本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种睾丸酮丛毛单胞菌hhala-001及采用该菌株生产l-丙氨酸的方法。
背景技术：
l-丙氨酸是生命体内与糖代谢密切相关的氨基酸之一，在食品和医药领域有着广泛的用途，市场需求量很大。目前，l-丙氨酸的生产方法一般有蛋白水解提取法、发酵法和酶转化法。其中，酶转化法是指通过富有l-天冬氨酸-β-脱羧酶活力的微生物细胞催化l-天冬氨酸，以得到l-丙氨酸。由于酶转化法具有生产成本低、生产过程简单、产品收率和纯度高等优势而在工业上被广泛应用。现有技术中，虽然已有可转化l-天冬氨酸的菌株，但却存在酶活不够，l-丙氨酸的转化率及转化效率低下等问题。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种睾丸酮丛毛单胞菌hhala-001及采用该菌株生产l-丙氨酸的方法，通过该菌株可大幅度提高l-丙氨酸的转化率和转化效率。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种睾丸酮丛毛单胞菌(comamonastestosteroni)hhala-001，该菌株已于2017年4月24日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为：cgmccno.14064。
睾丸酮丛毛单胞菌hhala-001是从生产l-天冬氨酸的排污沟中取样，经分离活化、复合诱变、反复筛选得到的一株革兰氏阴性细菌。
形态特征：菌株在30℃下，na培养基上培养24小时后，菌落浅黄色，圆形，表面凸起，湿润，半透明，边缘整齐。菌体呈杆状，大小为(0.3-0.5)um×(0.8-1.8)um，细胞单个或成对排列，通过革兰氏染色后在显微镜下呈阴性。
生理生化特征：琥珀酸盐产碱、络氨酸芳胺酶、吡咯烷基芳胺酶、乳酸盐产碱反应结果为阳性。
根据其形态特征和生理生化特征，鉴定该菌株为睾丸酮丛毛单胞菌(comamonastestosteroni)hhala-001。
该菌株可用来转化l-天冬氨酸以生产l-丙氨酸，在实际应用中，该菌株能以自身发酵液为酶源，转化l-天冬氨酸，得到l-丙氨酸。
上述技术方案产生的有益效果在于：本发明通过复合诱变、反复筛选获得上述睾丸酮丛毛单胞菌hhala-001，该菌株酶活高，可达到11.80u～12.22u(其中酶活单位u定义为：单位体积发酵液在单位时间内生成l-丙氨酸的量，单位为μmol/min/ml。)，可高效表达l-天冬氨酸-β-脱羧酶，用于催化l-天冬氨酸生产l-丙氨酸，可大幅度提高l-丙氨酸的生产效率和转化率，有助于降低生产成本，且稳定性较好。经使用后，l-天冬氨酸的转化率可达99.9％。本发明完全符合工业l-丙氨酸菌株的诱变和筛选需求，可应用于工业化生产，具有重大的经济价值。
具体实施方式
本发明提供一种睾丸酮丛毛单胞菌hhala-001，菌株的获得过程及生产l-丙氨酸的方法如下：
一、睾丸酮丛毛单胞菌hhala-001的获得
(一)分离和筛选方法包括如下步骤：
(1)从生产l-天冬氨酸的车间的排污沟中采集污泥样本；
(2)准备无菌平板，倒入选择培养基，备用；
(3)对污泥样本进行干燥处理，称取1g土样，加入9ml无菌水，逐步稀释106、107、108倍，每个梯度涂布3个平板；
(4)每个平板做好标记，置于30℃下，恒温培养24h；
(5)观察单菌落的生成以及变色圈形成情况，挑取变色圈大的单菌落接到50ml(250ml三角瓶)种子培养基中进行富集培养；
(6)将挑选出的单菌落接入摇瓶培养基中，培养24h，进行活化；
(二)紫外-激光复合诱变方法包括如下步骤：
