专利名称：基于细胞电子传感器的烟气冷凝物细胞毒性测定方法
技术领域：
本发明涉及卷烟主流烟气冷凝物细胞毒性的测定技术，具体说是涉及一种基于实时、无标记、高通量细胞传感器芯片的烟气冷凝物细胞毒性测定新方法。
背景技术：
体外毒理学试验对于人类健康风险评估、卷烟危害性评价和卷烟添加材料的毒性测定具有重大意义。其中，作为C0RESTA推荐方法之一的中性红试验是广泛接受的可行的体外细胞毒性测试方法。但中性红试验采用终点检测法，检测时间点的选取对检测结果有重大影响。中性红染料本身对细胞状态的影响也无法消除。此外，中性红染料染色、多个清洗步骤增加了弓I入人为误差的可能性。实时、无标记、高通量细胞传感技术是把微电子细胞传感器芯片整合到表面适于细胞贴附与生长的细胞培养微孔板的底部，通过微电极的阻抗变化实时定量监测细胞的贴壁和增殖状况。细胞电子传感芯片检测的阻抗大小由仪器换算为细胞因子，来表征微电极表面细胞有无和数量多少，无需染料标记即可反映细胞的数量和状态，真正实现对细胞效应应答的实时动态检测。与中性红吸收方法相比，该系统采用了非标记，无损伤的检测技术，能够最大程度的避免中性红染料染色、清洗步骤对于细胞毒性检测结果的干扰，真实反映检测目标物毒性。细胞电子传感器简化了细胞毒性检测步骤，除了细胞接种和化合物染毒外无需其他步骤，减少了人为操作对检测结果的影响。目前已有文献报道将实时细胞传感器用于不同化合物和新材料的细胞毒性测定， 并将结果与传统的MTT分析法、中性红吸收法检测结果进行对比，取得很好的相关性。证明了利用实时、无标记、高通量细胞电子传感器取代传统细胞毒性测试方法的可行性。目前还未见文献报道将细胞电子传感器应用于卷烟烟气的细胞毒性分析。凭借自动化实时监控， 无标记，高通量等一系列优势，开发基于细胞电子传感器的烟气细胞毒性测定新方法有望取得更好的准确性和重复性。
发明内容
本发明的目的旨在克服现有技术缺陷，简化细胞毒性检测步骤，无需中性红染料染色，提供一种利用细胞电子传感器测定卷烟主流烟气冷凝物细胞毒性的新方法，该方法能够通过细胞电子传感器微电极的阻抗变化实时定量监测细胞的贴壁、增殖状况以及被烟气冷凝物染毒后的细胞状态变化。通过不同浓度烟气冷凝物染毒后得到的细胞生长曲线自动求出烟气冷凝物的IC5tl值(半数抑制量)，该方法实时、无标记、高通量，对卷烟主流烟气冷凝物细胞毒性的测定更准确、重现性好。本发明的目的是通过以下技术方案来实现的
本发明的卷烟主流烟气冷凝物细胞毒性的测定方法包括以下工艺步骤 1 .烟气冷凝物的制备在ISO标准条件下平衡和抽吸卷烟，烟气总粒相物(TPM)通过静电捕集管收集。利用甲醇将烟气总粒相物洗脱后在氮吹条件下将甲醇溶剂挥发掉，最后根据TPM质量加入相应体积的DMSO溶剂，得到最终浓度为100 mg TPM/mL的标准储备液。 使用前在一 70 °C以下储存。2 .基于细胞电子传感器的烟气冷凝物细胞毒性测定
