专利名称：一种酿酒酵母gsh1缺失突变株的构建方法及应用的制作方法
技术领域：
本发明属于微生物学、生物化学、毒理检测技术领域，更具体涉及一种酿酒酵母的 Agshl突变株的构建方法，还涉及一种酿酒酵母的Agshl突变株的用途，在提高重金属细胞毒性检测灵敏度中的应用，适用于其他物质细胞毒性的检测。
背景技术：
随着人类的社会生产活动，环境中镉(Cd)、铅(Pd)、汞(Hg)和铬(Cr)等重金属污染越来越厉害。由于重金属可以与核酸、蛋白质等生物大分子结合，使生物大分子结构发生不可逆改变，或者产生自由基引起细胞结构和功能的破坏，甚至细胞的死亡，因此重金属具有明显的细胞毒性。重金属可以通过皮肤接触、食物链、饮水等途径直接或间接地影响人类活动，危害人体健康。如镉是常见的环境和工业污染物，具有一定的致癌性和致突变性，在动物体内半衰期长，因其毒性大、应用广泛而逐渐成为一种主要的重金属污染物。目前检测重金属细胞毒性的方法有许多，如MTT比色法、中性红吸收实验、台盼蓝排斥实验、蛋白含量测定、乳酸脱氢酶活性检测、细胞微核检测、DNA损伤检测、细胞存活率检测等方法，其中以V79细胞、CHL细胞、细胞以及酵母细胞为材料，通过检测细胞生长、存活率来评估重金属细胞毒性的实验较多。酿酒酵母是一种单细胞真核模式生物，在生物学研究中扮演者重要的角色，不过由于酿酒酵母对重金属耐受高于动物培养细胞，虽然酿酒酵母培养、操作简单，但是在体外细胞毒性研究中表现并不突出。为了提高酿酒酵母在重金属细胞毒性检测中的灵敏度，申请人设想从降低酿酒酵母细胞对重金属的耐受性入手。谷胱甘肽(GSH)，即γ -L-谷氨酰-L-半胱氨酰甘氨酸，能有效清除掉细胞体内的自由基，GSH是由前体物质L-谷氨酸、L-半胱氨酸和甘氨酸经Y -谷氨酰半胱氨酸合成酶 (GSH I)和谷胱甘肽合成酶(GSH II)催化而合成的，其中Y-谷氨酰半胱氨酸合成酶是GSH 合成途径中的限速酶，由gshl基因编码。敲除酿酒酵母的gshl基因，将有效降低酿酒酵母细胞对重金属的耐受性，即采用Agshl突变株进行细胞毒性检测可以有效提高检测灵敏度。该方法和技术思路可适用于其他物质细胞毒性的检测。
发明内容
本发明目的是在于提供了一种酿酒酵母的Δ gshl突变株YJL101C，该突变株gshl 基因缺失，不能有效合成谷胱甘肽，突变株细胞抗逆性下降，对重金属等胁迫因素耐受性降低、敏感度升高。本发明的另一个目的是在于提供了一种酿酒酵母Agshl突变株的构建方法，利用微生物遗传学方法构建酿酒酵母细胞Agshl突变株后，再将突变株用于氯化镉等重金属细胞毒性的检测。本发明还有一个目的是在于提供了一种酿酒酵母Agshl突变株在提高重金属细胞毒性检测灵敏度中的应用，由于酿酒酵母的Agshl突变株不能有效合成谷胱甘肽，突变株细胞对氯化镉等重金属耐受性低于野生型细胞，因此利用酿酒酵母的Agshl突变株检测氯化镉等重金属的细胞毒性可以显著地提高检测的灵敏度。为了实现上述的目的，本发明采用以下技术方案一种酿酒酵母Δ gshl突变株的构建方法，其步骤如下酿酒酵母Agshl突变株构建酿酒酵母基因同源重组敲除原理、引物设计、敲除片段转化方法按照文献所描述的方法进行(Yeast，1998，14 :953-962)，该方法是目前酿酒酵母中基因敲除的通用方法；1)引物设计依据酿酒酵母gshl基因序列(GenBank :BK006943. 