专利名称：牛Nramp1巨噬细胞特异性表达载体及其构建方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程领域，涉及一种真核表达载体的构建，特别是牛天然免疫力相关巨噬细胞蛋白I(Nrampl)的吞噬细胞特异性表达载体及其构建方法和应用。本载体可以作为一种转基因载体应用在转基因抗病动物培育中。
背景技术：
研究动物机体抵抗牛结核分支杆菌(M. bovis)、鼠麻风分支杆菌 (M. lepraemurium) > ^fJ # K ^ (Brucella)、 ^ Π ^ (S. typhimurium) RMW W^ (Leishmania spp)等胞内寄生病原微生物的侵染机制，是寻求高效的防治药物与疫苗和进行家畜抗病育种的前提。机体抵御胞内寄生微生物侵染主要依赖于细胞免疫，即巨噬细胞吞噬病原体、处理并递呈抗原至T淋巴细胞，T淋巴细胞识别抗原后增殖分化，释放细胞因子，巨噬细胞活化清除病原微生物。巨噬细胞作为抗原递呈细胞与最后的效应细胞在细胞免疫过程中发挥巨大的作用。然而，胞内寄生微生物拥有一套抵御巨噬细胞杀伤的机制来阻遏机体对其的清除作用，并在巨噬细胞内生长繁殖，给胞内寄生菌疾病的防治工作带来很大的困扰。1981年，Gros等指出机体对结核分支杆菌的易感性是受遗传因素控制的， 针对与机体天然免疫相关蛋白功能的研究遂成为胞内寄生菌疾病防治研究领域的热点之一。I^iX(5c^2006)通过SSCA法比较荷斯坦奶牛及瘤牛基因组指出，不同基因型对布鲁氏菌的抗性和敏感性差异显著，这种差异源自荷斯坦牛及瘤牛天然免疫力相关巨噬细胞蛋白 1 (Nrampl)基因3’UTR区序列的遗传变异。牛Nrampl基因是一个较为保守的基因，位于第二号染色体上，全长约10926bp，含有15个外显子，编码的磷酸糖蛋白位于吞噬细胞吞噬溶酶体膜上，含有12个推定的跨膜区(Feng et al.，1996)，在有吞噬能力的细胞(如巨噬细胞，噬中性粒细胞)内特异性表达，具有二价金属阳离子转运的功能。Nrampl可通过外运吞噬体内病原微生物满足自身营养代谢或合成防御体系所必须的金属离子(如狗2+、Mn2+) 而减弱其对吞噬体内环境的抵御能力，同时，Nrampl的离子转运效应可活化巨噬细胞，引起 “多向性效应”(包括NO产生、抗原递呈、蛋白激酶C产生等功能的上调)，增强巨噬细胞对病原微生物的杀伤性，从而影响动物对疾病的天然抵抗力。2006年，Pereira-Suarez从感染牛结核分枝杆菌牛群取样检测Nrampl表达量发现病畜较健康牛Nrampl表达量显著升高；且对比健康人群，患病儿童Nrampl表达的减弱增加了机体对结核病的易感性。提示，机体对胞内寄生菌的抵抗力强弱与Nrampl的表达存在量依赖关系。
发明内容
本发明目在于针对现有技术的不足提供一种牛Nrampl巨噬细胞特异性表达载体及其构建方法和应用，该载体含有牛Nrampl基因及其调控序列，可以通过特异性的增强 Nrampl的表达量，从而提高转基因动物的抗病能力。牛Nrampl巨噬细胞特异性表达载体构建方法，包括以下步骤Al 血液基因组提取
A2 =Nrampl调控区序列的扩增，具体包括以下操作，A21 引物设计从牛Nrampl 全基因序列结合其核心启动子区序列设计含Vsp I和》!0 I酶切位点的引物F 5' -CCATTAATCCCTCTACCCCTGCCTCTCC-3，R 5' -CCTCTCGAGGCGGTGGCGATTGTGC-3’ ；下划线序列为酶切位点；A22 =PCR反应以荷斯坦奶牛外周血基因组为模板，按照 TaKafci公司TaKafci TaqTM使用说明书进行PCR反应，反应程序如下94°C 3min ；94°C 30s， 60. 