专利名称：冬凌草素的生物转化合成方法
技术领域：
本发明涉及一种有机化合物的合成方法，特别是涉及一种冬凌草素贝壳杉烯型二萜类化合物的生物转化合成方法。
背景技术：
冬凌草学名碎米桠，拉丁名为Tfe力 /osia rMseasi (Hamst)，又名冰凌草、延命草、 彩花草等，冬凌草为唇形科香茶属多年生草本或亚灌木，具有清热解毒、消炎止痛、健胃活血之效。主要分布于河南省太行、王屋山区，由于乱采滥挖，导致其自然资源近于枯竭。冬凌草植物中含有单萜、倍半萜、二萜、三萜类化合物，以及含有Fe、Ca、Zn、Se 等多种微量元素和丙氨酸、天冬氨酸等多种氨基酸等活性成分，冬凌草素包括冬凌草甲素(rubescenin A=oridonin)、冬凌草乙素(rubescensin B= ponicidin)、冬凌草丙素 (rubescensin C)和冬凌草丁素(pubescence D)等，均属于贝壳杉烯型二萜类化合物，其中的主要有效成分为冬凌草甲素。冬凌草甲素是一种具有抗癌、抗菌、抗病毒、消炎、杀虫、镇痛等作用的化合物，其中①抗癌方面对S-180、肝癌、食管癌及网组织细胞肉瘤等均有对抗作用；②抗菌方面对 19种细菌有中等程度的抑制作用，对革兰氏阳性菌效果较好；③杀虫效果对鳞翅目幼虫有抑制其生长的作用。冬凌草甲素毒性很低，可用于医疗和保健功能领域。但是，这类化合物在天然植物中含量很低，且化学结构复杂，利用化学方法进行全合成非常困难，且不经济。由此严重地限制了对其进一步的开发和利用。关于冬凌草素方面的相关专利文献报道1、申请号为200610017358.0、发明名称为“新对映贝壳杉烯类二萜化合物及其衍生物、其制备方法和用途”的发明专利，公开了的制备方法为将冬凌草地上部分用有机溶剂浸泡，于40-60°C下，浸泡3小时-3天，然后浓缩除去大部分溶剂，浓缩液经大孔吸附树脂和硅胶反复层析分离即得济源冬凌草素A。该对映贝壳杉烯二萜可作为不对称有机化合物和药物合成的理想中间体，还可作为抗肿瘤、 抗炎、免疫等药物使用。将其与羟基化合物缩合得到各种缩醛衍生物；将其与胺基化合物反应得到各种氨基衍生物；将其与酰卤、酸酐反应得到各种酰基化衍生物。2、申请号为 200610065836. 5、发明名称为“一种冬凌草素结构化制剂组合物”的发明专利，该发明专利公开的组合物中含有冬凌草素、冬凌草素共溶剂、油性载体、水和表面活性剂。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种冬凌草素贝壳杉烯型二萜类化合物的生物转化合成方法。采用本发明技术方案培养制备冬凌草素，不受自然资源的限制，并且有利于保护生态环境。本发明技术方案易于工业化生产，培养时间较短，产物收率较高，生产成本较低。为了解决上述问题，本发明采用的技术方案是
本发明提供一种冬凌草素的生物转化合成方法，所述合成方法包括以下步骤a、固体培养基的制备
以1升固体培养基为基准，固体培养基的组成成分中含有硫酸镁160 360 mg，磷酸二氢钾或磷酸二氢钠或磷酸二氢钾和磷酸二氢钠之和70 370mg，硝酸钾860 4250mg， 硝酸铵725 4650mg，氯化钙180 980mg，硫胺0. 05 1. 25mg,肌醇25 250mg，硼酸 1. 6 25. 8mg，硫酸猛 3. 9 62. 5mg，硫酸锌 2. 1 32. 3mg，钼酸钠 0. 0125 0. 0725mg，硫酸铜0. 0125 0. 0725mg，氯化钴0. 0125 0. 0725mg，碘化钾0. 0215 2. 65mg，硫酸亚铁 6. 5 65. 5mg, EDTA 钠盐 9. 8 76. 6mg 或 EDTA 铁盐 21. 5 86mg, 2，4-D、N6-呋喃甲基腺嘌呤、6-苄基腺嘌呤和6-糠氨基嘌呤中的任一种或任两种0. 05 25mg，萘乙酸、萘甲酸、 吲哚-3-乙酸和4-氨基-3，5，6-三氯吡啶甲酸中的任一种或任两种或任三种0. 1 55mg， 蔗糖 12000 ;35000mg，琼脂 4500 33000mg ；