1)设计引物上游引物Pl:GCAGATTTAGTATAGGGCTACATTGTAGGGTGGTTTAGAGTATCGAAAATATACATATAGAAGAATAAA CGGATCCCCGGGTTAATTAA ；下游引物P2:GCTTTTTCAATCACCGTGTCACCCAAATCGATAATGTCAACTTTCTTTCACAACCGAAGTAAAAGGAGT GAATTCGAGCTCGTTTAAAC ；2) PCR扩增利用上游引物Pl和下游引物P2对质粒pFA6a_Kan MX6(来源于中国典型培养物保藏中心，可以通过购买获得)进行PCR扩增，获得含酿酒酵母gshl基因上下游序列的敲除片段；3) gshl基因的敲除通过醋酸锂/PEG的转化方法将PCR扩增得到的敲除片段导入酿酒酵母BY47421菌株细胞(BW7421菌株来源于中国典型培养物保藏中心，可以通过购买获得)，并通过G418抗性标记筛选得到具有G418抗性的酿酒酵母的Δ gshl突变株 YJLlOlC(Saccharomyces cerevisiae YJL101C)，此菌株已保藏，保藏单位中国典型培养物保藏中心，地址中国.武汉.武汉大学，保藏日期2011年4月20日，保藏编号CCTCC No :M 2011130，分类命名酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) YJL IOlC0一种利用酿酒酵母的Δ gshl突变株在提高检测氯化镉等重金属对酵母细胞的细胞毒性灵敏度中的应用，其步骤是(其他常用于重金属细胞毒性检测的还有V79细胞、CHL 细胞、细胞等细胞系)1)氯化镉处理将Δ gshl突变株和BW7421菌株分别从斜面上接种于5mLYPD培养基中，200r/min，30°C振荡培养Mh ；分别加入氯化镉至终浓度为1、5和lOmmol/L，以不加氯化镉的样品为对照；所有样品于200r/min，30°C振荡培养Mh ；2)活细胞计数分别取步骤1)中，Δ gshl突变株和野生型BY47421菌株未加氯化镉及分别加入终浓度为1、5和lOmmol/L的氯化镉，经过24h振荡培养后的菌液，进行10倍连续稀释；分别取10_3、10_4和10_5稀释度样品涂布于YPD平板，每稀释度3块平板，涂布量为每平板200 μ L，30°C培养7 计数；3)细胞存活率和相对存活率的计算通过公式计算存活率和相对存活率，存活率(％ )=氯化镉处理后活细胞浓度/未用氯化镉处理活细胞浓度；相对存活率(％ ) = Δ gshl突变株存活率/相同处理条件下野生型BW7421菌株存活率；氯化镉终浓度为1、5和lOmmol/L时，Δ gshl突变株存活率分别为69. 8士8. 95%、
424. 5士2. 15%和 0. 22士0. 08%，野生型 BY47421 菌株存活率分别为 85士9. 5%、34士 1. 3% 和3. 9士0. 1%，而Agshl突变株相对存活率分别为82. 12士 10. 52%,72. 06士6. 32%和 5. 64士2. 5%。4)比较氯化镉处理后酿酒酵母细胞存活率，评估氯化镉的细胞毒性。相同浓度的氯化镉处理后，Agshl突变株存活率低于野生菌株的存活率，随氯化镉浓度增加，存活率差距增大。Agshl突变株存活率低于相同处理的野生菌株存活率，说明其对氯化镉细胞毒性的耐受能力下降，对氯化镉更敏感，即采用Agshl突变株用于氯化镉等重金属的细胞毒性检测可以提高检测的灵敏度。本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果本发明通过基因敲除方法构建Agshl突变株用于重金属细胞毒性检测。由于谷胱甘肽(GSH)氧化还原系统是细胞中抵抗或者消除重金属等毒性的重要途径，而gshl基因编码的Y-谷氨酰半胱氨酸合成酶(GSH I)是GSH合成途径中的关键酶。gshl基因敲除后极大地影响了细胞中GSH的合成，对重金属细胞毒性的抗性减弱，采用Agshl突变株用于重金属细胞毒性检测提高了细胞毒性检测灵敏度。在氯化镉终浓度为1、5和lOmmol/L时， Δ gshl突变株存活率分别相当于野生型的约80%、70%和5 6%，表明随着氯化镉终浓度的增加，相对于野生型，Agshl突变株对氯化镉细胞毒性的耐受能力显著下降，对氯化镉的细胞毒性更敏感。
