，所述培养孔为24个；各个所述培养孔的内底部均设有2～8层纱布。在培养孔的内底部设置纱布，这样可以放置和支撑固态培养基。

进一步地，各个所述培养孔的内底部均设有4～6层纱布。

进一步地，所述板盖包括内衬，所述内衬为多层纱布；优选地，所述内衬为4～10层纱布。更优选地，所述内衬为6～8层纱布。如此可以透气、保温和隔菌，且纱布的尺寸应稍小于板盖。并且，这样还可以保证固态发酵过程中的顺畅透气、散热，也可以防止空气过快流通，导致曲料水分流失大于补充，板盖上设有通孔和纱布内衬这样的组合方式能够使固态发酵保持在一个恒定温度、湿度的培养环境，有利于固态发酵稳定进行。

进一步地，所述板盖的内侧设有卡扣，所述板盖通过所述卡扣与所述培养板本体卡接。采用带有卡扣的板盖，这样更便于板盖固定。

进一步地，还包括依次连接的空气输送单元、空气过滤器、空气加湿单元和空气分散单元，所述空气分散单元的出气口与所述鲁尔接头的接口连通。本发明的固态通量培养装置进一步采用空气输送单元、空气过滤器、空气加湿单元和空气分散单元后，便于控制通入培养板的空气的通气量大小、温湿度以及均匀性，克服了发酵过程的通气和湿度参数不可控等缺点。其中，空气分散单元用于气体的均匀分散和分流。

进一步地，所述空气输送单元包括空气输送单元本体，所述空气输送单元本体上设有空气流量调节开关和至少四个空气出口。

进一步地，所述空气输送单元上设有4～6个空气出口。

进一步地，所述空气过滤器包括过滤器本体、密封于所述过滤器本体内的滤膜以及设于所述过滤器本体上的进气端和出气端，所述空气过滤器的进气端与所述空气输送单元的空气出口连通。

进一步地，所述空气加湿单元包括装液瓶和设于所述装液瓶内的空气分散头，所述装液瓶的瓶口上盖合有封口盖，所述封口盖上开设有两个第三通孔，两个所述第三通孔内均穿插有中空直管，分别为进气管和出气管；所述进气管的一端与所述空气过滤器的出气端连通，所述进气管的另一端与所述空气分散头连通。空气分散头可将空气引入装液瓶内进行分布，空气分布头可以为圆柱形、圆环形，其规格与瓶子的内部结构相匹配。

进一步地，所述空气分散单元包括空气分散本体，设于所述空气分散本体上的进气口和出气口，所述出气口为12个、24个或48个；所述空气分散本体的进气口与所述空气加湿单元的出气管连通。

使用本发明的固态通量培养装置时，可将其置于温度为18-50℃恒温环境中，进行恒温培养。

本发明还提供了上述固态通量培养装置在培养丝状真菌中的应用。本发明的固态通量培养装置适用于高耗氧、并且固态培养产物量优于液体培养的丝状真菌发酵，其中，丝状真菌优选为米曲霉、黑曲霉、李氏木霉、根霉。本发明的装置用于培养丝状真菌时，所用培养基的原料可以为黄豆、豆粕、麸皮、米糠、谷壳、豆渣、玉米秸秆、小麦秸秆、小麦粉等天然的有机碳源或氮源，并根据培养丝状真菌的类型不同，选择不同的原料进行组合配比组成适合该类丝状真菌生长和产物分泌的培养基，其中要求培养基的含水量(w/w)控制在65-140％范围，孔板中的装料量(干料)为0.3-0.8g/孔。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

(1)本发明的固态通量培养装置采用了具有多孔的培养板，能在固态培养基上实现培养的通量化，对具有优势的产物进行通量筛选培养，具有明显的指向性。该装置在实际应用中能够实现在丝状真菌固态培养结果与实际生产发酵应用的结果具有很高的吻合度。

(2)本发明首次将微孔板进行改造后引入到丝状真菌进行小型固态通量培养发酵应用，并且取得了良好的应用效果。由于在小型固态通量培养中孔板装料量较少、较薄，无需像三角瓶或曲盘固态曲培养，需要通过搅拌或翻曲来实现气体交换和散热。因此在小型固态通量培养的过程中不需要对发酵的曲料进行搅拌翻动，就能实现曲料空气的良好循环和热量的快速散失，这样可以减少工作量，实现菌株复筛中的通量培养。