按照上述1升固体培养基组成中各成分的含量逐一称取，将除蔗糖、琼脂以外的其它培养基成分，用蒸馏水充分溶解得到溶液，然后将称取的蔗糖和琼脂，加入配制的溶液中进行溶化，调节溶液的PH值为4. 5 7. 0，然后将调节后所得溶液进行分装，经灭菌后得到固体培养基；
b、取冬凌草的叶片、叶芽或根茎外皮消毒后接种于步骤a制备的固体培养基中，于 15 30°C条件下培养12 56天，培养后得到愈伤组织；
c、将步骤b得到的愈伤组织置于索氏提取器或圆底烧瓶中，用有机溶剂回流提取2 6小时或浸泡提取6 48小时，提取后除去有机溶剂，最后得到产品冬凌草素即贝壳杉烯型二萜类化合物。根据上述的冬凌草素的生物转化合成方法，步骤a中所述固体培养基的组成成分中还含有吡哆醇0. 125 0. 25mg和烟酸0. 025 2. 5mg。根据上述的冬凌草素的生物转化合成方法，步骤a中所述EDTA钠盐为EDTA 二钠 Na2-EDTA · 2H20 ；所述EDTA铁盐为乙二胺四乙酸铁铵。根据上述的冬凌草素的生物转化合成方法，步骤a中所述灭菌是在98 kPa、 120°C 125°C条件下，灭菌20 40 min。根据上述的冬凌草素的生物转化合成方法，步骤c中所述有机溶剂为醇类有机物、醚类有机物或酯类有机物；
所述醇类有机物为甲醇、质量浓度为95%的乙醇或无水乙醇，醇类有机物的用量为所得愈伤组织重量的10 20倍；
所述醚类有机物为乙醚、苯甲醚、二氧六环、四氢呋喃或环氧丙烷；醚类有机物的用量为所得愈伤组织重量的5 30倍；
所述酯类有机物为乙酸甲酯、乙酸乙酯或乙酸丙酯；酯类有机物的用量为所得愈伤组织重量的5 30倍。一种冬凌草素的生物转化合成方法，所述合成方法包括以下步骤 a、固体培养基的制备
以1升固体培养基为基准，固体培养基的组成成分中含有硫酸镁160 360 mg，磷酸二氢钾或磷酸二氢钠或磷酸二氢钾和磷酸二氢钠之和70 370mg，硝酸钾860 4250mg， 硝酸铵725 4650mg，氯化钙180 980mg，硫胺0. 05 1. 25mg,肌醇25 250mg，硼酸 1. 6 25. 8mg，硫酸猛 3. 9 62. 5mg，硫酸锌 2. 1 32. 3mg，钼酸钠 0. 0125 0. 0725mg，硫酸铜0. 0125 0. 0725mg，氯化钴0. 0125 0. 0725mg，碘化钾0. 0215 2. 65mg，硫酸亚铁 6. 5 65. 5mg, EDTA 钠盐 9. 8 76. 6mg 或 EDTA 铁盐 21. 5 86mg, 2，4-D、N6-呋喃甲基腺嘌呤、6-苄基腺嘌呤和6-糠氨基嘌呤中的任一种或任两种0. 05 25mg，萘乙酸、萘甲酸、 吲哚-3-乙酸和4-氨基-3，5，6-三氯吡啶甲酸中的任一种或任两种或任三种0. 1 55mg， 蔗糖 12000 ;35000mg，琼脂 4500 33000mg ；
按照上述1升固体培养基组成中各成分的含量逐一称取，将除蔗糖、琼脂以外的其它培养基成分，用蒸馏水充分溶解得到溶液，然后将称取的蔗糖和琼脂，加入配制的溶液中进行溶化，调节溶液的PH值为4. 5 7. 0，然后将调节后所得溶液进行分装，经灭菌后得到固体培养基；
b、液体培养基的制备
以1升液体培养基为基准，液体培养基的组成成分中含有硫酸镁160 689 mg，磷酸二氢钾或磷酸二氢钠或磷酸二氢钾和磷酸二氢钠之和70 350mg，硝酸钾860 4200mg， 硝酸铵725 4600mg，氯化钙180 980mg，硫胺0. 05 1. 25mg,肌醇25 250mg，硼酸
1.6 25. 8mg,硫酸猛 3. 9 62. 5mg,硫酸锌 2. 1 32. 2mg,钼酸钠 0. 0125 0. 0725mg, 硫酸铜 0. 0125 0. 0725mg，氯化钴 0. 0125 0. 0725 mg，碘化钾 0. 0215 2. 65 mg，硫酸亚铁 6. 5 65. 5mg, EDTA 钠盐 9. 8 76. 4mg 或 EDTA 铁盐 21. 5 86mg, 2，4-D,N6-呋喃甲基腺嘌呤、6-苄基腺嘌呤和6-糠氨基腺嘌呤中的任一种或任两种0. 05 25mg，萘乙酸、萘甲酸、吲哚-3-乙酸和4-氨基-3，5，6-三氯吡啶甲酸中的任一种或任两种或任三种0. 1 50mg，蔗糖 12000 60000mg ；