图1为一种不同浓度氯化镉处理后突变株及野生型的存活率示意图。随着氯化镉浓度增加，细胞存活率下降，Agshl突变株细胞存活率低于相同处理的野生型细胞。图2为一种不同浓度氯化镉处理后突变株相对存活率示意图。高浓度(lOmmol/L)的氯化镉处理后，突变株相对存活显著降低。
具体实施例方式实施例1 下面以酿酒酵母Agshl突变株构建和氯化镉细胞毒性检测为例，参照附图进一步阐述本发明。酿酒酵母BY47421菌株和质粒pFA6a-Kan MX6来源于中国典型培养物保藏中心。一种酿酒酵母Δ gshl突变株的构建方法，其步骤是酿酒酵母Agshl突变株构建酿酒酵母基因同源重组敲除原理、引物设计、敲除片段转化方法按照文献所描述的方法进行(Yeast，1998，14 :953-962)，该方法是目前酿酒酵母中基因敲除的通用方法；1)引物设计依据酿酒酵母gshl基因序列(GenBank :BK006943. 1)设计引物上游引物Pl (SEQ ID NO. 1)GCAGATTTAGTATAGGGCTACATTGTAGGGTGGTTTAGAGTATCGAAAATATACATATAGAAGAATAAA CGGATCCCCGGGTTAATTAA ；下游引物P2(SEQ IDN0. 2)
GCTTTTTCAATCACCGTGTCACCCAAATCGATAATGTCAACTTTCTTTCACAACCGAAGTAAAAGGAGT GAATTCGAGCTCGTTTAAAC ；2) PCR扩增利用上游引物Pl和下游引物P2对质粒pFA6a_Kan MX6(来源于中国典型培养物保藏中心，可以通过购买获得)进行PCR扩增，获得含酿酒酵母gshl基因上下游序列的敲除片段；3) gshl基因的敲除通过醋酸锂/PEG的转化方法将PCR扩增得到的敲除片段导入酿酒酵母BY47421菌株细胞(BW7421菌株来源于中国典型培养物保藏中心，可以通过购买获得)，并通过G418抗性标记筛选得到具有G418抗性的酿酒酵母的Δ gshl突变株 YJLlOlC(Saccharomyces cerevisiae YJL101C)，中国典型培养物保藏中心保藏编号CCTCC No :M 2011130。实施例2 —种利用酿酒酵母的Δ gshl突变株在提高检测氯化镉等重金属对酵母细胞的细胞毒性灵敏度中的应用，其步骤是(其他常用于重金属细胞毒性检测的还有V79细胞、CHL 细胞、细胞等细胞系)1)氯化镉处理将Δ gshl突变株和BW7421菌株分别从斜面上接种于5mLYPD培养基中，200r/min，30°C振荡培养Mh ；分别加入氯化镉至终浓度为1、5和lOmmol/L，以不加氯化镉的样品为对照；所有样品于200r/min，3(TC振荡培养Mh ；所述的YPD组分为每升含蛋白胨20g、酵母提取物IOg和葡萄糖20g ；加入琼脂至终浓度为2% (w/v)，即为固体培养基；2)活细胞计数分别取步骤1)中，Δ gshl突变株和野生型BY47421菌株未加氯化镉及分别加入终浓度为1、5和lOmmol/L的氯化镉，经过24h振荡培养后的菌液，进行10倍连续稀释；分别取10_3、10_4和10_5稀释度样品涂布于YPD平板，每稀释度3块平板，涂布量为每平板200 μ L，30°C培养7 计数；3)细胞存活率和相对存活率的计算通过公式计算存活率和相对存活率，存活率(<% )=氯化镉处理后活细胞浓度/未用氯化镉处理活细胞浓度；相对存活率(％ ) = Δ gshl突变株存活率/相同处理条件下野生型BW7421菌株存活率；氯化镉终浓度为1、5和lOmmol/L时，Δ gshl突变株存活率分别为69. 8士8. 95%、 24. 5士2. 15%和 0. 22士0. 