一种缺陷性分支杆菌以及利用其制备去氢表雄酮的方法与流程

本发明涉及甾体类药物中间体的生产技术领域，具体涉及一种3β-羟基氧化酶系缺陷性分支杆菌以及利用该菌制备去氢表雄酮的方法。

背景技术：

去氢表雄酮(dehyroepiandrosterone，dhea)是一种c19类固醇载体化合物。化学名称为3β-羟基-雄甾-5-烯-17-酮，分子式c19h28o2，cas编号：53-43-0，分子量为288.43，结构式如下：

dhea是人体内血浆中含量最多的皮质类固醇激素。血清中dhea大部分以硫酸结合物(dhea-s)的形式存在，是人体肾上腺皮质网状层分泌的一种肾上腺激素硫酸dhea(dheas)的前体物质。二氢胆固醇在肾上腺皮质王状层细胞内经以细胞色素p450为主的酶系作用下转变为dhea、dhea经硫代激酶催化转化成dhea-s。大约90％血循环中dhea-s来自肾上腺皮质网状带。与其它甾体类激素不同，血浆中dhea及dheas随着年龄的增长浓度下降明显。研究证实，去氢表雄酮及其转化产物具有广泛生理活性，在美国、法国等已经开始将其用于临床。去氢表雄酮在抗肿瘤、保护中枢神经系统、调节等方面具有广泛的药理活性。而大量研究证明，dhea是人血浆中大量共存在的肾上腺甾体化合物、具有抗炎、抗增殖及抗抑郁等活性，其衍生物在动物实验中能促进免疫应答，而且具有很好的神经保护作用。

dhea作为中间体合成许多有重要生理活性的甾体化合物，具有抗衰老及蛋白同化作用。这类激素类药物的主要功能包括延缓衰老；增强体能；改善情绪和睡眠,提高记忆力；改善性功能,提高性欲；调节免疫系统功能,提高肌体免疫力；减肥作用；辅助癌症及其他疾病。但dhea的化学合成具有一定的难度，所以利用dhea为底物进行生物转化一直是人们研究的热点。

现有文献的去氢表雄酮的制备工艺大多采用化学工艺来合成，是先用植物甾醇发酵生产为4-雄烯二酮(4-ad)，然后利用化学方法得到去氢表雄酮。中国专利申请号为201110085711x、2016102462663、2015104163587、2013100974201、2012100380942、2009102730277、201210010445.9等文献，采用双烯醇酮为原料，分为3步化学反应完成。这类方法存在以下缺陷：(1)大多以苯或卤代烷为介质，毒性大，导致药品存在安全隐患；(2)原料价格昂贵，生产成本高；(3)制备步骤繁琐,且制备过程中使用有机溶剂导致产品纯度低,后期提纯操作繁琐,生产效率低。

在一定程度上,化学合成法的大力投资造就了只有先制备4-雄烯二酮(4-ad)、然后制备去氢表雄酮的方法的认识。中国专利申请201210038094和22016101251400中公开了利用4-ad制备去氢表雄酮的方法。即植物甾醇先发酵生产为4-ad，然后利用化学方法得到去氢表雄酮。这是现在研究利用植物甾醇制备去氢表雄酮的方法，其存在反应路线较长、多步反应使得去氢表雄酮的生产成本较大，且由于反应步骤多、各步损耗较大、总收率较小。中国专利申请201610439697.1报道以4-雄烯二酮为初始底物，依次进行化学法和酶法两步制得去氢表雄酮。采用了酮还原酶作为催化剂，使得制备步骤缩短，但同时在整个反应过程中辅酶和叔丁醇钾等原料的用量大，成本高。

直接利用微生物发酵转化制备去氢表雄酮的方法具有优势。中国专利201210316197中，提供了一种由植物甾醇发酵制备去氢表雄酮的方法。先将甾醇的3-羟基进行保护，然后用菌株mycobacteriumsp.nrrlb-3686进行发酵。但是，3-羟基进行保护后，不利于微生物发酵转化，导致产率低。中国专利申请201410414313通过基因敲除方法敲除耻垢分枝杆菌中3β-羟基类固醇脱氢酶编码基因msmeg_5228，利用重组菌种发酵转化植物甾醇生产去氢表雄酮的方法。我们比较了mycobacteriumsp.nrrlb-3683(antoniorodríguez‐garcíaetal.,journalofbiotechnology，224：64–65，2016)和耻垢分枝杆菌mc2155菌株的基因组(abhilashmohanet.al.,genomeannounc.2015,3(1):e01520-14)，发现两种菌种的基因组差异性很大，差异性大于40％。而且，工业上4-ad生产菌株mycobacteriumsp.nrrlb-3683中甾醇代谢途径的第一步并非完全由3β-羟基类固醇脱氢酶催化作用，还包括其他酶作用(antoniorodríguez‐garcíaetal.,journalofbiotechnology，224：64–65，2016)。另一方面，耻垢分枝杆菌降解植物甾醇支链的效率低，作为工业转化植物甾醇生产去氢表雄酮不具有优势。