按照上述1升液体培养基组成中各成分的含量逐一称取，将除蔗糖以外的其它培养基成分，用蒸馏水充分溶解得到溶液，然后将称取的蔗糖加入配制的溶液中进行溶化，调节溶液的PH值为4. 5 7. 0，将调节后所得溶液进行分装，经灭菌后得到液体培养基；
c、取冬凌草的叶片、叶芽或根茎外皮消毒后接种于步骤a制备的固体培养基中，于 15 32°C条件下培养12 36天，培养后得到愈伤组织；
d、将步骤c得到的愈伤组织取出，转入步骤b制备的液体培养基中，置于震荡培养箱或摇床或生物反应器内，在15 32°C条件下继续培养18 32天，培养后将愈伤组织和培养液过滤分离；
e、将步骤d经分离后得到的愈伤组织置于索氏提取器或圆底烧瓶中，用有机溶剂回流提取2 6小时或浸泡提取6 48小时，提取后除去有机溶剂，最后得到产品冬凌草素即贝壳杉烯型二萜类化合物。根据上述的冬凌草素的生物转化合成方法，步骤a中所述固体培养基的成分中还含有吡哆醇0. 125 0. 25mg和烟酸0. 025 2. 5 mg ；
步骤b中所述液体培养基的成分中还含有吡哆醇0. 125 0. 25mg和烟酸0. 025
2.5mg。根据上述的冬凌草素的生物转化合成方法，步骤a中所述EDTA钠盐为EDTA 二钠 Na2-EDTA · 2H20 ；所述EDTA铁盐为乙二胺四乙酸铁铵；
步骤b中所述EDTA钠盐为EDTA 二钠Na2-EDTA · 2H20 ；所述EDTA铁盐为乙二胺四乙酸铁铵。根据上述的冬凌草素的生物转化合成方法，步骤a中所述灭菌是在98 kPa、120°C 125°C条件下，灭菌20 40 min ；
步骤b中所述灭菌是在98 kPa、120°C 125°C条件下，灭菌20 40 min。根据上述的冬凌草素的生物转化合成方法，步骤c中所述有机溶剂为醇类有机物、醚类有机物或酯类有机物；
所述醇类有机物为甲醇、质量浓度为95%的乙醇或无水乙醇，醇类有机物的用量为所得愈伤组织重量的10 20倍；
所述醚类有机物为乙醚、苯甲醚、二氧六环、四氢呋喃或环氧丙烷；醚类有机物的用量为所得愈伤组织重量的5 30倍；
所述酯类有机物为乙酸甲酯、乙酸乙酯或乙酸丙酯；酯类有机物的用量为所得愈伤组织重量的5 30倍。本发明的积极有益效果
1、本发明采用生物学和细胞工程学中的组织(细胞)培养方法进行合成冬凌草素，这样使其冬凌草素的制备不受自然资源的限制，并且有利于保护生态环境。2、本发明技术方案中培养基为组织(细胞)培养中广泛采用的植物细胞培养基，成分易得，培养基中含有氮、磷、钾等大量元素，硼、锌、锰、钼、铜、钴、钠、碘、铁等微量元素，硫胺、吡多醇、烟酸、肌醇等维生素和2，4-D、N6-呋喃甲基腺嘌呤、6-苄基腺嘌呤、6-糠氨基腺嘌呤、萘乙酸、萘甲酸、吲哚-3-乙酸、4-氨基-3，5，6-三氯吡啶甲酸等植物生长调节物质，能够提供组织(细胞)培养所需的各种营养成分，培养条件温和，提取方法简便易行。因此，本发明技术方案易于工业化生产。3、本发明技术方案中，第一种方法仅采用固体培养基进行培养；第二种方法先采用固体培养基培养，然后转入液体培养基进行培养，这样更易于工业化大规模生产，且缩短培养时间，产物收率大大提高，生产成本得以大大降低。四
图1为利用本发明技术方案所得产物的结构示意图五具体实施例方式
以下实施例仅为了进一步说明本发明，并不限制本发明的内容。实施例1 一种冬凌草素的生物转化合成方法
技术领域：
本发明一种冬凌草素的生物转化合成方法，所述合成方法的详细步骤如下
a、固体培养基的制备
固体培养基的组成成分为硫酸镁360mg，磷酸二氢钾170mg，硝酸钾1900mg，硝酸铵 1650mg,氯化钙440mg,硫胺1. Omg,肌醇IOOmg,硼酸6. 2mg,硫酸锰15. 6mg,硫酸锌8. 6mg， 钼酸钠0. 025mg，硫酸铜0. 025mg，氯化钴0. 025mg，碘化钾0. 085mg，硫酸亚铁27. 8mg,EDTA 钠盐(EDTA 二钠)37. 3mg, 2，4-D 1. Omg,6-糠氨基嘌呤 2. Omg，萘乙酸 3. Omg,蔗糖 30000mg 和琼脂12000mg ；
