专利名称：具有溶藻活性的微小杆菌及其在蓝藻水华控制中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及的是一种微生物应用技术领域的菌株及方法，具体是一种具有溶藻活性的微小杆菌及其在蓝藻水华控制中的应用。
背景技术：
随着全球水体富营养化的加剧，有害藻类水华的爆发日趋频繁，其造成的环境和经济问题日益引起人们的重视，针对我国湖泊面临的严重富营养化问题，在湖内污染源、流域点源与面源污染控制需要投入巨大资金且短期内难以取得成效的情况下，探索控制浮游藻类生物量和抑制“水华”发生的有效途径是非常必要的。藻类的控制技术可归纳为物理方法、化学方法和生物方法。物理方法主要是电磁场、机械除藻等，可作为蓝藻水华控制的辅助性措施，但处理能力有限。化学除藻的方法主要包括施用除草剂、杀藻剂及金属盐等， 化学药剂除藻技术虽有快速高效的优点，但会带来水体的二次污染问题，不适于在作为饮用水源地的水域应用。在利用物理、化学和常规方法治理水华不甚理想的情况下，寻找一种更加有效的水华防治途径势在必行。溶藻细菌作为防治水华的可能微生物已经引起越来越多的关注。据报道，多数溶藻细菌能够分泌胞外物质，可对宿主藻类起到抑制或者灭杀的作用，因此通过筛选高效溶藻细菌或分离富集溶藻细菌产生的高效溶藻物质开发生物杀藻剂就成为一个很有发展潜力的新思路。从自然水体中分离纯化出可以抑制和灭杀铜绿微囊藻(Microcystis)(蓝藻水华中最常见和主要藻类)的溶藻细菌，对于安全、快速和高效治理蓝藻水华问题具有重要的实践价值。
发明内容
本发明针对现有技术存在的上述不足，提供一种具有溶藻活性的微小杆菌及其在蓝藻水华控制中的应用，从太湖水体中分离获得了一株具有较强溶藻活性的微小杆菌A27， 可以用于新型杀藻剂的研发和生产，最终应用于湖泊蓝藻水华的控制。本发明是通过以下技术方案实现的本发明涉及一株具有溶藻活性的微小杆菌A27，其学名为Exiguobacterium sp. A27，该菌株为杆菌，1. 1 1. 2 μ mX 1. 4 3. 2 μ m，革兰氏阳性，不生孢，不抗酸。以周生鞭毛运动。兼性厌氧。在营养琼脂上菌落平坦，淡橙色，色素不扩散。嗜碱，能在PH6.5 11. 5生长。化能异养菌，发酵代谢。可以利用葡萄糖、蔗糖、半乳糖和一些其他糖产酸，主要产物是乳酸、乙酸和甲酸。该菌株接触酶阳性，氧化酶阴性。可以还原硝酸盐，水解明胶、 淀粉和酪素。最适生长温度37°C。经16s rRNA基因序列分析和同源性比较，得知其与某微小杆菌菌株有97%的同源性，故鉴定为微小杆菌属细菌，命名为微小杆菌A27，该菌种的 16s rRNA基因在GenBank中的登录号是FJ751911。上述具有溶藻活性的微小杆菌A27保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC No. 4114，保藏日期为2010年10月1日。
保藏机构地址北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所，邮编100101 电话86-10-64807596。本发明涉及上述微小杆菌A27的无菌发酵液的制备方法，通过将微小杆菌A27接种于pH7. 0的灭菌LB液体培养基中，在37°C、200rpm的环境下发酵M小时得到其含菌发酵液；进一步经12000g离心20min后将上清再用0. 22 μ m孔径的膜过滤，得到无菌发酵液。本发明涉及利用上述微小杆菌A27抑制蓝藻水华，通过将所述微小杆菌A27制备得到的无菌发酵液用旋转蒸发器蒸干后经过甲醇溶取后用于溶藻。实验表明，上述微小杆菌A27的溶藻效果具有广谱性。在细菌密度高于4X107个 /mL时A27对铜绿微囊藻表现出了很好的溶藻效果，同时微小杆菌A27对处于延滞期和对数期的铜绿微囊藻具有很好的溶藻效果；同时微小杆菌A27用液体LB培养后的含菌发酵液及离心过滤除菌后的无菌发酵液都均有较强的溶藻活性。该无菌发酵液经过高温处理后溶藻活性没有明显下降，说明发酵液中的溶藻成分具有热稳定性。微小杆菌A27发酵液中的溶藻活性成分可以用甲醇提取出来，该甲醇提取物也具有很强的溶藻活性。微小杆菌A27及其发酵液和甲醇提取物均可用于蓝藻水华或其它微藻的控制。