08%，野生型 BY47421 菌株存活率分别为 85士9. 5%、34士 1. 3% 和3. 9士0. 1%，而Agshl突变株相对存活率分别为82. 12士 10. 52%,72. 06士6. 32%和 5. 64士2.5%。相同浓度的氯化镉处理后，Δ gshl突变株存活率低于野生菌株的存活率，随氯化镉浓度增加，存活率差距增大。4)比较氯化镉处理后酿酒酵母细胞存活率，评估氯化镉的细胞毒性。比较不同浓度氯化镉处理后，野生型酿酒酵母BY47421菌株和Agshl突变株的存活率(氯化镉处理后活细胞浓度/未用氯化镉处理活细胞浓度)，以及△ gshl突变株相对存活率(△ gshl突变株活细胞浓度/相同处理条件下野生型BW7421菌株活细胞浓度)。从图1和2的结果中可以看出，在氯化镉达到lOmmol/L时Agshl突变株相对于野生型的存活率大为降低。 存活率的高低直接反映了酵母细胞对氯化镉细胞毒性的耐受性，突变株对氯化镉耐受性下降，对氯化镉更敏感，即采用Agshl突变株用于氯化镉等重金属的细胞毒性检测可以提高检测的灵敏度。 以上描述是对本发明的解释，不是对本发明的限定，本发明所限定的范围参见权利要求，在不违背本发明的精神的情况下，本发明可以做任何形式的修改。
权利要求
1.一种酿酒酵母的gshl缺失突变株，其特征在于酿酒酵母的AgShl突变株 YJLlOlC(Saccharomyces cerevisiae YJLlO1C)，CCTCC No :M 2011130。
2.权利要求1所述的一种酿酒酵母的gshl缺失突变株YJL101C的构建方法，其步骤是A、引物设计依据酿酒酵母gshl基因序列设计的引物 上游引物Pl GCAGATTTAGTATAGGGCTACATTGTAGGGTGGTTTAGAGTATCGAAAATATACATATAGAAGAATAAACGGA TCCCCGGGTTAATTAA ； 下游引物P2:GCTTTTTCAATCACCGTGTCACCCAAATCGATAATGTCAACTTTCTTTCACAACCGAAGTAAAAGGAGTGAAT TCGAGCTCGTTTAAAC ；B、PCR扩增利用上游引物Pl和下游引物P2对质粒pFA6a-KanMX6进行PCR扩增，获得含酿酒酵母gshl基因上下游序列的敲除片段；C、gshl基因的敲除通过醋酸锂/PEG的转化方法将PCR扩增得到的敲除片段导入酿酒酵母BY47421菌株细胞，筛选得到酿酒酵母的Agshl突变株。
3.权利要求1所述的一种酿酒酵母的gshl缺失突变株在提高检测氯化镉重金属对酵母细胞的细胞毒性灵敏度中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种酿酒酵母gsh1缺失突变株的构建方法及应用，步骤是A、获得Δgsh1突变株酿酒酵母基因同源重组敲除原理、引物设计、敲除片段转化方法按照文献所描述的方法进行(Yeast，1998，14953-962)，该方法是目前酿酒酵母中基因敲除的通用方法；依据酿酒酵母gsh1基因序列设计引物上游引物P1和下游引物P2；利用上游引物P1和下游引物P2对质粒pFA6a-Kan MX6进行PCR扩增，获得含酿酒酵母gsh1基因上下游序列的敲除片段；通过醋酸锂/PEG的转化方法将敲除片段导入酿酒酵母BY47421菌株细胞，筛选得到酿酒酵母的Δgsh1突变株YJL101C。利用微生物遗传学方法构建酿酒酵母细胞Δgsh1突变株，再利用突变株进行氯化镉等重金属细胞毒性的检测，以提高细胞毒性检测灵敏度，方法易行，操作简便。
文档编号C12Q1/02GK102296033SQ20111010926
公开日2011年12月28日 申请日期2011年4月26日 优先权日2011年4月26日
发明者庞代文, 李勇, 谢志雄 申请人:武汉大学