8°C 30s, 72°C 2min 20s, 30 个循环；72°C IOmin ；4°C IOmin ；用琼脂糖凝胶电泳分离待回收的PCR产物，切胶回收；回收产物与pMD 18-T simple载体连接，转化DH5 α感受态细菌进行蓝白斑筛选；挑取阳性菌落，提取质粒后用Vsp I及BioI进行双酶切鉴定；酶切正确的质粒送样测序序列正确者命名为PMD18-P ；A3 吞噬细胞特异性表达载体PIRES2-P的构建与鉴定pMD18-P与pIRES2-EGFP载体分别用Vsp I及Bio I进行双酶切，胶回收获得的目的基因片段与相应载体片段用T4DNA连接酶16°C连接过夜，连接产物转化DH5 α感受态细菌，选取阳性菌落增菌获得的重组质粒进行酶切鉴定，命名为PIRES2-P ；Α4 牛Nrampl吞噬细胞特异性表达载体pIRES2_PN的构建与鉴定pIRES2-P与pMD18_N4载体分别用BamH I和Ml I进行双酶切，胶回收获得的目的基因片段与相应载体片段用T4DNA连接酶16°C连接过夜，连接产物转化Dffia感受态细菌，选取阳性菌落增菌获得的重组质粒进行酶切鉴定，命名为PIRES2-PN。所述的构建方法，所属步骤Al具体操作如下(1)取荷斯坦奶牛外周血血液样本200uL，加入20uL的蛋白酶K溶液，混勻；再次加入200uL的缓冲液GB，充分颠倒混勻，70°C放置lOmin，溶液变清亮后瞬时离心去除管盖内壁的水珠；(2)加入200uL无水乙醇，充分振荡15s，瞬时离心；(3)将上一步所得的溶液和絮状沉淀都加入吸附柱CB3中，13400Xg离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中；(4)向吸附柱CB3中加入500uL缓冲液GD, IMOOXg离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中；(5)向吸附柱CB3中加入700uL漂洗液PW，IMOOXg离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中；(6)向吸附柱CB3中加入500uL漂洗液PW，IMOOXg离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中；(7) IMOOXg离心aiiin，倒掉废液，将吸附柱CB3室温放置lOmin，以彻底晾干吸附材料中残留的漂洗液；(8)将吸附柱转入一个干净的离心管中，向吸附膜中间部位悬空滴加IOOuL洗脱缓冲液TE,室温放置5min, 13400 X g离心2min ；(9)重复步骤8 ；(10)获得的外周血基因组溶液，5uL上样，0. 8%琼脂糖凝胶电泳分析。根据上述的构建方法获得的重组载体PIRES2-PN。所述的重组载体pIRES2-PN在转基因抗病动物培育中的应用。
本发明选择质粒pIRES2-EGFP为骨架载体，该载体所含IRES序列不仅可以实现目的基因与标记基因(绿色荧光蛋白)的独立表达，而且两者的表达量存在比例关系一方面减少了绿色荧光蛋白对目的蛋白功能的影响，另一方面更有利于检测目的蛋白的表达水平。本发明在质粒pIRES2-EGFP多克隆位点Ml I与BamH I之间插入牛Nrampl开放阅读框序列，并用Nrampl基因表达调控序列替换掉骨架载体上巨细胞病毒(CMV)启动子序列(命名为PIRES2-PN)，从而实现Nrampl基因在吞噬细胞内的特异性表达。一方面，该载体可以提高Nrampl基因的表达量；另一方面，该载体启动子的特异性限制了 Nrampl的表达范围，最大程度的减少人工加入基因表达对转基因动物机体生命活动的不利影响。本发明将重组质粒PIRES2-PN分别转染至成纤维细胞与鼠单核巨噬细胞系 RAW264. 7中验证重组质粒功能转染后的7出现绿色荧光，而转染后的成纤维细胞并没有绿色荧光出现；以转染后的成纤维细胞基因组为模板进行Nrampl的开放阅读框序列扩增，有目的条带出现。说明质粒PIRES2-PN中Nrampl的表达具有特异性。
图1为外周血总RNA琼脂糖凝胶电泳；