按照上述固体培养基的各组成成分的含量逐一称取，将除蔗糖、琼脂以外的其它培养基成分用蒸馏水充分溶解得到溶液，然后将称取的蔗糖和琼脂加入配制的溶液中进行溶化，并加入水稀释到lOOOmL，调节溶液的pH值为5. 8，然后将调节后所得溶液进行分装，分装后分别在98 kPa、121°C条件下灭菌25min，灭菌后得到固体培养基；
b、取冬凌草的叶片或叶芽或嫩茎消毒后接种于步骤a制备的固体培养基中，于25°C条件下培养42天，培养后得到愈伤组织；
C、将步骤b得到的愈伤组织取出置于索氏提取器中，采用无水乙醇回流提取4小时，无水乙醇的用量为所得愈伤组织重量的15倍，然后蒸发出乙醇，得到产品冬凌草素即贝壳杉烯型二萜类化合物。实施例2 与实施例1基本相同，不同之处在于
步骤a中固体培养基的组成成分为硫酸镁270mg，磷酸二氢钠370mg，硝酸钾860mg， 硝酸铵4650mg,氯化钙180mg,硫胺1. 25mg,肌醇25mg,硼酸25. 8mg,硫酸锰62. 5mg,硫酸锌2. Img,钼酸钠0. 0125mg,硫酸铜0. 0125mg,氯化钴0. 0725mg,碘化钾2. 65mg,硫酸亚铁 65. 5mg，EDTA钠盐(EDTA 二钠)9. 8mg，N6-呋喃甲基腺嘌呤10mg，萘甲酸2. Omg、吲哚-3-乙酸 15mg，蔗糖;35000mg 和琼脂 33000mg ；
按照上述固体培养基的各组成成分的含量逐一称取，将除蔗糖、琼脂以外的其它培养基成分用蒸馏水充分溶解得到溶液，然后将称取的蔗糖和琼脂加入配制的溶液中进行溶化，并加入水稀释到lOOOmL，调节溶液的pH值为6. 5，然后将调节后所得溶液进行分装，分装后分别在98 kPa、125°C条件下灭菌20min，灭菌后得到固体培养基；
步骤b中取冬凌草叶片消毒后置于步骤a制备的固体培养基中，于条件下培养 42天;
步骤c中采用甲醇回流提取6小时，甲醇的用量为所得愈伤组织重量的10倍。实施例3 与实施例1基本相同，不同之处在于
步骤a中固体培养基的组成成分为硫酸镁160mg，磷酸二氢钾70mg，硝酸钾4250mg， 硝酸铵725mg，氯化钙980mg，硫胺0. 05mg,肌醇250mg，硼酸1. 6mg,硫酸锰3. 9mg,硫酸锌 32. 3mg，钼酸钠0. 0725mg，硫酸铜0. 0725mg，氯化钴0. 0125mg，碘化钾0. 0215mg，硫酸亚铁 6. 5mg, EDTA钠盐(EDTA 二钠)76. 6mg, 6-苄基腺嘌呤25mg, 4-氨基-3，5，6-三氯吡啶甲酸 55mg，蔗糖 12000mg 和琼脂 4500mg ；
按照上述固体培养基的各组成成分的含量逐一称取，将除蔗糖、琼脂以外的其它培养基成分用蒸馏水充分溶解得到溶液，然后将称取的蔗糖和琼脂加入配制的溶液中进行溶化，并加入水稀释到lOOOmL，调节溶液的pH值为4. 5，然后将调节后所得溶液进行分装，分装后分别在98 kPa、120°C条件下灭菌40min，灭菌后得到固体培养基；
步骤b中取冬凌草叶片消毒后置于步骤a制备的固体培养基中，于15°C条件下培养 56天;
步骤c中采用乙醚回流提取5小时，乙醚的用量为所得愈伤组织重量的15倍。实施例4 与实施例1基本相同，不同之处在于
步骤a中固体培养基的组成成分为硫酸镁220mg，磷酸二氢钾170mg、磷酸二氢钠 130mg，硝酸钾3500mg，硝酸铵3850mg，氯化钙680mg，硫胺0. 15mg，肌醇160mg，硼酸16mg， 硫酸锰39mg，硫酸锌2;3mg，钼酸钠0. 0525mg,硫酸铜0. 045mg,氯化钴0. 045mg,碘化钾 0. 045mg，硫酸亚铁45mg，EDTA铁盐(乙二胺四乙酸铁铵)53. 5mg，6_苄基腺嘌呤5mg，萘乙酸3. 0_g、萘甲酸5. Omg,吡哆醇0. 15mg，烟酸1. 5mg，蔗糖12000mg和琼脂4500mg ；