图1为加入的A27菌液中细菌密度差异对溶藻效果的影响示意图；图中(a)微小杆菌A27不同接种浓度时铜绿微囊藻细胞密度随时间的变化曲线。 (b)微小杆菌A27不同接种浓度时细菌密度随时间的变化曲线(■对照，眷1. 5X IO4, A 1. 5Χ105,τ 1. 5Χ106，《1. 5Χ107 和1. 5Χ108 个/mL)。图中箭头表示接种点。图2为A27菌液对三个不同生长阶段铜绿微囊藻的溶藻效果示意图；图中■对照，·对数期藻，▲延滞期藻，▼平台期藻)。图中箭头表示接种点ο图3为A27无菌发酵液、121°C热处理后的无菌发酵液、发酵液甲醇提取物和空白 LB培养基的溶藻效果示意图；图中(a)微小杆菌A27的无菌发酵液溶藻效果(浓缩10倍)。(b)微小杆菌A27 的无菌发酵液经过高温灭菌后的溶藻效果(浓缩10倍)。(C)微小杆菌A27发酵液的甲醇提取物的溶藻效果.(d) LB培养基溶藻效果(浓缩10倍，作对照)。
具体实施例方式下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。实施例1.溶藻细菌的筛选将太湖梅梁湾水域采集的自然水样50 μ 1接种于5mL LB液体培养基中培养富集 24h (37°C，200rpm发酵培养)，将培养液加入到IOOmL培养至对数期的铜绿微囊藻PCC7806 的藻液(藻细胞密度约IX IO7个/mL)中。两天后取黄化藻液用梯度稀释法涂LB平板，37°C 培养Mh，取菌落密度适中的平板，按照菌落形态的不同挑选不同菌株。
将筛选出来的溶藻细菌按照的比例分别接种入IOmL LB培养基中，37°C， 200rpm培养Mh，将IOmL培养好的菌液分别加入90mL对数期铜绿微囊藻的藻液中(藻细胞密度约1 X IO7个/mL)。另外将IOmL灭菌后的LB培养基同样加入90mL藻液中作为对照。 所有实验组和对照组的藻液在光照培养箱中培养4 后计算其溶藻效率，选取了其中溶藻效率最高的一株细菌进行进一步研究，该菌株代号为A27。藻液培养条件铜绿微囊藻用BGll液体培养基培养，放置于光照培养箱中，25°C， 光照强度40μπιο1 photons πΓ2^，光暗周期比为12 12。溶藻效率计算方法溶藻效率(％ )=(对照组藻细胞密度-实验组藻细胞密度)/ 对照组藻细胞密度* 100。其中铜绿微囊藻的藻细胞密度可以用血球计数板测定。2. Α27菌株的鉴定用形态观察、染色、生理生化反应、16s rRNA基因序列分析等方法对溶藻效果最强的微小杆菌A27进行鉴定，该菌株为杆状，1. 1 1. 2 μ mX 1. 4 3. 2 μ m，革兰氏阳性，不生孢，不抗酸。以周生鞭毛运动。兼性厌氧。在LB平板上菌落平坦，淡橙色，色素不扩散。嗜碱，能在PH6. 5 11. 5生长。化能异养菌，发酵代谢。可以利用葡萄糖、蔗糖、半乳糖和一些其他糖产酸，主要产物是乳酸、乙酸和甲酸。该菌株接触酶阳性，氧化酶阴性。可以还原硝酸盐，水解明胶、淀粉和酪素。最适生长温度37°C。经16s rRNA基因序列分析和同源性比较，得知其与GenBank中某微小杆菌菌株有97%的同源性，故鉴定为微小杆菌属细菌，命名为微小杆菌A27。该菌种已经保藏于国家微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No. 4114，保藏日期为2010年10月1日。该菌种的16s rRNA基因在GenBank 中的登录号是FJ751911。3. A27菌体密度对溶藻效果的影响将微小杆菌A27按照1 %接种量分别接种于5份LB培养基中(各IOmL)，37°C， 200rpm摇床培养24h后将菌液12000g离心，弃上清，离心下来的菌体用适量无菌LB重悬后按照1 9的比例加入90mL铜绿微囊藻藻液(藻细胞密度约1 X IO7个/mL)中，使得五个实验组的初始A27细菌密度分别为1. 