(3)板盖上设有通孔和纱布内衬，如此可以透气、保温和隔菌，且纱布的尺寸应稍小于板盖。并且，这样还可以保证固态发酵过程中的顺畅透气、散热，也可以防止空气过快流通，导致曲料水分流失大于补充，这样的组合方式能够使固态发酵保持在一个恒定温度、湿度的培养环境，有利于固态发酵稳定进行。

(4)本发明的固态通量培养装置进一步采用空气输送单元、空气过滤器、空气加湿单元和空气分散单元后，便于控制通入培养板的空气的流速、温湿度、均匀性，克服了发酵过程的通气和湿度参数不可控等缺点。

(5)在后续的分析过程中，只需要将通气管路从鲁尔接头的接口拔出，同时装上鲁尔堵头，并在培养板的培养孔中加入相同体积的浸提液，放入孔板振荡器振荡，就能实现固态发酵产物的浸提，同时结合排枪以及酶标仪或其它的自动化检测设备可实现后续的参数通量化操作分析，提高菌株的筛选速度，提高了工作效率。

附图说明

图1为本发明实施例1固态通量培养装置的结构示意图；

图2为本发明实施例1培养板的结构示意图；其中，a为培养板的主视图；b为培养板的底部视图；

图3为本发明实施例1板盖的结构示意图；

图4为本发明实施例1空气输送单元的结构示意图；

图5为本发明实施例1空气过滤器的结构示意图；

图6为本发明实施例1空气加湿单元的分解图；其中，a为装液瓶；b为包括封口盖、空气分散头、进气管、出气管和进气管道的气体进出部件；

图7为本发明实施例1空气分散单元的结构示意图；

图8为采用本发明固态通量培养装置对米曲霉发酵的曲料形态图。

其中，1、空气输送单元；2、空气输送单元本体；3、空气流量调节开关；4、空气出口；5、第一通气管道；6、空气过滤器；7、进气端；8、滤膜；9、出气端；10、第二通气管道；11、空气加湿单元；12、装液瓶；13、封口盖；14、进气管；15、进气管道；16、空气分散头；17、出气管；18、第三通气管道；19、空气分散单元；20、空气分散本体；21、进气口；22、出气口；23、第四通气管道；24、培养板；25、培养板本体；26、鲁尔接头的接口；27、板盖；28、培养孔；29、鲁尔接头；30、第二通孔。

具体实施方式

为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明进一步说明。

本发明所使用的主要原料，如无特殊说明，均为常规的市售产品；本发明所使用的检测方法，如无特殊说明，均为本技术领域的国家标准方法。

实施例1

如图1、图2和图3所示，本发明实施例的一种固态通量培养装置，包括培养板24和设于培养板24上的板盖27；培养板24包括培养板本体25，培养板本体25上设有多个培养孔28，各个培养孔28的内底部均设有与培养孔28尺寸相匹配的多层纱布；各个培养孔28的底部中间还开设有第一通孔，第一通孔内穿插有与第一通孔相匹配的鲁尔接头29，鲁尔接头29的接口26位于培养板本体25的外部；板盖27上设有多个第二通孔30，第二通孔30的分布位置均与培养孔28相一致。

本发明的固态通量培养装置采用了具有多孔的培养板24，能在固态培养基上实现培养的通量化，对具有优势的产物进行通量筛选培养，具有明显的指向性。本发明的装置尤其适用培养好养性丝状真菌，且克服了传统丝状真菌固态发酵和菌种筛选培养过程中工作量大、操作繁琐，不能实现培养通量化的缺点。本发明的装置不仅筛选培养的通量强大，而且还能结合排枪和酶标仪实现检测上的通量化。

上述培养板本体25和培养孔28的尺寸、形状均可根据实际需要进行选择，在本实施例中，培养板本体25长125mm、宽83mm、高45mm；培养孔28为为24个，其形状为方形，边长为17mm。当然，培养板本体的底部也可以为圆形平底、梯形或u形；培养孔的形状还可以为圆形，其直径可选择17mm。上述第一通孔是采用打孔工具在培养孔28的底部中间打出的孔径为1.6-4.8mm的圆孔，其孔径优选为3-6mm，鲁尔接头29与第一通孔之间的空隙采用耐121℃长时间高压湿热灭菌的胶水进行密封和固定。

为了放置和支撑固态培养基，各个培养孔28的内底部均设有2～8层纱布；优选地，各个培养孔28的内底部均设有4～6层纱布。其中，纱布还能防止固态物料掉入鲁尔接头29的接口26并堵塞鲁尔接头29的接口26，方便对固态培养进行均匀的通气培养，当然，纱布的尺寸须与培养孔28的孔径匹配。