按照上述固体培养基的各组成成分的含量逐一称取，将除蔗糖、琼脂以外的其它培养基成分用蒸馏水充分溶解得到溶液，然后将称取的蔗糖和琼脂加入配制的溶液中进行溶化，并加入水稀释到lOOOmL，调节溶液的pH值为5. 6，然后将调节后所得溶液进行分装，分装后分别在98 kPa、122°C条件下灭菌30min，灭菌后得到固体培养基；
步骤b中取冬凌草叶片消毒后置于步骤a制备的固体培养基中，于30°C条件下培养 26天;
步骤c中采用乙酸甲酯回流提取5小时，乙酸甲酯的用量为所得愈伤组织重量的12倍。实施例5 —种冬凌草素的生物转化合成方法
技术领域：
本发明一种冬凌草素的生物转化合成方法，所述合成方法的详细步骤如下
a、固体培养基的制备与实施例1中固体培养基的制备相同；
b、液体培养基的制备
液体培养基的组成成分为硫酸镁360mg，磷酸二氢钾170mg，硝酸钾1900mg，硝酸铵 1650mg,氯化钙440mg,硫胺1. Omg,肌醇IOOmg,硼酸6. 2mg,硫酸锰15. 6mg,硫酸锌8. 6mg， 钼酸钠0. 025mg,硫酸铜0. 025mg,氯化钴0. 025mg,碘化钾0. 085mg,硫酸亚铁27. 8mg, EDTA钠盐(EDTA 二钠)37. 3mg, 2，4-D 1. Omg,6-糠氨基嘌呤2. Omg，萘乙酸3. Omg和蔗糖 30000mg ；
按照上述液体培养基的各组成成分的含量逐一称取，将除蔗糖以外的其它培养基成分，用蒸馏水充分溶解得到溶液，然后将称取的蔗糖加入配制的溶液中进行溶化，并加入水稀释到lOOOmL，调节溶液的pH值为5. 6，然后将调节后所得溶液进行分装，分装后分别在98 kPa、121°C条件下灭菌20min，灭菌后得到液体培养基；
c、取冬凌草的叶片消毒后接种于步骤a制备的固体培养基中，于条件下培养42 天，培养后得到愈伤组织；
d、将步骤c得到的愈伤组织取出，转入步骤b制备的液体培养基中，置于震荡培养箱内，在25°C条件下继续培养18天，培养后将愈伤组织和培养液过滤分离；
e、将步骤d经分离后得到的愈伤组织置于索氏提取器中，用无水乙醇回流提取4小时， 无水乙醇的用量为所得愈伤组织重量的10倍，提取后除去无水乙醇，最后得到产品冬凌草素即贝壳杉烯型二萜类化合物。实施例6 与实施例5基本相同，不同之处在于
步骤a 固体培养基的制备同实施例2中固体培养基的制备相同； 步骤b:液体培养基的制备
液体培养基的组成成分为硫酸镁270mg，磷酸二氢钠370mg，硝酸钾860mg，硝酸铵 4650mg,氯化钙180mg,硫胺1. 25mg,肌醇25mg,硼酸25. 8mg,硫酸锰62. 5mg,硫酸锌2. Img, 钼酸钠0. 0125mg,硫酸铜0. 0125mg,氯化钴0. 0725mg,碘化钾2. 65mg,硫酸亚铁65. 5mg， EDTA钠盐(EDTA 二钠)9. 8mg, N6-呋喃甲基腺嘌呤10mg，萘甲酸2. Omg、吲哚-3-乙酸15mg 和蔗糖:35000mg ；
按照上述液体培养基的各组成成分的含量逐一称取，将除蔗糖以外的其它培养基成分用蒸馏水充分溶解得到溶液，然后将称取的蔗糖和琼脂加入配制的溶液中进行溶化，并加入水稀释到lOOOmL，调节溶液的pH值为6. 5，然后将调节后所得溶液进行分装，分装后分别在98 kPa、125°C条件下灭菌20min，灭菌后得到液体培养基；
步骤c 取冬凌草的嫩芽消毒后接种于步骤a制备的固体培养基中，于32°C条件下培养 28天；步骤d 将步骤c得到的愈伤组织取出，转入步骤b制备的液体培养基中，置于震荡培养箱内，在32 °C条件下继续培养18天；
步骤e 将步骤d经分离后得到的愈伤组织置于索氏提取器中，用甲醇回流提取6小时，甲醇的用量为所得愈伤组织重量的15倍，提取后除去甲醇，最后得到产品冬凌草素即贝壳杉烯型二萜类化合物。实施例7 与实施例5基本相同，不同之处在于
步骤a 固体培养基的制备同实施例3中固体培养基的制备相同； 步骤b:液体培养基的制备
