专利名称：分支杆菌的鉴定方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域临床分子诊断技术，尤其涉及一种使用PCR测序 的分支杆菌的鉴定方法。
背景技术：
分支杆菌的数量目前有110种左右，它是许多统称为分支杆菌病的疾病的 起因。因此，分支杆菌的分类鉴定引起了广大的科研工作者的重视。。现有技术 中，分支杆菌的鉴定技术分为三类。
一类是采用常规生化指标鉴定分支杆菌，例如专利CN1298023所描述的。 这种方法也是目前检验科常用的方法，这种方法鉴定时间长(需要1-2周)， 鉴定的结果受人为观察的影响，准确性不是很高。
第二类采用抗原抗体的方法进行血清学诊断，例如专利CN1388378就是采
用这种方法，该方法能够检测的分支杆菌数量同样比较少，而且每种菌需要一 种抗体进行;险测，因此不能鉴定临似目关的所有分支杆菌。
第三类采用芯片杂交技术(寡核苷酸杂交检测技术，即利用相关突变的寡核 苷酸与受检对象DNA进行杂交来确定突变类型)。专利CN1724681 ， CN1896280 ， CN1071955都是此类技术，此类技术对实验条件要求高，结果不稳定，分型的 种类较少，每种需要用一个探针。因此不利于临床标准化应用。而且芯片杂交 的方法检测的分支杆菌数量有限。
因此本领域迫切需要开发一种鉴定种类多，结果稳定，结果分析方便准确， 便于临床操作和结果标准化的分支杆菌鉴定方法
发明内容
有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是提供一种鉴定 种类多，结果稳定，结果分析方便准确，便于临床操作和结果标准化的分支杆菌鉴定方法。
为实现上述目的，提供了一种分支杆菌的鉴定方法，其特征在于，包括如
下步骤获取多种分支杆菌的多个标准rDNA序列，以生成分支杆菌序列凄史据库。 对所述多个标准rDNA序列进行比对，得到这些rDNA序列共有的保守区段。根 据所述保守区段制备一对PCR引物。使用所述PCR引物对待测分支杆菌的DM 溶液进行PCR扩增，从而得到所述待测分支杆菌的扩增产物。对所述扩增产物 进行测序反应，得到测序产物。对所述测序产物进行测序分析，得到待测分支 杆菌的rDNA序列。通过比较所述待测序列和所述分支杆菌序列数据库中的标准 序列，确定所述待测分支杆菌的类型。
较佳地，还包括使得所述引物的3 '端的石威基与所述多种分支杆菌的rDNA 序列匹配。 -
4交佳:t也，所述一》于PCR引物包4舌上游PCR引物agagtttgatcctggctcag和下 游PCR引物Ugtcgcgttgttcgtgaaa。
较佳地，还包括对所述扩增产物进行纯化。
较佳地，，将所述上游PCR引物的浓度稀释到luM,对所述纯化产物进行测 序反应。
较佳地，，还包括对所述经测序反应的扩增产物进行乙醇沉淀。 较佳地，，还包括对所述经乙醇沉淀的扩增产物进行曱酰胺变性。 较佳地，通过毛细管电泳进行所述测序分析，得到所述待测分支杆菌的测 序图谱。
较佳地，还包括将所述测序图谱转换为与所述分支杆菌序列数据库中的标 准rDNA序列的格式相同的格式。
较佳地，所述比较所述待测序列和所述分支杆菌序列数据库中的标准序列， 确定所述待测分支杆菌的类型还包括如下步骤
获得所述分支杆菌序列数据库中与所述对待测序列最匹配的所述标准序 列。获得待测序列与标准序列的共享减基的百分比，所述百分比定义为匹配度。 根据所述匹配度对所述分支杆菌序列数据库中的标准序列进行序，匹配度排序 第一的序列判定为待测分支杆菌的类型。
较佳地，还包括获得相邻两位匹配度排序的两条标准序列共享碱基数的差，所述差定义为确信度；并且根据所述确信度对所述匹配度进行校正。
由于根据多种分支杆菌的标志序列的保守区段设计PCR引物，因此所有的 PCR和测序只需一对引物，大大减少了实验种所需要的寡核苷酸的数量。
图l为分支杆菌的PCR引物序列示意图； 图2为结果序列示意图； 图3为序列鉴定结果的示意图。
具体实施例方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说 明本发明，而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验 方法，通常按照常规条件如分子克隆实验室手册(Sambrook等人，New York: Cold Spring Harbor Laboratoiy Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建 议的条件。