A、溶液背景扣除首先在底部整合了细胞电子传感芯片的细胞培养板(E-plate)的每个孔中加入50μ 培养基，然后将E-plate置于细胞培育箱中温浴30 min,避免由于温度变化引起阻抗信号的变化。将温浴后的E-plate放置于细胞培养箱中的芯片读取装置上， 通过数据分析系统的电脑软件开始实时监控阻抗变化。首先系统自动扣除50μ 培养基引起的阻抗信号变化背景，此时培养板中没有接种细胞，所以基于阻抗信号的细胞因子(Cell hdex)为0。电极的阻抗信号，取决于电极/溶液界面的特性，与电极表面性质和所处溶液的电导性质相关，与电极所处溶液的体积无关。在背景扣除步骤中，加入50μ 培养基与加入ΙΟΟμ 、200μ 相同培养基检测的阻抗信号没有差别(数据未列出)。B、优化细胞接种密度首先在细胞微电子传感芯片的各孔中加入IOOPL的细胞培养基进行背景扣除步骤，扣除由于液体培养基引起的微电极阻抗变化。然后取出细胞芯片，分别各孔中接种IOOPL不同浓度的CH0-K1细胞悬液，使得最终接种密度为1000,2500， 5000，10000，15000，20000，40000个/孔的CH0-K1细胞，每个浓度设定三孔平行。同时将只含有200μ 培养基的孔作为空白对照孔。将接种细胞后的细胞芯片置于细胞培养箱中的芯片读取装置上，通过数据分析系统的电脑软件对细胞的贴壁和增殖进行实时监控。通过不同细胞接种密度下的细胞生长曲线确定最佳细胞接种密度。最终确定每孔加入IOOPL含有5000个CH0-K1细胞的培养基溶液
C、染毒时间的确定通过对多次实验中细胞生长曲线的观察，可知CHO细胞在接种约 24小时左右进入指数增长期，此时细胞因子(cell index, CI值)达到1. 0-1. 3，表示细胞增殖对微孔板底面积的覆盖率约为60%，适于烟气冷凝物染毒。D、DMSO溶剂浓度的优化烟气冷凝物染毒溶液是将卷烟烟气粒相物分散于DMSO 溶剂中制备的。在细胞毒性实验中，为了真实反映烟气冷凝物的细胞毒性，应尽量降低DMSO 溶剂的影响。通过考察不同浓度DMSO溶剂的细胞毒性可知在检测终点(染毒后M小时) 时，当DMSO溶剂浓度低于0. 5%时，细胞生长曲线与溶剂对照组的生长曲线没有统计学差异 (P<0. 05)，没有表现出明显的细胞毒性，而当DMSO溶剂浓度高于0. 75%时，溶剂对照组的生长曲线与正常细胞生长曲线有统计学差异(P<0. 05)，表现出明显的细胞毒性，因此，最终烟气冷凝物染毒溶液中，DMSO溶剂浓度应不高于0. 5%，尽量减小染毒时溶剂的细胞毒性，真实反映出烟气冷凝物的细胞毒性。E、烟气冷凝物染毒将浓度为IOOmg TPM/mL的烟气冷凝物储备液用温浴的37°C 培养基稀释为一系列浓度梯度，每孔加入50μ 含烟气冷凝物的培养基，使得最终染毒浓度为 25Pg/mL、5(^g/mL、lOOPg/mL、15(^g/mL、20(^g/mL、25(^g/mL、30(^g/mL，每孔最终体积为200μ ，每个浓度平行6孔测定，同时设置DMSO溶剂对照组和正常对照组(加入50μ 培养基)。染毒后将E-plate置于细胞培养箱中的数据读取器上对细胞染毒后Mh内的状态变化继续进行实时监控。本方法采用依次加入50μ 培养基、IOOPL细胞悬液、50μ 染毒溶液的方法实现细胞毒性的测定，与其他文献报道的在染毒步骤时将培养孔中原有培养基弃除，更换为染毒溶液的染毒方式有所不同。文献报道的更换培养基为染毒溶液的染毒方式可能存在各个培养孔中培养基弃除程度不同的缺陷，由于弃除后培养孔中残留的培养基体积不同而影响染毒溶液的最终浓度不同。因此，本方法采用准确控制加入体积，确保染毒溶液浓度准确的方法。F、IC5tl值的求出通过不同浓度烟气冷凝物作用下的细胞生长曲线，细胞电子传感器的数据分析系统自动求出染毒后任意时刻该烟气冷凝物的IC5tl值。