液体培养基的组成成分为硫酸镁160mg，磷酸二氢钾70mg，硝酸钾4250mg，硝酸铵 725mg，氯化钙980mg,硫胺0. 05mg,肌醇250mg,硼酸1. 6mg,硫酸锰3. 9mg,硫酸锌32. 3mg, 钼酸钠0. 0725mg,硫酸铜0. 0725mg,氯化钴0. 0125mg,碘化钾0. 0215mg,硫酸亚铁6. 5mg， EDTA钠盐(EDTA 二钠)76. 6mg，6_苄基腺嘌呤25mg，4_氨基-3，5，6-三氯吡啶甲酸55mg和蔗糖 12000mg ；
按照上述液体培养基的各组成成分的含量逐一称取，将除蔗糖以外的其它培养基成分用蒸馏水充分溶解得到溶液，然后将称取的蔗糖和琼脂加入配制的溶液中进行溶化，并加入水稀释到lOOOmL，调节溶液的pH值为4. 5，然后将调节后所得溶液进行分装，分装后分别在98 kPa、120°C条件下灭菌40min，灭菌后得到液体培养基；
步骤c 取冬凌草的根茎外皮消毒后接种于步骤a制备的固体培养基中，于15件下培养36 ；
步骤d 将步骤c得到的愈伤组织取出，转入步骤b制备的液体培养基中，置于震荡培养箱内，在15°C条件下继续培养观天；
步骤e 将步骤d经分离后得到的愈伤组织置于索氏提取器中，用乙醚回流提取3小时，乙醚的用量为所得愈伤组织重量的15倍，提取后除去乙醚，最后得到产品冬凌草素即贝壳杉烯型二萜类化合物。实施例8 与实施例5基本相同，不同之处在于
步骤a 固体培养基的制备同实施例4中固体培养基的制备相同； 步骤b:液体培养基的制备
液体培养基的组成成分为硫酸镁220mg，磷酸二氢钾170mg、磷酸二氢钠130mg，硝酸钾3500mg，硝酸铵3850mg，氯化钙680mg，硫胺0. 15mg,肌醇160mg，硼酸16mg，硫酸锰39mg， 硫酸锌2;3mg，钼酸钠0. 0525mg,硫酸铜0. 045mg,氯化钴0. 045mg,碘化钾0. 045mg,硫酸亚铁45mg，EDTA铁盐(乙二胺四乙酸铁铵)53. 5mg，6_苄基腺嘌呤5mg，萘乙酸3. Ommg、萘甲酸 5. Omg,吡哆醇 0. 15mg，烟酸 1. 5mg 和蔗糖 12000mg ；
按照上述液体培养基的各组成成分的含量逐一称取，将除蔗糖以外的其它培养基成分用蒸馏水充分溶解得到溶液，然后将称取的蔗糖和琼脂加入配制的溶液中进行溶化，并加入水稀释到lOOOmL，调节溶液的pH值为5. 6，然后将调节后所得溶液进行分装，分装后分别在98 kPa、122°C条件下灭菌30min，灭菌后得到液体培养基；
步骤c:取冬凌草的嫩芽消毒后接种于步骤a制备的固体培养基上，于25°C条件下培养 20天;
步骤d 将步骤c得到的愈伤组织取出，转入步骤b制备的液体培养基中，置于震荡培养箱内，在20°C条件下继续培养22天；
步骤e 将步骤d经分离后得到的愈伤组织置于索氏提取器中，用乙酸甲酯回流提取2 小时，甲醇的用量为所得愈伤组织重量的15倍，提取后除去乙酸甲酯，最后得到产品冬凌草素即贝壳杉烯型二萜类化合物。实施例9 与实施例5基本相同，不同之处在于 步骤d 置于摇床内，在25°C条件下继续培养18天；
步骤e 将步骤d经分离后得到的愈伤组织置于圆底烧瓶中，用无水乙醇浸泡提取12 小时，无水乙醇的用量为所得愈伤组织重量的20倍。实施例10 与实施例5基本相同，不同之处在于 步骤d 置于生物反应器内，在22°C条件下继续培养18天；
步骤e 将步骤d经分离后得到的愈伤组织置于圆底烧瓶中，用苯甲醚浸泡提取36小时，苯甲醚的用量为所得愈伤组织重量的20倍。
权利要求
1.一种冬凌草素的生物转化合成方法，其特征在于，所述合成方法包括以下步骤a、固体培养基的制备以1升固体培养基为基准，固体培养基的组成成分中含有硫酸镁160 360 mg，磷酸二氢钾或磷酸二氢钠或磷酸二氢钾和磷酸二氢钠之和70 370mg，硝酸钾860 4250mg， 硝酸铵725 4650mg，氯化钙180 980mg，硫胺0. 05 1. 25mg,肌醇25 250mg，硼酸 1. 6 25. 8mg，硫酸猛 3. 9 62. 5mg，硫酸锌 2. 1 32. 3mg，钼酸钠 0. 0125 0. 0725mg，硫酸铜0. 0125 0. 0725mg，氯化钴0. 0125 0. 