为了透气、保温和隔菌，板盖27包括内衬，内衬为多层纱布；优选地，所述内衬为4～10层纱布；更优选地，所述内衬为6～8层纱布。板盖27上设有第二通孔30和纱布内衬，这样的组合方式还可以保证固态发酵过程中的顺畅透气、散热，也可以防止空气过快流通，导致曲料水分流失大于补充，保持一个恒定温度、湿度的培养环境，有利于固态发酵稳定进行。另外，纱布内衬还能阻止外面的带菌空气进入到培养孔28。

本实施例中，板盖27为长128mm、宽为86mm、高10mm的不锈钢板盖，为了更方便地固定板盖27，板盖27的内侧设有突起卡扣，板盖27通过突起卡扣与培养板本体25卡接。当然，板盖的尺寸和材质可以根据实际需要进行选择，而不限于本实施例的规格。

进一步地，第二通孔30的孔径为3-6mm，优选为3-4mm。本实施例中，板盖27上设有48个第二通孔30，板盖27上与各培养孔28对应的位置均设有两个第二通孔30。当然，板盖上与各培养孔对应的位置所设置的第二通孔的数量不限于2个，也可以是1个或者多个，第二通孔的数量可根据培养要求进行设计。

进一步地，如图1所示，本实施例的固态通量培养装置还包括依次连接的空气输送单元1、空气过滤器6、空气加湿单元11和空气分散单元16，空气分散单元16的出气口22与鲁尔接头29的接口26通过塑料或硅胶材质的第四通气管道23连通。第四通气管道23的长度控制在10cm-30cm，优选为20-25cm；其内径为1-10mm，优选为2-5mm。进一步采用空气输送单元1、空气过滤器6、空气加湿单元11和空气分散单元16后，便于控制通入培养板24的空气的通气量大小、温湿度以及均匀性，克服了发酵过程的通气和湿度参数不可控等缺点。其中，空气分散单元16用于气体的均匀分散和分流。

进一步地，如图4所示，空气输送单元1包括空气输送单元本体2，空气输送单元本体2上设有空气流量调节开关3和四个空气出口4。其中，空气输送单元1优选为增氧泵或是空气压缩机；空气出口的数量可以根据实际需要进行选择，其至少是四个，优选为4～6个空气出口。空气输送单元1可以对空气进行压缩，并且可以进行空气流量大小的调节，最大空气流量可达5m³/h，优选为0.3-2m³/h。

如图5所示，空气过滤器6优选为膜过滤器，其包括过滤器本体、密封于过滤器本体内的滤膜8以及设于过滤器本体上的进气端7和出气端9，如图1所示，空气过滤器6的进气端7与空气输送单元1的空气出口4通过塑料或硅胶材质的第一通气管道5连通。

本实施例中，滤膜8的孔径优选为0.22μm，其材质为尼龙膜、混合纤维素膜、聚四氟乙烯膜、聚醚砜膜、聚偏二氟乙烯膜、聚丙烯膜或醋酸纤维素膜，优选为聚醚砜膜或聚四氟乙烯膜；并且根据滤膜的性质可以采用121℃高压湿热灭菌或辐照灭菌进行无菌处理，优选为121℃高压湿热灭菌。本实施例中的空气过滤器6，其除了滤膜8以外，其他部件的材质可以为玻璃、不锈钢或塑料，优选为耐121℃高压湿热塑料材质。并且，第一通气管道5内径控制在1-10mm，优选为2-5mm；长度控制在5-50cm，优选为10-30cm。

进一步地，如图6所示，空气加湿单元11包括装液瓶12和设于装液瓶12内的空气分散头16，装液瓶12的瓶口上盖合有封口盖13，封口盖13上开设有两个第三通孔，两个第三通孔内均穿插有中空直管，分别为进气管14和出气管17；如图1所示，进气管14的一端与空气过滤器6的出气端9通过塑料或硅胶材质第二通气管道10连通，将空气导入装液瓶12中进行空气加湿，进气管14的另一端通过进气管道15与空气分散头16连通，空气分散头16可将空气引入装液瓶12内进行分布。