本方法以染毒后M 小时得到的该烟气冷凝物的IC5tl值作为评价该烟气冷凝物细胞毒性的标准。本发明中采用的培养基成分是2mM L-谷氨酰胺，1. 5克/升碳酸氢钠的F1I，90% ； 胎牛血清，10%。细胞培养条件为温度37°C，环境为95%的空气和5%的C02。所用试剂、器材均经消毒，整个实验过程均在无菌操作环境中完成。本发明的方法克服了现有细胞毒性测定方法的不足，利用能实时监控细胞状态的细胞电子传感器控制细胞质量、优化了细胞接种密度、烟气冷凝物染毒时间、烟气冷凝物染毒浓度等条件。与现有技术相比本发明方法具有如下优良效果
①利用细胞电子传感器可控制细胞质量由于细胞固有的粘附性质、细胞形态及细胞分裂速率不同，不同培养细胞株显示完全不同的粘附和生长动态曲线。通过绘制中国仓鼠卵巢细胞Kl亚株(CHO-Kl)特异性生长动态曲线，可实现对细胞质量的监控。②优化细胞接种密度通过不同接种密度条件下细胞的生长曲线可直观地优化细胞接种密度。避免细胞接种密度过高时，接种后细胞之间产生接触抑制，或细胞接种密度过低时，接种后细胞增殖速率太慢。③精确染毒时间在细胞毒性测定试验中，染毒时间需要在细胞进入指数增长期后。通过实时监控细胞接种后的生长动态曲线可以直观判断出细胞处于指数增长期的时间段，利于染毒时间的确定。④优化染毒溶液中DMSO溶剂浓度通过考察不同DMSO浓度的细胞毒性优化最终染毒溶液中DMSO溶剂浓度，尽量降低最终烟气冷凝物染毒溶液中DMSO溶剂的细胞毒性影响，真实反映烟气冷凝物的细胞毒性。⑤优化烟气冷凝物的染毒浓度合适的染毒浓度对于半数抑制量(IC5tl值)的准确计算非常重要。通过实时监控细胞染毒后的动态曲线可以直观了解细胞在该染毒浓度下的存活状况，有利于快速确定合适的烟气冷凝物染毒浓度。⑥本方法具有操作步骤简单的优势，除了细胞接种和烟气冷凝物染毒外无需其他步骤。⑦本方法无需加入任何指示剂，能够最大程度的避免传统毒性检测技术中染料毒性对于细胞毒性检测结果的干扰，能够真实反映检测目标物毒性。⑧本方法具有高通量的优势，能同时监控6X96孔板的细胞状态。本发明具有操作准确、灵敏度高及重复性好的优点。
图1.本发明的测定方法流程图。图2.细胞电子传感器的结构示意图。图2中1为E-plate细胞培养板，2为C02培养箱，3、信号分析读取系统。图3.不同细胞接种密度下的细胞生长曲线。图4.细胞电子传感器和MTT法对细胞的定量分析。
图5. DMSO溶剂浓度的优化。图6.细胞电子传感器监控的细胞变化曲线。图7.细胞电子传感器绘制的浓度对数-响应值曲线。
具体实施例方式本发明以下结合附图将具体的工艺过程进一步详述如下
1.细胞电子传感器的结构如附图中图2所示，细胞电子传感器由三部分组成一为细胞电子传感芯片，是将插式金电极整合到适于细胞生长的培养板底部制成，当加入细胞到培养板中，培养板底部金电极的阻抗与其表面细胞的附着和增殖情况有关；二为芯片读取装置，芯片读取装置放置于CO2细胞培养箱中，用于读取细胞电子芯片各个培养孔的阻抗信号；三为数据分析系统，芯片读取装置与数据分析系统通过数据带相连，当细胞电子传感芯片安置于芯片读取装置上，即可通过数据分析系统对阻抗信号进行实时读取和分析。2.