0725mg，碘化钾0. 0215 2. 65mg，硫酸亚铁 6. 5 65. 5mg, EDTA 钠盐 9. 8 76. 6mg 或 EDTA 铁盐 21. 5 86mg, 2，4-D、N6-呋喃甲基腺嘌呤、6-苄基腺嘌呤和6-糠氨基嘌呤中的任一种或任两种0. 05 25mg，萘乙酸、萘甲酸、 吲哚-3-乙酸和4-氨基-3，5，6-三氯吡啶甲酸中的任一种或任两种或任三种0. 1 55mg， 蔗糖 12000 ;35000mg，琼脂 4500 33000mg ；按照上述1升固体培养基组成中各成分的含量逐一称取，将除蔗糖、琼脂以外的其它培养基成分，用蒸馏水充分溶解得到溶液，然后将称取的蔗糖和琼脂，加入配制的溶液中进行溶化，调节溶液的PH值为4. 5 7. 0，然后将调节后所得溶液进行分装，经灭菌后得到固体培养基；b、取冬凌草的叶片、叶芽或根茎外皮消毒后接种于步骤a制备的固体培养基中，于 15 30°C条件下培养12 56天，培养后得到愈伤组织；c、将步骤b得到的愈伤组织置于索氏提取器或圆底烧瓶中，用有机溶剂回流提取2 6小时或浸泡提取6 48小时，提取后除去有机溶剂，最后得到产品冬凌草素即贝壳杉烯型二萜类化合物。
2.根据权利要求1所述的冬凌草素的生物转化合成方法，其特征在于步骤a中所述固体培养基的组成成分中还含有吡哆醇0. 125 0. 25mg和烟酸0. 025 2. 5mg。
3.根据权利要求1所述的冬凌草素的生物转化合成方法，其特征在于步骤a中所述 EDTA钠盐为EDTA 二钠Na2-EDTA · 2H20 ；所述EDTA铁盐为乙二胺四乙酸铁铵。
4.根据权利要求1所述的冬凌草素的生物转化合成方法，其特征在于步骤a中所述灭菌是在98 kPa、120°C 125°C条件下，灭菌20 40 min。
5.根据权利要求1所述的冬凌草素的生物转化合成方法，其特征在于步骤c中所述有机溶剂为醇类有机物、醚类有机物或酯类有机物；所述醇类有机物为甲醇、质量浓度为95%的乙醇或无水乙醇，醇类有机物的用量为所得愈伤组织重量的10 20倍；所述醚类有机物为乙醚、苯甲醚、二氧六环、四氢呋喃或环氧丙烷；醚类有机物的用量为所得愈伤组织重量的5 30倍；所述酯类有机物为乙酸甲酯、乙酸乙酯或乙酸丙酯；酯类有机物的用量为所得愈伤组织重量的5 30倍。
6.一种冬凌草素的生物转化合成方法，其特征在于，所述合成方法包括以下步骤a、固体培养基的制备以1升固体培养基为基准，固体培养基的组成成分中含有硫酸镁160 360 mg，磷酸二氢钾或磷酸二氢钠或磷酸二氢钾和磷酸二氢钠之和70 370mg，硝酸钾860 4250mg， 硝酸铵725 4650mg，氯化钙180 980mg，硫胺0. 05 1. 25mg,肌醇25 250mg，硼酸.1. 6 25. 8mg，硫酸猛 3. 9 62. 5mg，硫酸锌 2. 1 32. 3mg，钼酸钠 0. 0125 0. 0725mg，硫酸铜0. 0125 0. 0725mg，氯化钴0. 0125 0. 0725mg，碘化钾0. 0215 2. 65mg，硫酸亚铁 6. 5 65. 5mg, EDTA 钠盐 9. 8 76. 6mg 或 EDTA 铁盐 21. 5 86mg, 2，4-D、N6-呋喃甲基腺嘌呤、6-苄基腺嘌呤和6-糠氨基嘌呤中的任一种或任两种0. 05 25mg，萘乙酸、萘甲酸、 吲哚-3-乙酸和4-氨基-3，5，6-三氯吡啶甲酸中的任一种或任两种或任三种0. 1 55mg， 蔗糖 12000 ;35000mg，琼脂 4500 33000mg ；按照上述1升固体培养基组成中各成分的含量逐一称取，将除蔗糖、琼脂以外的其它培养基成分，用蒸馏水充分溶解得到溶液，然后将称取的蔗糖和琼脂，加入配制的溶液中进行溶化，调节溶液的PH值为4. 5 7. 0，然后将调节后所得溶液进行分装，经灭菌后得到固体培养基；b、液体培养基的制备以1升液体培养基为基准，液体培养基的组成成分中含有硫酸镁160 689 mg，磷酸二氢钾或磷酸二氢钠或磷酸二氢钾和磷酸二氢钠之和70 350mg，硝酸钾860 4200mg， 硝酸铵725 4600mg，氯化钙180 980mg，硫胺0. 