专利名称：高特异性检测ndm-1基因的引物组合物及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种高特异性检测NDM-I基因的引物组合物及其应用。
背景技术：
早在人类诞生之前，细菌便开启了自己的生命历程，二战期间细菌严重威胁了人类的生命。19 年，弗莱明偶然间发现了青霉素(Penicillin)，随着抗生素药物的问世，细菌的耐药性在一些国家得到一定的控制。1961年，后英国学者Jevons首次发现了耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌(Methicillin-resitant Staphylococcus aureus，MRSA)，MRSA 能分泌一种酚可溶性调控蛋白(Phenol-soluble modulin，PSM)破坏人类的嗜中性粒细胞，形成严重感染——第一任“超级细菌”就此诞生。近年来抗生素滥用及抗生素累积的双重因素， 使得细菌中的耐药基因不断积累，从而产生了多重抗药性。据2010年8月11日出版的英国《The Lancet Infectious Diseases》期刊报道，目前有一种新的耐药基因在一些国家流行，一些西方医学家称其为NDM-I基因。NDM-I 基因编码的蛋白被命名为“新德里金属- β-内酰胺酶1 (New Metallo-^-Lactamase-D0 新德里金属- β -内酰胺酶1由269个氨基酸残基组成，与现有的其它金属- β -内酰胺酶 (Metallo-β -Lactamase)的一致性不足33%，且在酶活性位点附近经常有其独特的氨基酸残基及插入序列，并能与碳青霉烯类抗生素紧密结合。NDM-I基因目前已发现于克雷伯式杆菌的1801Λ的质粒和大肠杆菌的1401Λ的质粒上。在NDM-I基因上游的2个区域中还存在能够抵抗链霉素、红霉素、氯霉素、利福平等抗生素的基因以及消毒剂和磺胺药物的多种耐药基因。由于含有NDM-I基因的质粒即能在菌株之间穿梭传递，又可以在转移中发生重组，且通过携带NDM-I基因的质粒的传递，还可使对抗生素敏感的细菌获得多重耐药性，大大增加临床抗生素使用的困难。目前，携带有NDM-I基因的超级细菌正在全球蔓延，印度、美国、英国、澳大利亚、 加拿大、法国、荷兰等多个国家已经出现了疑似病例。面对“超级细菌”的跨国传播趋势，寻找一种简便、快速、准确的耐药基因检测方法成为许多科研工作者的重大课题，也是临床实践检验中急切解决的问题。建立快速、简便、可靠的检测方法对NDM-I基因进行检测，对于指导临床的早期治疗和有效的控制超级细菌的传播具有重大意义。LAMP (Loop-Mediated Isothermal Amplification) ^ 2000 Notomi
明的一种新颖的恒温核酸扩增方法。该方法采用特异地识别靶序列上六个区域的四条引物 (两条外引物，两条内引物)及具有链置换活性的Bst DNA聚合酶，在65°C左右进行核酸的指数级扩增，其扩增效率可达到IO9-IOltl个拷贝数量级。整个反应仅需1小时，在扩增反应中副产物焦磷酸镁沉淀与钙黄绿素结合，产生黄绿色荧光，不需要借助其他仪器便可辨别实验结果。LAMP技术具有简便、快速、准确、廉价、易检测等特点。目前，国内外尚未见LAMP 方法检测NDM-I基因的报道
发明内容
本发明的目的是提供一种高特异性检测NDM-I基因的引物组合物及其应用。本发明提供的辅助检测NDM-I蛋白(新德里金属-内酰胺酶1)的编码基因的专用引物，由序列表的序列1所示DNA、序列表的序列2所示DNA、序列表的序列3所示DNA、 序列表的序列4所示DNA、序列表的序列5所示DNA和序列表的序列6所示DNA组成。本发明还保护一种辅助检测NDM-I蛋白的编码基因的试剂盒，包括所述的专用引物。所述专用引物可用于制备辅助检测NDM-I蛋白的编码基因的试剂盒。所述专用引物或所述试剂盒可用于辅助检测NDM-I蛋白的编码基因。所述专用引物或所述试剂盒可用于辅助鉴定含有NDM-I蛋白的编码基因的生物样本。所述NDM-I蛋白是如下(a)或(b)的蛋白质(a)由序列表中序列7所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列7的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列7衍生的蛋白质。