技术实现要素：

基于上述问题，本发明的目的是提供一种3β-羟基氧化酶系缺陷性分支杆菌以及利用该菌制备去氢表雄酮的方法，提供了一种从植物甾醇制备去氢表雄酮的新的路径。

本发明采用如下技术方案：

一种缺陷性分支杆菌，其为3β-羟基氧化酶系缺陷性分支杆菌(mycobacteriumsp.dhea-1)，于2017年6月19日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为：cctccno：m2017348，保藏地址是中国武汉大学。

进一步的，所述3β-羟基氧化酶系缺陷性分支杆菌(mycobacteriumsp.dhea-1)由诱变株mycobacteriumsp.gtf-69筛选获得。

进一步的，所述3β-羟基氧化酶系由crispar/cas9基因敲除方法敲除。

一种利用上述缺陷性分支杆菌制备去氢表雄酮的方法，其包括如下步骤：

(1)利用缺陷性分支杆菌对植物甾醇进行发酵转化；

(2)发酵产物经浓缩、甲醇萃取后再提纯，得到去氢表雄酮晶体。

制备方法中，所述步骤(1)包括，将缺陷性分支杆菌在种子培养基中进行繁殖，待种子培养基od600＝10～12时，以9～16％的接种量将其接入装有发酵培养基中进行发酵转化。

制备方法中，所述种子培养基包括如下质量百分比的组分：葡萄糖1～2％，硝酸钠0.3～0.7％，磷酸二氢钾0.03～0.06％，硫酸镁0.03～0.07％，玉米浆4～6％；所述种子培养基的ph为7.0～7.4。

制备方法中，所述发酵培养基包括如下质量百分比的组分：植物甾醇3～4％，硝酸钠0.3～0.6％，磷酸二氢钾0.03～0.06％，硫酸镁0.04～0.08％，玉米浆3～6％，豆饼油14～16％；所述发酵培养基的ph为6.8～7.6。

制备方法中，所述发酵条件为温度28～33℃，罐压0.03～0.06mpa，搅拌转速180～240rpm，发酵周期5～8天。

作为优选，制备方法中，所述步骤(1)包括，将缺陷性分支杆菌在种子培养基中进行繁殖，待种子培养基od600＝12时，以12％的接种量将其接入装有发酵培养基中进行发酵转化。

作为优选，制备方法中，所述种子培养基包括如下质量百分比的组分：葡萄糖2％，硝酸钠0.5％，磷酸二氢钾0.05％，硫酸镁0.05％，玉米浆5％，余量的水；所述种子培养基的ph为7.0。

作为优选，制备方法中，所述发酵培养基包括如下质量百分比的组分：植物甾醇3％，硝酸钠0.5％，磷酸二氢钾0.05％，硫酸镁0.05％，玉米浆5％，豆饼油14％，余量的水；所述发酵培养基的ph为7.2。

作为优选，制备方法中，所述发酵条件为温度30℃，罐压0.05mpa，搅拌转速180rpm，发酵周期5天。

制备方法中，所述步骤(2)包括如下步骤：

a)提纯去氢表雄酮的方法，将步骤(1)制得的发酵产物分层，取油层进行减压浓缩；

b)甲醇萃取经步骤a)得到的浓缩液，再浓缩、烘干，得粗品，粗品经重结晶得去氢表雄酮晶体。

优选的，所述步骤b)通过甲苯重结晶。

具体的，所述步骤(2)包括如下步骤：

a)提纯去氢表雄酮的方法，将步骤(1)制得的发酵产物分层，取油层进行减压浓缩，除去水分；

b)取步骤a)得到的浓缩物，加入4倍体积的甲醇，室温下搅拌30min，静止分层，油层再用4倍体积的甲醇萃取两次，合并甲醇层，将甲醇浓缩至干，得黄色固体，烘干后加入2倍体积的石油醚，70℃回流2小时，冷却至室温；

c)抽滤得淡黄色固体粉末，烘干得粗品，粗品用1倍体积的甲苯重结晶得去氢表雄酮。

本发明的有益效果在于：

本发明提出了利用crispar/cas9方法敲除工业生产菌种mycobacteriumsp.gtf-69(cctccno.m2012522)中3β-羟基氧化酶系，保留其降解和转化植物甾醇支链的高活力性能，直接利用微生物转化生产去氢表雄酮的方法，用于解决背景技术中的上述问题。