细胞接种密度的优化图3为细胞微电子传感器监测的不同接种密度条件下的细胞生长曲线，其中CHO-Kl细胞接种密度分别为1000，2500，5000，10000，15000，20000， 40000个/孔。如图3可知，细胞接种密度较低时，接种后细胞潜伏期很长，细胞增殖缓慢， 不利于细胞毒性的测定。细胞接种密度过高时，接种后细胞之间产生接触抑制，无法观察到明显的指数增长期，且平行孔之间的阻抗检测信号偏差更大。当细胞接种密度为5000个细胞/孔时，通过曲线可清晰观察到细胞的不同时期a.细胞黏附和延展阶段；b.停滞期； c.指数生长期；d.稳定期和衰亡期。因此本实验中选择最佳细胞接种密度为5000个细胞 /孔。3.烟气冷凝物染毒时间的优化在细胞毒性测定试验中，染毒时间需要在细胞进入指数增长期后。本方法通过实时监控细胞接种后的生长动态曲线可以直观判断出细胞处于指数增长期的时间段，利于染毒时间的确定。由图3中细胞接种密度为5000个细胞/孔的细胞生长曲线可知，细胞接种约26小时后，细胞进入指数增长期，接种约80小时后细胞进入衰亡期。因此确定烟气冷凝物染毒时间为接种后沈小时左右，该时刻细胞已处于指数增长期，且染毒后的观测时期均处于指数增长期。4.细胞生长曲线用于细胞质量控制由于细胞固有的粘附性质、细胞形态及细胞分裂速率不同，不同培养细胞株显示完全不同的粘附和生长动态曲线。本实验中选择图3 中5000个细胞/孔的细胞生长曲线为实验中CHO-Kl细胞的质量控制曲线。质量控制曲线为同一个实验和不同实验间的细胞提供了质量控制标准，可以正确、准确地操作和处理细胞，而不是假定细胞处于合适的处理阶段。每次实验时，将细胞生长曲线与质量控制曲线进行比对，以相同检测时间点的信号偏差小于10%为细胞质量控制的标准，控制每次实验细胞的状态尽量保持一致，提高细胞毒性检测的重复性。本发明实验过程中，每次实验细胞生长曲线与质量控制曲线的偏差均小于10%。5.细胞电子传感器表征活细胞个数的准确性验证基于阻抗信号检测到的细胞因子值能否准确表现活细胞的数量和状态是细胞电子传感器用于烟气冷凝物细胞毒性检测的关键。因此通过准确细胞计数后，分别在细胞电子传感芯片和普通细胞培养板中接种 172，497，2491，4000，6000，8000，10000个/孔的CHO-Kl细胞，每个接种密度设定6平行。细胞接种6小时后，用细胞电子传感器得到的细胞因子与细胞接种个数作图得到图4A，用MTT法检测得到的吸光度值与普通细胞培养板中细胞接种个数作图得到图4B，由图4A可知检测得到的细胞因子值与接种细胞个数成很好的线性关系，细胞电子传感器可以准确反应细胞贴附增殖状态和活细胞数量。细胞电子传感器对活细胞数量测定的准确性与经典的MTT 法相当。6.溶剂浓度的优化烟气冷凝物染毒溶液是将卷烟烟气粒相物分散于DMSO溶剂中制备的。在细胞毒性实验中，为了真实反映烟气冷凝物的细胞毒性，应尽量降低DMSO溶剂的影响。图5考察了不同浓度DMSO溶剂的细胞毒性。如图可知，随DMSO溶剂浓度的增高，细胞因子降低程度逐渐增大。根据统计学数据分析，在检测终点(染毒后M小时)时， 当DMSO溶剂浓度低于0. 5%时，细胞生长曲线与溶剂对照组的生长曲线没有统计学差异 (P<0. 05)，没有表现出明显的细胞毒性，而当DMSO溶剂浓度高于0. 75%时，溶剂对照组的生长曲线与正常细胞生长曲线有统计学差异(P<0. 05)，表现出明显的细胞毒性，因此，最终烟气冷凝物染毒溶液中，DMSO溶剂浓度应不高于0. 