上述空气加湿单元11所用的材质为耐121℃高压湿热灭菌的不锈钢、塑料、玻璃以及硅胶等材质。装液瓶12的材质优选为耐121℃高压湿热灭菌的塑料或玻璃；其装液量为500-5000ml，优选为500-2000ml；在使用过程中可通过调节通气量和装液量来调控湿度，装液量优选为在瓶身的1/2-3/4处。装液瓶12的瓶口为圆柱形的广口或螺旋口，优选为螺旋口。封口盖13可以为瓶塞或内螺旋瓶盖，优选为螺旋盖。第三通孔是采用打孔工具在封口盖13上打出的直径为1-10mm的圆孔，其直径优选为3-7mm。在第三通孔中插入的中空直管，其长度为1-4cm，优选为1-2cm；外径为4-9mm，优选为3-6mm；内径为2-8mm，优选为2-5mm；材质优选为耐121℃高压湿热灭菌的不锈钢或塑料。并且中空直管在瓶盖两端的留长一致，其与第三通孔的间缝隙使用耐121℃高压湿热灭菌的胶水进行密封和固定。上述进气管道15的长度为8-30cm，优选为11-20cm；内径为2-8mm，优选为2-5mm；其材质为塑料或硅胶管。空气分散头16可以为圆柱形、圆环形，优选为圆柱形，其规格与瓶子的内部结构相匹配。第二通气管道10的内径为1-10mm，优选为2-5mm；长度控制在10-80cm，优选为20-40cm。

进一步地，如图7所示，空气分散单元19包括空气分散本体20，设于空气分散本体20上的进气口21和出气口22，出气口22为24个；空气分散本体20的进气口21与空气加湿单元11的出气管17通过塑料或硅胶材质的第三通气管道18连通。

上述空气分散单元19用于气体的均匀分散和分流，所用材质可以为耐121℃高压湿热灭菌的塑料、玻璃或不锈钢，优选为耐121℃高压湿热灭菌的塑料。其中，空气分散本体20的长度为10-50cm，优选为20-30cm；内径为5-30mm，优选为15-25mm。进气口21的内径为5-10mm，优选为2-5mm；出气口22的内径为1.6-5mm，优选为1-5mm；壁厚为1-2mm，优选为1-1.5mm。出气口的数量不限于24个，还可以为12个或48个，且每个出气口的出气量是保持相同的流量和流速。第三通气管道18的内径为1-10mm，优选为2-5mm；长度控制在30cm-200cm，优选为30-50cm。

使用本实施例的固态通量培养装置时，可将其置于温度为18-50℃恒温环境中，进行恒温培养。使用时，空气输送单元1通过空气输送单元本体2对空气进行加压，产生加压空气流的同时通过空气流量调节开关3对产生的加压空气的流量和流速进行调节，以获得满足实验需求的空气流，并从空气输送单元1的空气出口4排出。第一通气管道5将加压空气从空气出口4导入空气过滤器6的进气端7，空气通过无菌的滤膜8进行过滤除菌，这样就产生了一定流量和流速并用于实验的无菌空气。无菌空气通过第二通气管道10，从空气过滤器6的出气端9与空气加湿单元11的无菌空气进气管14导入空气输送单元11中，进行空气加湿处理。在进行空气加湿时空气加湿单元11的装液瓶12装有一定体积的无菌水(水的装量体积根据固态发酵的培养时间和需求湿度而定)，装液瓶12通过封口盖13进行封口，以保证与通气管道形成一个密封的无菌环境，进入到装液瓶12中的无菌空气进气管道15导入到空气分散头16(分散头的大小根据固态发酵的培养时间和需求湿度而定)，无菌空气通过空气分散头16分散在无菌水中之后，就成为无菌加湿空气。第三通气管道18将从空气加湿单元11产生的加湿空气通过出气管17与空气分散单元19的无菌进气口21导入到空气分散单元19中，无菌加湿空气进入到空气分散单元19之后，通过空气分散本体20进行均匀分散(相同的流量和流速)，为培养板24不同培养孔28固态培养提供相同的加湿通气条件。第四通气管道23将从空气分散单元19分散的空气通过出气口22与鲁尔接头29的接口26导入到培养板24中进行固态培养。

上述无菌，是指经过121℃20min蒸汽灭菌或者是其他方式灭菌获得，同时不同部件之间的连接也都是在无菌的环境(例如紫外照射后的超净工作台)中组装而成。

实施例2

本实施例采用本发明固态通量培养装置对米曲霉酱油发酵中所用曲料进行发酵。

(1)实验装置

本实施例采用的固态通量培养装置的结构同实施例1，固态通量培养装置中部件的规格如下：

空气输送单元：空气输送单元为市售购买的增氧泵，可调节空气流量的大小，最大流量达到5m³/h，同时具有4个出气口，本次试验的通气流量控制为：在11小时之前通气量为0.3m³/h，在11小时到17小时之间通气量为0.8m³/h，在17小时到发酵结束通气量控制在1m³/h。