(1)诱变：取1ml活化菌悬液，加入9ml无菌水，逐步稀释104倍，取3ml于平皿中，紫外照射90s，激光照射40min；
(2)初筛：诱变后的菌株涂布在选择培养基上形成单菌落，经过24h的培养，菌落在产酶过程中会在周围形成变色圈，挑取变色圈菌圈比较大的菌落进行摇瓶复筛；
(3)复筛：将初筛得到的正突变株分别接到50ml(250ml三角瓶)种子培养基中进行种子扩大培养，种子培养结束后，按照10％的量将种子液接到50ml发酵液中(250ml三角瓶)，在30℃、150r/min的情况下培养24h，hplc测定发酵液中酶活力的大小；
(4)重复(1)、(2)、(3)步骤，最终得到高产l-丙氨酸的菌株；
(5)对此高产l-丙氨酸菌株进行鉴定，确定为睾丸酮从毛单胞菌。
上述步骤中所用到的培养基配方如下：
选择培养基的组成成分如下：鱼肉胨1％，牛肉膏0.5％，nacl0.5％，琼脂2.1％，用naoh调到ph6.5斜面培养基添加0.6％的l-asp，再加入0.5％浓度的甲酚红指示剂，加入量为每100ml培养基中加入10～15滴；
种子培养基的组成成分如下：富马酸1％，naoh0.7％，鱼肉胨0.8％，玉米浆0.55％，mgso40.1％，kh2po40.05％，用naoh调到ph7.0；
摇瓶培养基的组成成分如下：富马酸1.5％，naoh0.7％，多肽朊1％，玉米浆0.55％，mgso40.02％，k2hpo40.01％，nh3·h2o调至ph6.5～7.0。
二、采用睾丸酮丛毛单胞菌hhala-001生产l-丙氨酸的方法
该方法包括如下步骤：
(1)在20～45℃下，将睾丸酮丛毛单胞菌hhala-001菌株均匀涂布在斜面培养基上恒温培养18～36h；
在25～45℃下，对睾丸酮丛毛单胞菌hhala-001菌株往复式摇床75～100rpm/回旋式摇床160～220rpm培养18～36h，得到发酵种子液；
(2)将发酵种子液接入发酵罐中，在转速为100～180rpm，风量15-45m3/h条件下发酵培养14-30h，发酵温度为20～45℃，罐压0.02～0.1mpa，获得游离细胞发酵液；
(3)直接向游离细胞发酵液中添加固体l-天冬氨酸，转化培养，然后经过过滤、浓缩、结晶、干燥得到成品l-丙氨酸。
上述步骤中所用到的培养基配方如下：
斜面培养基配方(g/l)：蛋白胨6.0～15.0，氯化钠3.0～7.0，酵母膏(粉)3.0～10.0，牛肉膏3.0～10.0，琼脂15～20.0；培养基的ph为7.0-7.2。
摇床培养基配方(g/l)：谷氨酸钠3.0～15.0，复合氮素2.0～12.0，玉米浆干粉3.0～12.0，七水硫酸镁0.05～0.5、磷酸氢二钾0.1～1.0，磷酸二氢钾0.2～0.8，富马酸0.5～5.0，硫酸铵0.5～2.0；培养基的ph为7.0-7.2。
发酵培养液配方(g/l)：复合氮素9.0～15.0，酵母膏0.5～3.0、玉米浆干粉3.0～15.0，谷氨酸钠5.0～30.0，七水硫酸镁0.05～0.3，硫酸铵0.5～2.0，一水柠檬酸0.5～3.0，磷酸氢二钾0.2～0.8，磷酸二氢钾0.1～1.0，富马酸0.5～5.0；培养液的ph为7.0-7.2。
睾丸酮丛毛单胞菌hhala-001菌株的活化培养可采用本领域常用的技术手段，将其培养至对数生长期即可。通常情况下采用透气摇瓶培养得到适量的种子培养液。如果需要大规模发酵培养，可将其再进行二级种子培养，得到菌活高、数量大的二级种子培养液，再转入发酵培养基中，进行发酵培养。发酵培养优选在可控ph、可控温度、可控转速和通气量的发酵容器中进行，优选容积为5-50l的发酵罐。种子培养基和发酵培养基均含有足够睾丸酮丛毛单胞菌hhala-001菌株生长所需的碳源、氮源以及微量元素。
为进一步说明本发明公开的技术方案，以下通过3个实施例来说明：
实施例1：