所述NDM-I蛋白的编码基因为如下(1)或(2)或(3)或⑷所述的DNA分子(1)序列表中序列8所示的DNA分子；(2)序列表的序列8自5’末端第14至拟6位核苷酸所示的DNA分子；(3)在严格条件下与(1)或O)限定的DNA序列杂交且编码相同功能蛋白的DNA 分子；(4)与⑴或⑵限定的DNA序列至少具有90%以上同源性且编码相同功能蛋白的DNA分子。本发明还保护一种辅助鉴定待测生物样本是否含有NDM-I蛋白的编码基因的方法，包括如下步骤(1)提取所述待测生物样本的基因组DNA ；(2)以步骤(1)的基因组DNA为模板，用所述的专用引物进行环介导恒温扩增；(3)根据步骤O)的扩增产物鉴定所述待测生物样本是否含有所述NDM-I蛋白的
编码基因。所述环介导恒温扩增的反应程序可为65°C 1小时，80°C 5分钟。所述环介导恒温扩增的反应体系中，序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2 所示DNA的浓度均可为0. 2 μ mol/L,序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA 的浓度均可为1. 6 μ mol/L,序列表的序列5所示DNA和序列表的序列6所示DNA的浓度均可为 0. 8 μ mol/L。所述待测生物样本可为大肠杆菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus)、月市炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)或月市炎链球菌 (Streptococcus pneumoniae)。所述大肠杆菌具体可为大肠杆菌DH5 α、所述金黄色葡萄球菌具体可为金黄色葡萄球菌ATCC25923、所述肺炎克雷伯氏菌具体可为肺炎克雷伯氏菌EL-2株、所述肺炎链球菌具体可为肺炎链球菌R6。所述环介导恒温扩增的反应体系中含有钙黄绿素时，可通过荧光显色进行结果判读，如果环介导等温扩增体系显示为绿色，待测生物样本中含有所述NDM-I蛋白的编码基因，如果环介导等温扩增体系显示为橙色，待测生物样本中不含有所述NDM-I蛋白的编码基因。还可通过观察沉淀进行结果判读，如果环介导等温扩增体系中生成白色沉淀，待测生物样本中含有所述NDM-I蛋白的编码基因，如果环介导等温扩增体系中没有生成白色沉淀，待测生物样本中不含有所述NDM-I蛋白的编码基因。还可通过琼脂糖凝胶电泳进行结果判读，如果反应产物的琼脂糖凝胶电泳显示梯状条带，待测生物样本中含有所述NDM-I蛋白的编码基因，如果反应产物的琼脂糖凝胶电泳不显示梯状条带，待测生物样本中不含有所述NDM-I蛋白的编码基因。还可通过浊度仪进行结果判读，从反应开始时刻即通过Loopamp浊度仪检测反应液，如果生成浊度变化曲线待测生物样本中含有所述NDM-I蛋白的编码基因，如果没有生成浊度变化曲线待测生物样本中不含有所述NDM-I蛋白的编码基因。应用所述专用引物可以通过LAMP(环介导恒温扩增)技术从分子水平上直接快速、准确检测NDM-I耐药基因，具有如下优点⑴在恒温条件下即可发生反应，摆脱了了对于仪器的依赖；⑵反应时间短；在Ih内即可完成；(3)灵敏度高；比传统PCR扩增技术提高了两个数量级，最低检测限为eOcopies/反应；(4)特异性强；应用6个靶基因位点，内引物及外引物在6个区域特异性结合方可进行扩增；( 鉴定简便；在核酸大量合成时，从 dNTP解离出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg2+结合，产生副产物-焦磷酸镁沉淀；如果在反应体系中加入结合了 Mn2+的钙黄绿素，Mg2+则替换掉钙黄绿素中结合的Mn2+，是钙黄绿素发出黄绿色荧光；以上两种方法均不需要借助其他仪器便可肉眼观察实验结果，实现了结果可视化；也可通过Loopamp浊度仪检测的方式进行结果判读；(6)步骤简单；先将DNA 模板在96°C，预变性:3min。再将所有配制在一起的试剂，一步添加进去，实现一步核酸扩增，免开盖操作，可保证临床检验人员自身安全，进而亦避免了“超级细菌”的传播。