植物甾醇的通用结构式为：

利用现有工业生产4-ad分支杆菌的酶系，可以创建点突变体能够转化植物甾醇为去氢表雄酮，因此，3β-羟基氧化酶系已被提议作为3-位羟基氧化的关键酶系(beatrizgalánetal.,microbbiotechnol.2017jan；10(1):138–150)。因此，从理论上讲，删除3β-羟基氧化酶系编码基因突变体，即应该积累去氢表雄酮，而不是4-ad。

通过对mycobacteriumgtf-69全基因测序发现，我们发现了三种潜在的3β-羟基氧化酶系基因。分别为ms_cho、ms_hsd和ms_ksi。因此，理论上失活3β-羟基类固醇脱氢酶即可阻止植物甾醇代谢的前两步反应从而为去氢表雄酮的生物合成奠定基础。

因此，我们通过基因敲除技术分别敲除这三种基因，获得重组菌株，并用于发酵转化植物甾醇，用薄层层析(tlc)鉴定发酵产物。我们发现ms_cho基因产物比ms_hsd和ms_ksi基因产物的活力更强，是转化4-ad的主要贡献者。所以仅仅失活ms_hsd基因产物并不能达到中国专利申请201410414313和201210316197所述的发酵转化能力。

本发明提供了一种从植物甾醇制备去氢表雄酮的新的路径。减低和消除传统mycobacteriumsp.菌株中多种3β-羟基氧化作用酶活性，实现利用微生物发酵转化植物甾醇直接生产去氢表雄酮。

附图说明

图1mycobacteriumgtf-69基因组环谱。

图2mycobacteriumgtf-69菌株中4-ad合成途径。

图3去氢表雄酮hplc分析图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例和附图对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域科研人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例都属于本发明保护的范围。

本发明中，ms_cho基因缺陷型菌株命名为mycobacteriumsp.dhea-1。

实施例1：工业生产菌种mycobacteriumgtf-69植物甾醇3-羟基代谢酶基因鉴定

利用第二代和第三代高通量测序分析mycobacteriumgtf-69菌株，基于pacbiorsii数据与illuminahiseq4000数据，采用基因组组装软件分析，分析其染色体数目为1条，基因组长度为5.421mbp，gc含量为66.88％。

对组装得到的结果质控分析，主要采用illuminahiseq4000数据对组装结果进行评估，质控结果数据单碱基分析质量为0.9998，结构碱基分析质量为0.9920，可读率为0.9842，重复率为1.35％。

组装后，通过gc-depth分析菌株的gc偏向性。根据基因组序列绘出其gc图，使用(g–c)/(g+c)的计算方法来进行gcskew分析，同时根据cog的注释结果和基因的位置信息绘出cog注释的基因在基因组上的分布情况。mycobacteriumgtf-69基因组环谱，如图1所示。

通过kegg方法分析，发现mycobacteriumgtf-69菌株是利用ms_cho，ms_hsd和ms_ksi基因产物氧化植物甾醇的3β-羟基，其他酶系同时或分步参与代谢植物甾醇支链，中间产物为4-ad。其基本过程如图2所示。

实施例2：3β-羟基代谢酶基因敲除

1)oligodna序列设计:

利用麻省理工学院crisprdesign(http://crispr.mit.edu/)工具在靶标dna区域中设计一对20bp左右oligodna。根据score的高低选取合适的guide#1序列，设计2条单链oligo的序列如下(小写字体部分是要与bsai酶切后的载体相互补的部分)：

cho-f：caccgtaagcatgaacatgtaactcgcaac

cho-r：aaacgttgcgagttacatgttcatgcttac

另外，需在位点上下游各设计一条引物，该引物用于后续pcr或测序检测阳性克隆，该引物能扩增约300bp的dna片段，上游引物距突变位点约100bp，下游引物距突变位点约200bp。

2)构建敲除载体和扩增：

将2条单链oligo按1：1比例混合，终浓度为10μm，在100℃水浴中保温10min，然后自然降温到室温，获得插入片段。

将pcas9质粒用bsai处理(37℃，4h)，直接用qiagenpcrclean试剂盒纯化，获得载体。

将插入片段与载体按3:1比例(摩尔比)混合，加入t4连接酶，16℃，保温过夜。

将链接好的质粒直接转化到大肠杆菌dh5a感受态细胞，37℃培养过夜，6000g离心取细胞沉淀，利用qiagenminiprep试剂盒纯化质粒，以灭菌超纯水洗脱，冻干浓缩，浓度为200ng/μl，质粒命名为pcas9-cho。