活化斜面培养基(g/l)：蛋白胨8.0，氯化钠5.0，酵母膏(粉)3.0，牛肉膏5.0，琼脂15，调节ph7.0-7.2。
摇瓶种子培养基(g/l)：谷氨酸钠15.0，复合氮素10.0，玉米浆干粉6.0，七水硫酸镁0.25，磷酸氢二钾0.2，磷酸二氢钾0.2，富马酸0.8，硫酸铵1.0，用氢氧化钠溶液调ph7.0-7.2。
发酵培养基(g/l)：复合氮素10.0，酵母膏1.0，玉米浆干粉4.0，谷氨酸钠12.0，七水硫酸镁0.1，硫酸铵0.8，一水柠檬酸2.0，磷酸氢二钾0.2，磷酸二氢钾0.5，富马酸1.0，用氢氧化钠溶液调ph7.0-7.2。
取睾丸酮丛毛单胞菌hhala-001斜面菌种一环接到斜面培养基上，30℃±1℃培养20h；再取菌种一环接到200ml摇瓶培养基(接种若干瓶)，180rpm，28℃培养24h。合并各瓶培养液，得到2l-5l种子培养液，接种到2吨发酵罐中，28℃，150rpm，通气量30m3/h培养24h，获得具有高l-天冬氨酸-β-脱羧酶活力的游离细胞培养液2m3，l-天冬氨酸-β-脱羧酶活力12.1u。以此培养液生物转化l-天冬氨酸生成l-丙氨酸，投入6.2吨l-天冬氨酸，32h生成l-丙氨酸4.14吨，转化率为99.9％。
实施例2：
活化斜面培养基(g/l)：蛋白胨14.0，氯化钠6.0，酵母膏(粉)8.0，牛肉膏8.0，琼脂20，调节ph7.0-7.2。
摇瓶种子培养基(g/l)：谷氨酸钠5.0，复合氮素5.0，玉米浆干粉10.0，七水硫酸镁0.25、磷酸氢二钾0.7，磷酸二氢钾0.7，富马酸4.5，硫酸铵1.5，用氢氧化钠溶液调ph7.0-7.2。
发酵培养基(g/l)：复合氮素14.0，酵母膏2.5，玉米浆干粉14.0，谷氨酸钠27.0，七水硫酸镁0.25，硫酸铵1.6，一水柠檬酸0.7，磷酸氢二钾0.8，磷酸二氢钾0.8，富马酸4.2，用氢氧化钠溶液调ph7.0-7.2。
取睾丸酮丛毛单胞菌hhala-001斜面菌种一环接到斜面培养基上，30℃±1℃培养20h，再取菌种一环接到200ml摇瓶培养基(接种若干瓶)，180rpm，32℃培养24h。合并各瓶培养液，得到2l-5l种子培养液，接种到2吨发酵罐中，32℃，150rpm，通气量30m3/h培养24h，获得具有高l-天冬氨酸-β-脱羧酶活力的游离细胞培养液2m3，l-天冬氨酸-β-脱羧酶活力11.73u。以此培养液生物转化l-天冬氨酸生成l-丙氨酸，投入1.5吨l-天冬氨酸，8h生成l-丙氨酸1吨，转化率为99.9％。
实施例3：
活化斜面培养基(g/l)：蛋白胨14.0，氯化钠6.0，酵母膏(粉)8.0，牛肉膏8.0，琼脂20，调节ph7.0-7.2。
摇瓶种子培养基(g/l)：谷氨酸钠5.0，复合氮素5.0，玉米浆干粉10.0，七水硫酸镁0.25、磷酸氢二钾0.7，磷酸二氢钾0.7，富马酸4.5，硫酸铵1.5，用氢氧化钠溶液调ph7.0-7.2。
发酵培养基(g/l)：复合氮素13.0，酵母膏3.0，玉米浆干粉12.0，谷氨酸钠25.0，七水硫酸镁0.25，硫酸铵1.6，一水柠檬酸0.8，磷酸氢二钾0.8，磷酸二氢钾0.8，富马酸3.5，用氢氧化钠溶液调ph7.0-7.2。
取睾丸酮丛毛单胞菌hhala-001斜面菌种一环接到斜面培养基上，30℃±1℃培养20h，再取菌种一环接到200ml摇瓶培养基(接种若干瓶)，180rpm，32℃培养24h。合并各瓶培养液，得到2l-5l种子培养液，接种到2吨发酵罐中，32℃，150rpm，通气量30m3/h培养24h，获得具有高l-天冬氨酸-β-脱羧酶活力的游离细胞培养液2m3，l-天冬氨酸-β-脱羧酶活力11.54u。以此培养液生物转化l-天冬氨酸生成l-丙氨酸，投入5.7吨l-天冬氨酸，30h生成l-丙氨酸3.7吨，转化率为97％。