空气过滤器：为市售常见的pp塑料空气过滤器。滤膜的孔径为0.22μm，滤膜的材质为聚醚砜膜。

空气加湿单元：装液瓶为市售1000ml的螺旋口蓝盖瓶，装水量达到瓶身的3/4位置；封口盖是与蓝盖瓶配套使用的耐121℃高压灭菌pp塑料材质的螺旋口盖，并且用打孔工具在瓶盖上打出两个直径为6mm的圆孔，在两个圆孔中各插入一根长度为2cm、外径5mm、内径4mm的耐121℃高压蒸汽灭菌硬质pp塑料材质中通直管，并且该管两端的留长一致，该管与孔洞间缝隙使用耐121℃高压灭菌的胶水进行密封和固定。使用长度为20cm、内径为4mm的硅胶管将封口盖上进气管与空气分散头连接。空气分散头为不锈钢材质的多孔的(表面分布着直径0.1mm的圆孔80个)中空圆柱体性状，圆柱体高3cm、底面直径1.5cm，在一个底面上有一个突出的长度0.5cm、外径5mm、内径4mm的中空管，该中空管用于连接硅胶管。

空气分散单元：所用材质为耐121℃高压湿热灭菌pp塑料，空气分散本体长度为30cm，内径为25mm，壁厚为1mm；进气口的内径为4mm，壁厚为1mm，出气口的内径为2mm，壁厚为1mm，出气口的个数为24个，且每个出气口的出气量是保持一致的流量和流速。该部件由本公司设备部协助制作。

培养板和板盖：培养板为耐121℃高压湿热灭菌pp塑料制作的24孔板，规格为长125mm宽83mm高45mm，方形孔梯型底，其中培养孔的边长17mm，在24孔的底部中间位置，用打孔工具打出孔径大小为3mm的第一通孔。同时所用的鲁尔接头配备有对应尺寸的堵头对鲁尔接头进行旋紧密封。通过塑料或硅胶材质的第四通气管道将鲁尔接头的接口和与上述空气分散单元的出气口进行连通，同时在培养孔的底部加入与培养孔孔径大小对应的4层纱布，用于固体培养基的放置和支撑。板盖为48孔不锈钢板盖(板盖上与各培养孔对应的位置均设有两个第二通孔)，板盖上48孔的孔径为3mm，板盖的规格为长128mm、宽为86mm、高10mm；在48孔不锈钢板盖的内侧放入一块8层的纱布，其规格稍小于板盖，用于透气和无菌培养。该装置是由江苏省常州英德生物科技有限公司靳魁奇根据本发明的设计辅助制作完成。

上述5个关键部件通过通气管道相连组合成一种适用于丝状真菌小型固态通量培养装置。通气管道为市售硅胶管，通气管道的内径控制为3mm。其中，连接空气输送单元和空气过滤器的通气管道为硅胶管，长度为20cm；连接空气过滤器和空气加湿单元的通气管道为硅胶管，长度为30cm；连接空气加湿单元和空气分散单元的通气管道为硅胶管，长度为30cm；连接空气分散单元和培养板的通气管道为硅胶管，长度为20cm。

本装置中除了空气输送单元，其它所用部件都需要经过121℃20min蒸汽灭菌，并且在紫外线照射后的超净工作台中进行无菌组装。

(2)实验材料与方法

采用本发明固态通量培养装置发酵米曲霉酱油发酵中所用曲料的实验材料与方法如下：

培养基：将黄豆和炒小麦按照黄豆：炒小麦＝7：3进行混合配比，拌水为120％，拌料混匀后静止放置2小时后，121℃高压灭菌的20min后，冷却分装到固态通量培养装置的培养孔中，按照0.5g干料/孔在无菌条件下进行称重分装。500ml的三角瓶的装量为15g干料/瓶。

培养条件：将在豆汁培养基(豆汁培养基包括下述含量的组分：豆汁(4-5°be’)，可溶性淀粉2％(w/v)，磷酸二氢钾0.1％(w/v)，硫酸镁0.025％(w/v)，硫酸铵0.05％(w/v)，琼脂粉1.5％(w/v)，ph值为6.5。)上培养3天的沪酿3.042菌种使用无菌生理盐水洗脱孢子后，接种到固态曲料培养基，接种量控制在10⁷个孢子/克干曲料，丝状真菌小型固态通量的培养装置整体放置在30℃恒温环境中进行培养，培养时间44小时。本次试验的通气流量控制为：在11小时之前通气量为0.3m³/h，在11小时到17小时之间通气量为0.8m³/h，在17小时到发酵结束通气量控制在1m³/h。500ml的三角瓶同样放入30℃恒温环境中，进行培养，并在11小时摇瓶1次，17小时摇瓶1次，25小时摇瓶1次，培养时间44小时。