05 1. 25mg,肌醇25 250mg，硼酸.1.6 25. 8mg,硫酸猛 3. 9 62. 5mg,硫酸锌 2. 1 32. 2mg,钼酸钠 0. 0125 0. 0725mg, 硫酸铜 0. 0125 0. 0725mg，氯化钴 .0. 0125 0. 0725 mg，碘化钾 0. 0215 2. 65 mg，硫酸亚铁 6. 5 65. 5mg, EDTA 钠盐 9. 8 76. 4mg 或 EDTA 铁盐 21. 5 86mg, 2，4-D,N6-呋喃甲基腺嘌呤、6-苄基腺嘌呤和6-糠氨基腺嘌呤中的任一种或任两种0. 05 25mg，萘乙酸、萘甲酸、吲哚-3-乙酸和4-氨基-3，5，6-三氯吡啶甲酸中的任一种或任两种或任三种0. 1 50mg，蔗糖 12000 60000mg ；按照上述1升液体培养基组成中各成分的含量逐一称取，将除蔗糖以外的其它培养基成分，用蒸馏水充分溶解得到溶液，然后将称取的蔗糖加入配制的溶液中进行溶化，调节溶液的PH值为4. 5 7. 0，将调节后所得溶液进行分装，经灭菌后得到液体培养基；c、取冬凌草的叶片、叶芽或根茎外皮消毒后接种于步骤a制备的固体培养基中，于 15 32°C条件下培养12 36天，培养后得到愈伤组织；d、将步骤c得到的愈伤组织取出，转入步骤b制备的液体培养基中，置于震荡培养箱或摇床或生物反应器内，在15 32°C条件下继续培养18 32天，培养后将愈伤组织和培养液过滤分离；e、将步骤d经分离后得到的愈伤组织置于索氏提取器或圆底烧瓶中，用有机溶剂回流提取2 6小时或浸泡提取6 48小时，提取后除去有机溶剂，最后得到产品冬凌草素即贝壳杉烯型二萜类化合物。
7.根据权利要求6所述的冬凌草素的生物转化合成方法，其特征在于步骤a中所述固体培养基的成分中还含有吡哆醇0. 125 0. 25mg和烟酸0. 025 2. 5mg ；步骤b中所述液体培养基的成分中还含有吡哆醇0. 125 0. 25mg和烟酸0. 025 .2.5mg。
8.根据权利要求6所述的冬凌草素的生物转化合成方法，其特征在于步骤a中所述EDTA钠盐为EDTA 二钠Na2-EDTA · 2H20 ；所述EDTA铁盐为乙二胺四乙酸铁铵；步骤b中所述EDTA钠盐为EDTA 二钠Na2-EDTA · 2H20 ；所述EDTA铁盐为乙二胺四乙酸铁铵。
9.根据权利要求6所述的冬凌草素的生物转化合成方法，其特征在于 步骤a中所述灭菌是在98 kPa、120°C 125°C条件下，灭菌20 40 min ； 步骤b中所述灭菌是在98 kPa、120°C 125°C条件下，灭菌20 40 min。
10.根据权利要求6所述的冬凌草素的生物转化合成方法，其特征在于步骤c中所述有机溶剂为醇类有机物、醚类有机物或酯类有机物；所述醇类有机物为甲醇、质量浓度为95%的乙醇或无水乙醇，醇类有机物的用量为所得愈伤组织重量的10 20倍；所述醚类有机物为乙醚、苯甲醚、二氧六环、四氢呋喃或环氧丙烷；醚类有机物的用量为所得愈伤组织重量的5 30倍；所述酯类有机物为乙酸甲酯、乙酸乙酯或乙酸丙酯；酯类有机物的用量为所得愈伤组织重量的5 30倍。
全文摘要
本发明公开了一种冬凌草素的生物转化合成方法，该合成方法首先制备固体培养基、液体培养基，然后将冬凌草的叶片、叶芽或根茎外皮消毒后接种于制备的固体培养基中进行培养，培养后将得到的愈伤组织转入液体培养基中继续培养，经过液体培养基培养后的愈伤组织采用有机溶剂进行提取，提取后除去有机溶剂，得到本发明产品冬凌草素即贝壳杉烯型二萜类化合物。采用本发明技术方案培养制备冬凌草素，不受自然资源的限制，并且有利于保护生态环境。本发明技术方案易于工业化生产，培养时间较短，产物收率较高，生产成本降低，具有显著的经济效益和社会效益。
文档编号C12P17/18GK102242163SQ201110109399
公开日2011年11月16日 申请日期2011年4月29日 优先权日2011年4月29日
发明者刘冰, 吴鸣建, 沈国鹏, 赵天增, 马川 申请人:郑州大学