图2为Nrampl基因PCR扩增；图3重组质粒pMD18-N酶切鉴定；图4重组质粒pIRES2-N酶切鉴定；图5牛外周血基因组琼脂糖凝胶电泳；图6牛Nrampl基因调控区序列PCR扩增；图7重组质粒pMD18-P酶切鉴定；图8重组质粒pIRES2-P酶切鉴定；1 :Vsp I和Xho I双酶切后的pIRES2_P ;2 PIRES2-P ；图9重组质粒pIRES2-PN的鉴定；1 =Sal I单酶切后的pIRES2_PN 2 =BamH I和 Sal I双酶切；3 =Vsp I和Β ο I双酶切；图10质粒载体pIRES2-EGFP、pIRES2_N、pIRES2_PN转染小鼠单核巨噬细胞株 RAW264. 7 ；图11重组质粒pIRES2-N、pIRES2_PN转染牛成纤维细胞；图12重组质粒pIRES2-PN转染牛成纤维细胞单克隆基因组PCR ；图13重组质粒pIRES2-PN示意图。
具体实施例方式以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。实施例INrampl基因片段的分离，扩增与测序1. 1总RNA的提取无菌采取秦川牛(陕西杨凌科元生物工程有限公司)颈静脉血，加入红细胞裂解液(Triis-NH4Cl)，混勻4°C作用4 5min (其间反复轻柔颠倒混勻)除去红细胞，待红细胞完全破碎，1000r/min离心5min，得到白细胞沉淀，PBS清洗2 3次，离心沉淀。加入适量TRIzoI试剂，室温静置5min，加入l/5TRIzol试剂量的氯仿震荡混勻室温静置5min， 12000r/min 4°C离心lOmin，吸取上清移至新的离心管中，加入等量体积的异丙醇，室温静置lOmin，12000r/min 4°C离心IOmin加入75%乙醇清洗2次，离心、沉淀干燥后溶解于适量的DEPC处理水中，琼脂糖电泳检测(图1)。1.2引物设计从牛Nrampl基因(GenBank序列号U12862. 1)的完整阅读框架序列的两端设计含 Sal I和BamH I酶切位点的引物
F 5'-CCGTCGACTGCGGTCCTCATGTCAG -3' (SEQ ID NO: 1)
R 5'-CCGGATCCTGGTGGGAGCTCATCC -3' (SEQ ID N0:2)下划线序列为酶切位点，预计扩增片段约为1660bp。1.3反转录反应1. 3. 1引物处理干粉状的引物在稀释之前，12000r/min离心30s，然后慢慢地半打开管盖，加入适量的双蒸去离子水，制成引物贮存液，分装后于_20°C保存备用。1. 3. 2如下配制微量离心管中混合液
组成数量引物1 uLdNTP1 uL总RNA样品4uL无RNA酶的双蒸去离子水添加至IOuL1. 3. 3在PCR仪上进行变性、退火反应。65°C，5min后4°C离心数秒。1. 3. 4如下配制微量离心管中反转录反应液
组成数量上述变性、退火反应液IOuL5 xPrimerScriptTM Buffer4 uLRNase Inhibitor(40U/ uL)0.5 uLPrimerScriptTM RTase0.5 uL无RNA酶的双蒸去离子水5 uL1. 3. 5在PCR仪上按下列条件进行反转录反应300C IOmin ；45°C 30min ；95°C 5min ；4°C IOmin0
1. 4PCR反应 按下表制备50uLPCR反应
权利要求
1.牛Nrampl巨噬细胞特异性表达载体构建方法，其特征在于，包括以下步骤 Al 血液基因组提取A2 =Nrampl调控区序列的扩增，具体包括以下操作，A21 引物设计从牛Nrampl全基因序列结合其核心启动子区序列设计含Vsp I和》!0 I酶切位点的引物 F :5’ -CCATTAATCCCTCTACCCCTGCCTCTCC-3， R :5’ -CCTCTCGAGGCGGTGGCGATTGTGC-3’ ；下划线序列为酶切位点；A22 :PCR反应以荷斯坦奶牛外周血基因组为模板，按照 TaKafci公司TaKafci TaqTM使用说明书进行PCR反应，反应程序如下94°C 3min ；94°C 30s， 60. 