5%，尽量减小染毒时溶剂的细胞毒性，真实反映出烟气冷凝物的细胞毒性。7.烟气冷凝物的染毒浓度的优化合适的染毒浓度对于化合物细胞毒性的准确测定至关重要。通过实时监控细胞染毒后的动态曲线可以直观了解细胞在该染毒浓度下的存活状况，有利于快速确定合适的烟气冷凝物染毒浓度。通过大量实验可知，烟气冷凝物的染毒浓度设定为25，50，100，150，200，250，30(^g/mL时，可以满足浓度对数-响应值曲线的绘制，保证半数抑制量(IC50值)的准确计算。本发明以下结合实例做进一步描述，但并不是限制本发明。实例1
1.试剂与仪器
二甲亚砜DMSO (生物试剂纯，纯度高于99% )，MTT染料。CHO-Kl中国仓鼠卵巢细胞亚株购于中国科学院上海生科院细胞资源中心。CHO-Kl细胞培养基的具体成分为2mM L-谷氨酰胺，1. 5克/升碳酸氢钠的F1I，90% ；胎牛血清，10%。xCELLigence细胞电子传感器 (Roche Applied Science and ACEA Biosciences)，96 孔细胞电子传感芯片。AE163 电子天平(感量0. 0001 g)(瑞士 Mettler公司)。2.烟气冷凝物储备液的制备
首先在ISO标准条件下平衡卷烟样品A，按照FTC抽吸模式抽吸卷烟，主流烟气总粒相物(TPM)通过静电捕集管收集。利用甲醇将烟气总粒相物洗脱后在氮吹条件下将甲醇溶剂挥发掉，最后根据TPM质量加入相应体积的DMSO溶剂，得到最终浓度为100 mg TPM/mL的标准储备液。使用前在一 70 °C以下储存。3.不同浓度染毒溶液的制备
不同浓度烟气冷凝物的配制是用培养基稀释100 mg TPM/mL的烟气冷凝物储备液，制备烟气冷凝物浓度为100，200，400，600，800，1000,1200 Pg/mL的培养基溶液。4.细胞毒性的测定
首先，在E-plate上每孔加入50μ 培养基，系统扣除溶液背景后，通过精确细胞计数后在E-plate上每孔加入ΙΟΟμ 含有5000个CHO细胞的培养基。利用细胞电子传感器实时监控细胞的贴壁和增殖状况。约M小时后，能观测到细胞进入指数增长期时，进行不同浓度烟气冷凝物的染毒。利用不同浓度的烟气冷凝物对细胞进行染毒，每孔加入50μ 含烟气冷凝物的培养基溶液，由于50μ 稀释至200μ ，使得最终烟气冷凝物的染毒浓度为25，50， 100,150，200，250，300 gg/mL，每个浓度平行6孔测定。同时设定6平行的溶剂对照组和空白对照组。测定结果如图6所示，根据不同浓度烟气冷凝物染毒M小时后的细胞因子值， 系统自动绘制浓度对数-响应值曲线(图7)，并根据曲线给出卷烟样品A烟气冷凝物的IC50 值为 155. 7 Pg/mL。实例2:
如实施例1所述，测得卷烟样品B和样品C烟气冷凝物的IC5tl值分别为94. 7Pg/mL和 115.9 Pg/mL。同时还使用C0RESTA推荐方法中性红吸收法和经典方法MTT法对卷烟样品A和B的烟气冷凝物进行细胞毒性评价，三种方法的检测结果如表1所示，如表可知，细胞电子传感器法的细胞毒性测定结果与中性红法和MTT法相一致，但具有快速、准确、无需标记、步骤简便和重现性好等优势。
权利要求