目前，分支杆菌的数量目前只有110种左右，本实施例中，获取其中105 种分支杆菌的文^格式的国际标准16srDNA序列，由此获得分支杆菌序列数据 库。
此后，分支杆菌序列数据库中的多种分支杆菌样的16srDNA序列进行对比， 找到相似度最大区段，即保守区段。接着，根据所述保守区段，设计所述多种 分支杆菌可公用的一对16srDNA引物。具体的，使所述引物的3 '端的#与 所述多种分支杆菌的16srDM序列匹配。如图1所示，本实施例的所迷一对引 物为方才匡内的上游引物agagtttgatcctggctcag和方才匡内的下游引物 ttgtcgcgttgttcgtgaaa。
现描述如何获取待测分支杆菌的DNA溶液。本实施例中，待测分支杆菌的 数量为12种，但并不限于此数量。首先，对12例不同分支杆菌感染的标本(从 上海市肺科医院检验科处获得)用标准的培养方法进行分支杆菌培养，随后取 少量菌落放入无菌水中作为本发明鉴定方法的样本。然后，使用DNA抽提试剂 盒(货号W6511,上海华舜生物工程有限公司)按照操作流程对所述12例标本进行分支杆菌标本的DNA抽提工作，由此得到12例样本的DNA溶液。所迷 DNA溶液在后续步骤中用作DNA溶液模板。
此后，对所获得的各样本DNA溶液作PCR扩增。首先，按照如下的体系 配置20ul的扩增体系10 x buffer, dNTP 2uM，引物10uM， Taq酶1个单位。 具体的，所述20ul扩增体系包含8.7ul无菌水，5ul分支杆菌DNA溶液模板， 0.3ulHotstartaq酶(Qiagen公司购买)，lul上游引物f (10uM), lul下游引物r (IOuM)， 2uldNTP (promega公司)和2ulPCR酶的緩沖液(qiagen公司)。
H20 buffer dNTP 引物f 引物r 才莫板DNA Taq 8. 7ul2ul2ul lul lul 5ul 0. 3ul
接着，将所述扩增体系放置在PCR仪(ABI的2720 )的孔板(96孔板)上按照 如下的PCR条件在所述PCR仪上设置热循环条件，对所述PCR扩增体系进行 反应。16srDNA引物的退火温度为53°C，具体的反应条件为95度5分钟， 35个热循环步骤设置为95度30秒，53度30秒，72度40秒，热循环结束后， 设置72度5分钟进行总延伸，然后4度无穷。由此，得到与所述样本溶液扭对 应的16srDNA的扩增产物。可按需要对PCR产物进行质量控制，例如，扩增 产物需要条带单一 (可过柱纯化)，浓度在30 - 100ng之间(可稀释)。
扩增结束后，使用SAP (promega公司)和exol (epicentre公司)对所述扩 增产物进行纯化。纯化体系为浓度7.633U/ul的SAP加浓度20U/ul的exol。具 体的，在2ulPCR产物中添加0.05ulSAP、 0.125ul exol以及5.825ul ddH20 。纯 化条件为在37。C下纯化60分钟，80。C下纯化15分钟，然后4。C无穷。由此， 得到经纯化的扩增产物。
此后，使用上游引物对上一步骤中经純化的扩增产物进行测序反应。具体 的，先将10uM的所述上游引物稀释到luM,然后按照如下体系混合各种试剂 测序反应的体系包含4ulBigdye3.1 (美国ABI公司)，2ul上游引物(luM)， 2ul 上一步骤中得到的经乙醇沉淀的扩增产物以及2ul无菌水。按照如下的PCR条 件在所述PCR仪上设置热循环条件，96度10秒，25个热循环设置为96度10 秒，50度5秒，60度4分钟，热循环后设置60度4分钟，4度无穷。由此，得 到带有测序荧光标记的一系列扩增产物，这些产物所携带的荧光能够在测序仪 上读出并且变成最后的序列信息。此后，每孔加入70%乙醇50pL左右于室温进行沉淀，时间15分钟以上， 不得超过24小时。3800转/分，4。C离心30分钟。轻轻倒去上清液，将96孔板 倒置离心，达1300转/分即停。然后，甩干乙醇。室温下^L置十分钟左右让乙醇 挥发干净。经过乙醇沉淀后，去除了所述扩增产物的杂质和多余染料。