应用本发明提供的专用引物检测NDM-I蛋白的编码基因，解决了其他检测技术对于临床实际应用需求的针对性不强的技术弊端，并且解决了其他检测技术耗时长、操作复杂、检测仪器昂贵、灵敏度及特异性差等技术问题，具有灵敏度高、速度快、特异性强、简便、 安全等特点，为快速、准确的检测NDM-I耐药基因打下坚实的基础，其广泛应用将大大提高低仪器配置地区的病原微生物检测能力，对病原微生物的早期、准确诊断有着重大意义。本发明不仅可指导临床合理用药，以免延误病情和增加治疗费用，而且有利于控制其传播，防止暴发流行，这对提高治疗效果和控制医院内感染均有重要意义。
图1为实施例2中通过检测浊度变化判读结果。图2为实施例3中通过琼脂糖凝胶电泳判读结果。图3为实施例4中NDM-I基因语同源序列的BLAST比对结果。图4为对比例中的琼脂糖凝胶电泳图。
具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。大肠杆菌(Escherichia coli)DH5a 公众可以从中国科学院微生物研究所获得； 参考文献韩俊，陈岚，段淑敏等，金属催化剂有效快速裂解SARS冠状病毒和其他微生物， 中国实验动物学报，2006年9月，第14卷，第3期，199-212页。金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)ATCC25923 公众可以从中国科学院微生物研究所获得；参考文献王坚，吴梅，陆炜方等，48株金黄色葡萄球菌检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌及药敏分析，中国煤炭工业医学杂志，2009年1月第12卷第1期，93-94。肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)EL-2株公众可以从中国科学院微生物研究所获得；参考文献孔庆娟，刘马峰，白建等，大肠埃希氏菌和肺炎克雷伯氏菌的药敏试验，畜禽业，2005年第1期总第177期，64-66。肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae) R6 公众可以从中国科学院微生物研究所获得；参考文献张巧，林科雄，马千里等，肺炎链球菌溶菌酶作为肺炎链球菌多价核酸疫苗候选抗原的保护效能评价，重庆医科大学学报，2010年第35卷第5期。实施例1、专用引物的设计和制备设计并合成表1所示的各条引物(FOP、BOP, FIP、BIP、FLP和BLP)。表1所示的六条引物组成专用引物，用于实施例2。表1引物的核苷酸序列
权利要求
1.辅助检测NDM-I蛋白的编码基因的专用引物，由序列表的序列1所示DNA、序列表的序列2所示DNA、序列表的序列3所示DNA、序列表的序列4所示DNA、序列表的序列5所示 DNA和序列表的序列6所示DNA组成；所述NDM-I蛋白是如下(a)或(b)的蛋白质(a)由序列表中序列7所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列7的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列7衍生的蛋白质。
2.一种辅助检测NDM-I蛋白的编码基因的试剂盒，包括权利要求1所述的专用引物；所述NDM-I蛋白是如下(a)或(b)的蛋白质(a)由序列表中序列7所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列7的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列7衍生的蛋白质。
3.权利要求1所述专用引物在制备辅助检测NDM-I蛋白的编码基因的试剂盒中的应用；所述NDM-I蛋白是如下(a)或(b)的蛋白质(a)由序列表中序列7所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列7的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列7衍生的蛋白质。