5 X IO4个/mL，1. 5 X IO5个/mL，1. 5 X IO6个/mL, 1. 5 X IO7个/mL, 1. 5 X IO8个/mL。使用IOmL无菌LB+90mL藻液作为对照组。每24h测对照组和五个实验组的藻细胞密度(血球计数板法)和藻液中的A27细菌密度(平板涂布法)，每个样品测三个平行样，表示成平均值士标准差的形式，如图1所示。实验结果表明当藻液中的细菌浓度超过一个特定阈值时，微小杆菌A27开始表现出明显的溶藻效果，从图1得出这个细菌密度阈值大约是4X IO8个/mL。4. A27菌株对不同生长阶段铜绿微囊藻的溶藻效果将3份按照步骤3所述方法在LB培养液中培养M小时的A27菌液(各IOmL)分别加入到处于延滞期(藻细胞密度约5. 25 X IO6个/mL)、对数期(藻细胞密度约1. 22 X IO7 个/mL)和平台期(藻细胞密度约2. 20 X IO7个/mL)的铜绿微囊藻藻液中(各90mL)，在光照培养箱中培养，每M小时用血球计数板法测定对照组和实验组的藻细胞密度，每个样品测三个平行样，表示成平均值士标准差的形式，如图2所示。实验结果表明微小杆菌A27对于处于延滞期和对数期的铜绿微囊藻具有较好的溶藻效果O天时溶藻率分别为61. 9%和62.6%)，对于平台期藻细胞溶藻效果较差0天时溶藻率为22.4% )。
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5. A27菌株对不同蓝藻和真核藻类的溶藻效果将13份按照步骤3所述方法培养好的10mLA27菌液分别加入13株蓝藻和真核藻 (表1)的藻液中(90mL，所有藻液均培养到对数期)，同样使用空白LB培养基分别加入13 种藻液中作为对照(1 9)，在光照培养箱中培养4 后分别测定所有实验组和对照组的藻液的叶绿素浓度，计算其溶藻效率。每个样品测三个平行样，表示成平均值士标准差的形式。本实验中用到的藻种有7株购自武汉水生所藻种库，另外6株筛选自太湖水体。实验结果表明，微小杆菌A27对于绝大部分原核藻种具有很好的溶藻效果，对两株真核藻种 (绿藻M7和衣藻BS;3)没表现出很好的溶藻效果(表1)。此结果表明微小杆菌A27的溶藻能力具有广谱性，是一种非常有潜力的溶藻细菌。表1.微小杆菌A27对13株藻株的溶藻效果
权利要求
1.一株具有溶藻活性的微小杆菌A27，其特征在于，其名称为=Exiguobacterium sp. A27，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC No. 4114, 保藏日期为2010年10月1日。
2.一种根据权利要求1所述微小杆菌A27的无菌发酵液的制备方法，其特征在于，通过将微小杆菌A27接种于pH7. 0的灭菌LB液体培养基中，在37°C、200rpm的环境下发酵M小时得到其含菌发酵液；进一步经12000g离心20min后将上清再用0. 22 μ m孔径的膜过滤， 得到无菌发酵液。
3.一种根据权利要求1或2所述微小杆菌A27的应用，其特征在于，用于抑制蓝藻水华。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征是，通过将所述微小杆菌A27制备得到的无菌发酵液用旋转蒸发器蒸干后经过甲醇溶取后用于溶藻。
全文摘要
一种微生物应用技术领域的具有溶藻活性的微小杆菌及其在蓝藻水华控制中的应用，通过从太湖水体中分离获得具有较强溶藻活性的微小杆菌A27(Exiguobacterium sp.A27)，保藏号CGMCC No.4114。用于新型杀藻剂的研发和生产，最终应用于湖泊蓝藻水华的控制。
文档编号C12N1/20GK102206605SQ20111011022
公开日2011年10月5日 申请日期2011年4月29日 优先权日2011年4月29日
发明者李道棠, 杨虹, 潘建良, 田川, 谭晶 申请人:上海交通大学