此后，对所述经乙醇沉淀的扩增产物进行Hidi (甲酰胺)变性。具体的， 在每孔加入10|iL的Hidi溶液，95度变性4分钟以上，取出立即放入水水中， 置5分钟。经所述Hidi变性后，所述PCR产物中的DNA被拉伸成单链，保证 毛细管电泳时候大小不等的片断电泳速度不同。
最后，将在上一步骤中经甲酰胺变性扩增产物进行毛细管电泳。所述毛细 管电泳过程中，将测序产物所带的荧光信号通过CCD的检测，变成变成可读的 光学序列。本实施例中，将所述扩增产物i认遗传分析仪(3130x1 )的样品托盘， 进行测序的参数设置后，全自动的进行测序分析，它的自动化的过程就是一个 在毛细管中跑电泳的过程，并且由所述遗传分析仪自动将光学信号变成图语输 出来。由此，得到12个样本的测序图镨。
对于所获得的测序图谱，需将其转换为使用文本格式的结果序列。本实施 例中，采用ABI公司的sequence analysis 5.3.1对其进行分析，从而得到文本才各 式的序列。
由此，对比所获得的12个样本的文本格式的16srDNA结果序列和所述分支 杆菌序列数据库中的文本格式的16srDNA序列，从而确定所测的分支杆菌的类f。
现将详细描述如何比较所述测序反应的结果序列与所述数据库中的序列， 从而确定待测分支杆菌的类型。
对于待测的每一条文本序列，依次与所述分支杆菌序列数据库中的每一条 分枝杆菌的标准序列进行比对。本实施例中，序列比对使用的是 Needleman-Wunsch算法。对于两个序列，首先定义匹配得分函数，即如果巧个 碱基匹配则得分+1,如果两个碱基不匹配则得分为0。 为了得到两个序列的最 高的分匹配，采用动态规划法。具体的，令Fij为A序列的第i个碱基于B序列 的第j个磁碁对齐后的得分，则可以写出如下递归式Fij = max(Fi - l,j — 1 + S(Ai，Bj),Fi，j - 1 + d，Fi - l,j + d)
其中S(Ai，Bj)为匹配得分函数，d为插入空格数。得到最高得分以后，回溯 最右匹配方案。
其次，得到比对结果以后，计算待测序列和比对结果的序列共享碱基的百 分比，所得百分比即为匹配度。
然后对所述分支杆菌序列数据库中的序列共享石威基百分比进行排序，匹配 度排序第 一位和排序第二位的两条序列共享碱基数的差距就是确信度。
将匹配度排序第 一 的序列判定为待测分支杆菌的类型。
参见图3,具体描述将上述判定算法以软件方法实现的具体分析和评价。图 3中，匹配度为94.5313,即表示威基的匹配百分比为94.5313%，有部分不匹配 是因为测序序列碱基判读的问题或者测序序列质量问题导致，这些问题可以用 确信度进行校正。图3中14就代表与最匹配的Mycobacterium_chelonae序列以 及第二匹配的序列其碱基匹配数的差异为14，该指标很好的反映了测序结果的 可信性，因为如果第一与第二匹配的序列差异太小即有可能是测序质量或碱基 判读问题导致的软件结杲误判。
根据发明的分支杆菌鉴定方法具有如下优点。
(1) 由于4艮据多种分支杆菌的标志序列的保守区賴::没计PCR引物，因此所 有的PCR和测序只需一对引物，大大减少了实验种所需要的寡核苷酸的数量。
(2) 本发明的这对引物选择的105种分支杆菌基本覆盖了目前所有的分支 杆菌类型，而且16srDNA是高度保守区域。由此，若数据库中的分支杆菌如果 有增加， 一般情况下，这对引物也可以把他们扩增出来，因此所述引物的普适 性很好。
(3 )将测序图谱转换为文本格式，通过判定其与分支杆菌标准序列的匹配 度及确信度来鉴定待测分支杆菌的类型，省略了需要有生物学基础和生物信息 学分析能力的通过对测序图谱需行比对、判断来判定分支杆菌的类型。使得一 般工作人员也可进行分支杆菌的鉴定。
(4)通过算法来实现待测序列与标准序列的快速鉴定，还通过确信度对鉴 定结果进行可靠性的分析。因此，本发明的鉴定方法适合应用于临床。(5)该方法培养后只需1天时间进行鉴定实验，比原来做生化指标的鉴定 提高了效率，缩短了鉴定时间，有利于临床检验
本技术领域的技术人员应清楚，本发明可以以许多其他具体的形式实现而 不脱离发明的精神或范围。具体的，应理解本发明可以以下列形式实现。
实施例中，DNA序列不限于沉降系数为16s的rDNA,而是可为其他DNA 序列。
实施例中，构成分支杆菌序列数据库中的分支杆菌的数量并不限于105种， 而可为其j也数量。