4.权利要求1所述专用引物或权利要求2所述试剂盒在辅助检测NDM-I蛋白的编码基因中的应用；所述NDM-I蛋白是如下(a)或(b)的蛋白质(a)由序列表中序列7所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列7的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列7衍生的蛋白质。
5.权利要求1所述专用引物或权利要求2所述试剂盒在辅助鉴定含有NDM-I蛋白的编码基因的生物样本中的应用；所述NDM-I蛋白是如下(a)或(b)的蛋白质(a)由序列表中序列7所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列7的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列7衍生的蛋白质。
6.如权利要求1所述的专用引物，如权利要求2所述的试剂盒，或如权利要求3至5中任一所述的应用，其特征在于所述NDM-I蛋白的编码基因为如下⑴或(2)或(3)或⑷ 所述的DNA分子(1)序列表中序列8所示的DNA分子；(2)序列表的序列8自5’末端第14至拟6位核苷酸所示的DNA分子；(3)在严格条件下与(1)或(2)限定的DNA序列杂交且编码相同功能蛋白的DNA分子；(4)与(1)或(2)限定的DNA序列至少具有90%以上同源性且编码相同功能蛋白的 DNA分子。
7.一种辅助鉴定待测生物样本是否含有NDM-I蛋白的编码基因的方法，包括如下步骤(1)提取所述待测生物样本的基因组DNA;(2)以步骤(1)的基因组DNA为模板，用权利要求1所述的专用引物进行环介导恒温扩增；(3)根据步骤O)的扩增产物鉴定所述待测生物样本是否含有NDM-I蛋白的编码基因；所述NDM-I蛋白是如下(a)或(b)的蛋白质(a)由序列表中序列7所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列7的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列7衍生的蛋白质。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于所述NDM-I蛋白的编码基因为如下(1)或 ⑵或(3)或(4)所述的DNA分子(1)序列表中序列8所示的DNA分子；(2)序列表的序列8自5’末端第14至拟6位核苷酸所示的DNA分子；(3)在严格条件下与(1)或(2)限定的DNA序列杂交且编码相同功能蛋白的DNA分子；(4)与(1)或(2)限定的DNA序列至少具有90%以上同源性且编码相同功能蛋白的 DNA分子。
9.如权利要求7或8所述的方法，其特征在于所述环介导恒温扩增的反应程序为 650C 1小时，80°C 5分钟。
10.如权利要求7或8或9所述的方法，其特征在于所述环介导恒温扩增的反应体系中，序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA的浓度均为0. 2 μ mol/L,序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA的浓度均为1. 6 μ mol/L,序列表的序列5所示 DNA和序列表的序列6所示DNA的浓度均为0. 8 μ mol/L。
全文摘要
本发明公开了一种高特异性检测NDM-1基因的引物组合物及其应用。本发明提供了辅助检测NDM-1蛋白的编码基因的专用引物，由序列表的序列1、序列2、序列3、序列4、序列5和序列6所示DNA组成；NDM-1蛋白是由序列7所示的氨基酸序列组成的蛋白质。应用所述专用引物检测，具有灵敏度高、速度快、特异性强、简便、安全等特点，其广泛应用将大大提高低仪器配置地区的病原微生物检测能力，对病原微生物的早期、准确诊断有着重大意义。本发明不仅可指导临床合理用药，以免延误病情和增加治疗费用，而且有利于控制其传播，防止暴发流行，这对提高治疗效果和控制医院内感染均有重要意义。
文档编号C12N9/80GK102181558SQ20111010851
公开日2011年9月14日 申请日期2011年4月28日 优先权日2011年4月28日
发明者张苑怡, 朱宝利, 武娜, 王志云 申请人:中国科学院微生物研究所