8°C 30s, 72°C 2min 20s，30 个循环；72°C IOmin ；4°C IOmin ；用琼脂糖凝胶电泳分离待回收的PCR产物，切胶回收；回收产物与pMD18-T simple载体连接，转化DH5 α感受态细菌进行蓝白斑筛选；挑取阳性菌落，提取质粒后用Vsp I及BioI进行双酶切鉴定；酶切正确的质粒送样测序序列正确者命名为PMD18-P ；A3 吞噬细胞特异性表达载体PIRES2-P的构建与鉴定PMD18-P与pIRES2-EGFP载体分别用Vsp I及)(h0 I进行双酶切，胶回收获得的目的基因片段与相应载体片段用T4DNA连接酶16°C连接过夜，连接产物转化DH5ci感受态细菌，选取阳性菌落增菌获得的重组质粒进行酶切鉴定，命名为PIRES2-P ； A4 牛Nrampl吞噬细胞特异性表达载体pIRES2_PN的构建与鉴定 PIRES2-P与pMD18-N4载体分别用BamH I和Ml I进行双酶切，胶回收获得的目的基因片段与相应载体片段用T4DNA连接酶16°C连接过夜，连接产物转化DH5ci感受态细菌，选取阳性菌落增菌获得的重组质粒进行酶切鉴定，命名为PIRES2-PN。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所属步骤Al具体操作如下(1)取荷斯坦奶牛外周血血液样本200uL，加入20uL的蛋白酶K溶液，混勻；再次加入 200uL的缓冲液GB，充分颠倒混勻，70°C放置lOmin，溶液变清亮后瞬时离心去除管盖内壁的水珠；(2)加入200uL无水乙醇，充分振荡15s，瞬时离心；(3)将上一步所得的溶液和絮状沉淀都加入吸附柱CB3中，13400Xg离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中；(4)向吸附柱CB3中加入500uL缓冲液⑶，13400X g离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3 放回收集管中；(5)向吸附柱CB3中加入700uL漂洗液PW，13400X g离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中；(6)向吸附柱CB3中加入500uL漂洗液PW，13400X g离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中；(7)13400 X g离心2min，倒掉废液，将吸附柱CB3室温放置lOmin，以彻底晾干吸附材料中残留的漂洗液；(8)将吸附柱转入一个干净的离心管中，向吸附膜中间部位悬空滴加IOOuL洗脱缓冲液TE,室温放置5min, 13400 X g离心2min ；(9)重复步骤8；(10)获得的外周血基因组溶液，5uL上样，0.8%琼脂糖凝胶电泳分析。
3.根据权利要求1或2所述的构建方法获得的重组载体PIRES2-PN。
4.根据权利要求3所述的重组载体在转基因抗病动物培育中的应用。
全文摘要
本发明涉及了一种牛Nramp1巨噬细胞特异性表达载体及其构建方法和应用。该方法以质粒pIRES2-EGFP为骨架载体，在多克隆位点Sal I与BamH I之间插入牛Nramp1开放阅读框序列，并用Nramp1基因表达调控序列替换掉骨架载体上巨细胞病毒(CMV)启动子序列，从而实现Nramp1基因在吞噬细胞内的特异性表达。本载体可以作为一种转基因载体应用在转基因抗病动物培育中。本发明还指出秦川牛Nramp1开放阅读框序列与GenBank中相应序列(GenBank序列号U12862.1)相似率为99.88％，存在两个碱基差异。
文档编号C12N15/85GK102226200SQ20111010995
公开日2011年10月26日 申请日期2011年4月29日 优先权日2011年4月29日
发明者张涌, 徐晓彬, 李倩, 王爱华, 胡林勇, 靳亚平 申请人:西北农林科技大学