实施例中，并不一定需要将测序图语转换成文本格式，其要其格式与所述 分支杆菌序列数据库的rDNA序列灼格式一致。
在此的例子及实施例应认为是说明性的而非限制性的，并且本发明不限于 在此给出的细节，而是可在附属权利要求的范围之内进行修改。序列表
<110>上海天昊生物科技有限公司 <120>分支杆菌的鉴定方法
<130> 090430
<160> 3
<170> Patentln version 3.1
<210> 1
<211> 828
<212> DM
<213> mycobacteri咖 <400> 1
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权利要求
1. 一种分支杆菌的鉴定方法，其特征在于，包括如下步骤a)获取多种分支杆菌的多个标准rDNA序列，以生成分支杆菌序列数据库；b)对所述多个标准rDNA序列进行比对，得到这些rDNA序列共有的保守区段；c)根据所述保守区段制备一对PCR引物；d)使用所述PCR引物对待测分支杆菌的DNA溶液进行PCR扩增，从而得到所述待测分支杆菌的扩增产物；e)对所述扩增产物进行测序反应，得到测序产物；f)对所述测序产物进行测序分析，得到待测分支杆菌的rDNA序列；g)通过比较所述待测序列和所述分支杆菌序列数据库中的标准序列，确定所述待测分支杆菌的类型。
2. 如权利要求1所述的分支杆菌的鉴定方法，其特征在于，步骤c)中，所述 制备包括使得所述引物的3 '端的磁基与所述多种分支杆菌的rDNA序列匹配。
3. 如权利要求2所述的分支杆菌的鉴定方法，其特征在于，所述一对PCR引物 包^舌上游PCR SI物agagtttgatcctggctcag和下游PCR S1物ttgtcgcgttgttcgtgaaa。
4. 如权利要求l所述的分支杆菌的鉴定方法，其特征在于，步骤(d)中，还包 括对所述扩增产物进行纯化。
5. 如权利要求l所述的分支杆菌的鉴定方法，其特征在于，步骤(e)中，将所 述上游PCR引物的浓度稀释到luM，对所述纯化产物进行测序反应。
6. 如权利要求5所述的分支杆菌的鉴定方法，其特征在于，步骤e)中，还包 括对所述经测序反应的扩增产物进行乙醇沉淀。
7. 如权利要求6所述的分支杆菌的鉴定方法，其特征在于，步骤e)中，还包 括对所述经乙醇沉淀的扩增产物进^f亍甲酰胺变性。
8. 如权利要求7所述的分支杆菌的鉴定方法，其特征在于，步骤f)中，通过毛 细管电泳进行所述测序分析，得到所述待测分支杆菌的测序图谱。
9. 如权利要求8所述的分支杆菌的鉴定方法，其特征在于，步骤f)还包括将所 述测序图语转换为与所述分支杆菌序列数据库中的标准rDNA序列的格式相 同的才各式。
10. 如权利要求1所述的分支杆菌的鉴定方法，其特征在于，步骤g)包括如下 步骤(1) 获得所述分支杆菌序列数据库中与所述对待测序列最匹配的所 述标准序列；(2) 获得待测序列与标准序列的共享石咸基的百分比，所述百分比定 义为匹配度；(3 ) 根据所述匹配度对所述分支杆菌序列数据库中的标准序列进行 序，匹配度排序第 一的序列判定为待测分支杆菌的类型。
11. 如权利要求10所述的分支杆菌的鉴定方法，其特征在于，步骤(3)还包括 获得相邻两位匹配度排序的两条标准序列共享威基数的差，所述差定义为确 信度；并且根据所述确信度对所述匹配度进行校正。
全文摘要
本发明揭露了一种分支杆菌的鉴定方法，包括如下步骤获取多种分支杆菌的多个标准序列，以生成分支杆菌序列数据库。对所述多个标准序列进行比对，得到这些序列共有的保守区段。根据所述保守区段制备一对PCR引物。使用所述PCR引物对待测分支杆菌的DNA溶液进行PCR扩增，从而得到所述待测分支杆菌的扩增产物。对所述扩增产物进行测序反应，得到测序产物。对所述测序产物进行测序分析，得到待测分支杆菌的序列。通过比较所述待测序列和所述分支杆菌序列数据库中的标准序列，确定所述待测分支杆菌的类型。由于根据多种分支杆菌的标志序列的保守区段设计PCR引物，因此所有的PCR和测序只需一对引物，大大减少了实验种所需要的寡核苷酸的数量。
文档编号C12Q1/68GK101532053SQ20081020743
公开日2009年9月16日 申请日期2008年12月19日 优先权日2008年12月19日
发明者达 丁, 军 乐, 一 王 申请人:上海天昊生物科技有限公司