实施例3：分枝杆菌感受态细胞的制备

先冻存甘油菌加到含有2ml7h9培养基的试管复苏2～3天。普通生长的或在4度保存的菌，接种时可以取1至5ml加入含有50ml7h9(含0.1％tween80)的液体培养基的锥形瓶中。将浓度10⁸个/ml左右的分枝杆菌以10％的接种量接种于有50ml的7h9(含0.1％tween-80)液体培养基的锥形瓶中，37℃摇菌扩增。同时锥形瓶中需加入10颗左右的玻璃珠。在37℃下培养至od600nm＝0.4～0.5时，添加终浓度为1％的甘氨酸继续培养，当od600nm达到0.8～1.4时开始制备感受态。

配制10％甘油+0.05％tween80并用0.2μm滤器过滤，置于冰中。将40ml菌液转至50ml离心管中，加入10～12颗玻璃珠后，于涡旋器中充分涡旋5分钟后，将菌团块打散，于4℃离心机中在4000～8000rpm离心5～10分钟，弃上清，但防止菌块脱落。加入40ml10％甘油，于涡旋器中充分洗涤细菌后，于4℃离心机中以4000-8000rpm离心5分钟，弃上清。重复步骤洗1～2次后，留约1ml上清，用带滤芯的枪尖，吹吸充分混匀后于冰上放置。

实施例4：电转化dna感受态细胞

在0.2cm的电转杯中，分别加入5μl浓缩后的质粒dna和200μl分枝杆菌感受态细胞，轻柔吹吸充分混匀后于冰上放置10分钟。擦干电转杯上的水分，加入btx-399电转仪，以电压2.5kv、电阻1000ω、电容25μf脉冲波进行电击。对照试验中，未加dna的细菌阴性对照的脉冲时间应于电转时间为19～21ms，该时间范围显示待转细菌处于良好状态。

迅速用带滤芯的枪尖于电转液中加入2ml7h9(含吐温80)培养基，转移至5ml离心管中，于30℃恒温箱中孵育4～8小时，充分复活细菌。用带滤芯的枪尖吹吸混匀后，用1.5ml离心管分装，10000rpm离心1分钟沉淀转化菌，弃上清，用0.6ml7h9培养基重悬后，按100倍比例阶梯稀释，以500μl/板铺于7h11培养板中，避光于30℃恒温箱培养。待长出菌落后，挑取单菌落，培养至od600＝0.3～0.5，超声波处理，经菌液pcr并测序验证敲除是否成功，敲除成功得到3β-羟基氧化酶系缺陷性分支杆菌(mycobacteriumsp.dhea-1)，进入植物甾醇发酵转化实验。

实施例5：基因工程菌发酵

将mycobacteriumsp.dhea-1先在种子培养基中进行菌种繁殖，待种子培养基od600＝12时，以12％的接种量将其接入装有发酵培养基中进行发酵转化。种子培养基配方为(质量百分比)：葡萄糖2％，硝酸钠0.5％，磷酸二氢钾0.05％，硫酸镁0.05％，玉米浆5％，ph7.0。发酵培养基配方为(质量百分比)：植物甾醇3％，硝酸钠0.5％，磷酸二氢钾0.05％，硫酸镁0.05％，玉米浆5％，豆饼油16％，ph7.2。发酵转化的条件为：温度30℃，罐压0.05mpa，搅拌转速180rpm，发酵周期5天。

实施例6：去氢表雄酮提取和纯化

将发酵产物含有dhea的混合物需要进行提纯。提纯dhea的方法为，把产物分层，油层减压浓缩将其中少量的水浓缩掉。加入4倍体积的甲醇，室温下搅拌30min，静止分层，大部分产物被萃取到甲醇中，油层再用4倍体积的甲醇萃取两次，合并甲醇层，将甲醇浓缩干得黄色固体，烘干后加入2倍体积的石油醚，70℃回流打浆2小时，冷却至室温，抽滤得淡黄色固体粉末，烘干得dhea粗品，粗品用1倍体积的甲苯重结晶得类白色晶体，通过hplc分析纯度达97.1756％(见图3)。

以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，但并不限于此，本领域的技术人员很容易根据上述实施例领会本发明的精神，并做出不同的引申和变化，但只要不脱离本发明的精神，都在本发明的保护范围之内。