固态通量发酵酶液的获得：固态发酵结束后，拔下与鲁尔接头的接口连接的通气管道，并将培养孔的每个接口使用鲁尔堵头进行封闭，并将固态培养孔板放入自制固态孔板适配器中(将未经过改造的孔板从孔板中间截断后，可使固态培养装置正常放置和进行其它的实验操作，例如离心等)并加入5ml的0.85％的生理盐水，在40℃条件下，700rpm振荡抽提2小时，4000rpm离心20min，收集上清。

三角瓶发酵酶液的获得：固态发酵结束后，称取1g曲料，加入10ml的0.85％的生理盐水，在40℃条件下，在200rpm振荡抽提2小时，使用纱布过滤获取发酵酶液

中性蛋白酶活力检测方法：三角瓶固态发酵蛋白酶活力检测参照中华人民共和国专业标准蛋白酶活力测定法(sb/t10317-1999)进行蛋白酶测定，固态通量发酵同样是参照中性蛋白酶国标测定体系，只是按照比例缩小后，可适用于96孔酶标板(美国corning公司)的微量反应体系，结合8孔多通道排枪(德国eppendrof公司)和酶标仪(德国bertholdtristarlb941)进行通量化检测。同时酶活测定都需要对获得发酵浸提酶液进行30倍稀释。

(3)实验结果分析

固态发酵结束后，进行曲料培养状态观察和中性蛋白酶测定，固态培养得到的曲料的形态曲香味正常(如图8所示)，同时对固态发酵进行酶活测定，孔板固态培养酶活力能够达到2365.11u/g(24孔的平均值，如表1所示)，相对标准偏差小于5％，说明稳定性良好，并且通过3次以上的重复发酵分析，酶活力能保持在2390.52±100.31u/g左右。将沪酿3.042分别进行了三角瓶固态曲发酵和65t的工业化圆盘制曲发酵，每种方式重复3批次以上平行发酵，44小时发酵结束后按照国标进行中性蛋白酶活力进性测定，发现三角瓶固态曲发酵酶活的中性蛋白酶活力为1705.67±181.65u/g，工业化圆盘制曲发酵中性蛋白酶活力为2338.22±200.89u/g(圆盘制曲数据是来源于本公司米曲霉沪酿3.042长期酱油工业生产中的实验数据)。通过上述结果说明孔板培养稳定性好，同时发酵结束后的酶活与实际圆盘生产应用有很好的吻合性，而三角瓶制曲发酵无论是从酶活稳定性以及对应性都比孔板固态培养的效果差。同时对于小型固态发酵培养的中性蛋白酶活力的检测，我们同时采用了排枪和酶标仪结合的通量检测方法，极大地提高了酶活检测效率，实现了培养和检测的通量化。

表1

实施例3

本实施例将发明的固态通量培养装置应用于米曲霉酱油发酵高产蛋白酶菌种的筛选中。本实施例以米曲霉沪酿3.042为出发菌，使用artp对孢子悬液进行诱变处理(孢子致死率在80％的条件)，并将诱变处理的孢子按照一定的比例稀释涂布到酪蛋白平板培养基(培养基配方：干酪素1％，磷酸二氢钾0.05％，硫酸镁0.05％，磷酸氢二钠0.1％，琼脂粉1.5％，ph6.7。)进行培养筛选。选取在培养基平板上面菌落生长好、菌丝生长旺盛、透明圈直径大的菌落为目标菌落，转接斜面培养，成熟后进行菌种保藏。经过多次传代之后挑取形状稳定的24菌(包括米曲霉沪酿3.042作为对照菌)，在实施例2所述的固态通量培养装置上进行进一步的固态培养验证，接种量孢子为一次性10ul的接种环一环，每个菌进行3次重复验证。

经过小型固态通量培养装置的进一步筛选确认23株使用酪蛋白平板培养基的筛选的突变菌株的中性蛋白酶活力均高于出发菌沪酿3.042(如表2所示)。并且通过本发明装置确认其中的h4菌株的中性蛋白酶活力最高能够达到5102.33±220.77u/g。

表2

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。