1.一种基于细胞电子传感器的烟气冷凝物细胞毒性测定方法，其特征在于包括以下工艺步骤(1)、烟气冷凝物的制备制备最终浓度为100 mg TPM/mL的标准储备液；基于细胞电子传感器的烟气冷凝物细胞毒性测定溶液背景扣除首先在底部整合了细胞电子传感芯片的细胞培养板(E-plate)的每个孔中加入50μ 培养基，放置于细胞培养箱中的芯片读取装置上，系统自动扣除由培养基引起的阻抗信号变化背景，从而实现对细胞引起信号变化的监控；细胞接种取出E-plate，每孔加入ΙΟΟμ 含有5000个CHO-Kl细胞的培养基溶液，置于芯片读取装置上，通过数据分析系统显示的细胞因子(cell index, CI值)实时监测细胞的贴附与增殖状态；染毒时间的确定当细胞处于指数增长期时进行烟气冷凝物染毒；DMSO溶剂浓度的优化DMS0溶剂浓度低于0. 5% ；烟气冷凝物染毒将浓度为IOOmg TPM/mL的烟气冷凝物储备液用培养基稀释为一系列浓度梯度，每孔加入50μ 含烟气冷凝物的培养基，使得最终染毒浓度为25Pg/mL、5(^g/ mL、10(^g/mL、15(^g/mL、20(^g/mL、25(^g/mL、30(^g/mL，每个浓度平行 6 孔测定，同时设置 0. 3%的DMSO溶剂对照组和正常对照组(加入50μ 培养基)；染毒后将E-plate置于芯片读取器上对细胞染毒后Mh内的状态变化继续进行实时监控；IC5tl值的求出通过不同浓度烟气冷凝物作用下的细胞生长曲线，细胞电子传感器的数据分析系统将自动绘制染毒浓度对数-响应值曲线，求出染毒M小时时该烟气冷凝物的 IC50 值。
2.根据权利要求1所述的基于细胞电子传感器的烟气冷凝物细胞毒性测定方法，其特征在于烟气冷凝物的制备方法如下在ISO标准条件下平衡和抽吸卷烟，烟气总粒相物 (TPM)通过静电捕集管收集，利用甲醇将烟气总粒相物洗脱后在氮吹条件下将甲醇溶剂挥发掉，加入DMSO溶剂，制备最终浓度为100 mg TPM/mL的标准储备液。
3.根据权利要求1所述的基于细胞电子传感器的烟气冷凝物细胞毒性测定方法，其特征在于培养基成分是2mM L-谷氨酰胺，1. 5克/升碳酸氢钠的F12K，90% ；胎牛血清，10%。
4.根据权利要求1所述的基于细胞电子传感器的烟气冷凝物细胞毒性测定方法，其特征在于细胞培养条件为温度37°C，环境为95%的空气和5%的C02。
全文摘要
一种基于细胞电子传感器的烟气冷凝物细胞毒性测定方法，其特征在于包括以下工艺步骤1)配制实验试剂，2)制备烟气冷凝物，3)细胞接种培养，4)烟气冷凝物染毒，5)结果与分析。本发明是利用细胞传感器芯片实时监控细胞生长情况和卷烟主流烟气冷凝物染毒后不同冷凝物浓度对细胞生长的影响。建立了实时、无标记、高通量的卷烟主流烟气冷凝物的细胞毒性测定新方法。本发明与中性红吸收方法相比减少了中性红染色和繁复的清洗步骤，使得试验过程更加简便；同时根据细胞接种后的实时细胞生长曲线对细胞进行质量控制，优化染毒时间和染毒浓度，实时监控染毒后不同烟气冷凝物浓度对细胞生长曲线的影响，使实验结果更加准确可靠。
文档编号C12Q1/02GK102242181SQ20111010883
公开日2011年11月16日 申请日期2011年4月28日 优先权日2011年4月28日
发明者刘楠, 唐纲岭, 姜兴益, 庞永强, 张洪非, 李中皓, 李雪, 胡清源, 陈再根, 陈欢 申请人:中国烟草总公司郑州烟草研究院