甲基营养型芽孢杆菌及其应用的制作方法

(一)技术领域

本发明涉及一种分离自草莓大棚土壤的甲基营养型芽孢杆菌(bacillusmethylotrophicus)lm-n，及其在防治草莓灰霉病中的应用。

(二)

背景技术：

由葡萄孢属真菌(botrytisspp.)引起的灰霉病是一类重要的植物病害，在草莓、葡萄、番茄、莴苣、黄瓜等果蔬上都较常有侵害的发生。不同时期发病可能引起植物在幼苗期的猝倒病或花朵和果实的腐烂病，已发展成为影响保护地蔬菜、水果和花卉生产或储藏过程中防腐保鲜的重要病害之一。灰霉病可使保护地蔬菜减产达到20％以上，病源控制或栽培措施不当的严重地区甚至面临绝产。在我国草莓已被列入发展农业生产的十大支柱产业之一，可见其经济和营养价值之高。草莓的栽培都采用大棚技术，使生育期缩短，产量提高，然而大棚内的小气候环境一般湿度较高，且冬、春季节平均温度也高于室外，这些环境条件对于灰霉病害的发生都十分有利，已经成为限制草莓品质和产量提高的重要因素，草莓灰霉病的防治措施直接决定了草莓的产量和经济效益。

目前，对草莓灰霉病的防治主要通过抗病育种、农业栽培防治、化学农药防治和生物防治这几条途径同时进行。由于灰霉病是一种兼性寄生菌，也存在腐生阶段，而目前尚未发现其的抗原，使得抗病育种难以实施；农业栽培防治则主要通过加强对田间的水肥管理，调节温度、湿度和光照等，这样一来就要求田间条件的控制设施齐全，在我国草莓种植户的现有条件下还未能实现；目前化学农药防治仍然是我国防治草莓灰霉病的主要手段，但是由于连续使用化学药剂，特别是连续使用单一的药剂，导致灰霉病病菌逐渐产生了抗药性，化学农药的防治效果也逐年下降,而且施药时农药喷洒无法避免直接喷洒到果实表面上，果实上残留的药剂也造成了果实的农药污染。近年来人们着眼于开发利用有益微生物及其代谢产物等来防治灰霉病，因为其对环境安全且效果显著，受环境条件影响较小，用这种生物防治的手段来控制草莓灰霉病己经逐渐发展成为一条重要且有潜力的防治途径，应用前景广泛，是未来防治草莓灰霉病必然趋势之一。

(三)

技术实现要素：

本发明目的是提供一株对多种植物病原菌具有良好拮抗作用的菌株-甲基营养型芽孢杆菌(bacillusmethylotrophicus)lm-n。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种分离自草莓灰霉病患病植株根围土壤的甲基营养型芽孢杆菌(bacillusmethylotrophicus)lm-n，该菌株的形态特征如下：形状为杆状，革兰氏阳性，芽孢椭圆，在牛肉膏蛋白胨培养基上30℃培养48h，菌落呈圆形，乳白色、不透明、中央隆起有褶皱，边缘呈锯齿状。保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，100101，保藏编号：cgmccno.13541，保藏日期：2017年01月06日。

本发明还提供一种所述甲基营养型芽孢杆菌lm-n在制备植物病原菌杀菌剂中的应用，所述的植物病原菌为草莓灰霉病菌、小麦赤霉病菌或立枯丝核菌。

进一步，所述杀菌剂含有甲基营养型芽孢杆菌lm-n经发酵培养获得的发酵液。

进一步，所述发酵液按如下方法制备：(1)将甲基营养型芽孢杆菌lm-n接种至牛肉膏蛋白胨培养基，在30℃培养20～24h，获得斜面菌体；所述牛肉膏蛋白胨培养基组成为：牛肉膏3g/l，蛋白胨5g/l，氯化钠3g/l，琼脂20g/l，溶剂为蒸馏水，ph值7.0～7.4，湿热灭菌(121℃，20min)；

(2)挑取斜面菌体接种至lb液体培养基，在30℃培养24h，获得种子液；所述lb液体培养基组成为：蛋白胨10g/l，氯化钠5g/l，酵母膏10g/l，溶剂为蒸馏水，ph值7.0～7.4，湿热灭菌(121℃，20min)；

(3)发酵培养：将种子液以体积浓度4％的接种量接种至发酵培养基，在30℃、180rpm下发酵3天，获得发酵液；所述发酵培养基组成为：40g/l黄豆饼粉(市售，该培养基专用)，10g/l葡萄糖，3g/l蛋白胨，2g/lnacl，2g/lcaco3，溶剂为蒸馏水，ph值7.0～7.4，湿热灭菌(121℃，20min)；

进一步，所述抗菌剂中甲基营养型芽孢杆菌lm-n菌体含量为1.0×10⁶～1.0×10⁸cfu/ml。

与现有技术相比，本发明有益效果体现在：

1、本发明甲基营养型芽孢杆菌cgmccno.13541对多种植物病原菌，如草莓灰霉病菌、小麦赤霉病菌、立枯丝核菌具有拮抗作用，是一种防治植物病害防治效果显著并且环境友好的拮抗菌株，具有良好的开发应用前景。

2、本发明甲基营养型芽孢杆菌cgmccno.13541应用简便，其菌株体和在牛肉膏蛋白胨液体培养基培养得到的发酵液均可用于防治植物病害，对草莓灰霉病菌抑菌率高达84％，高出普通生防菌8％左右，为新的防病微生物资源的开发利用奠定基础。

3、本发明甲基营养型芽孢杆菌cgmccno.13541产芽孢，抗逆能力强，使用范围广。

4、本发明甲基营养型芽孢杆菌cgmccno.13541生长速度快，能够快速大量定殖，便于制备生物防治制剂在田间进行推广应用。

(四)附图说明

图1为菌株lm-n的扫描电镜照片。

图2为菌株lm-n的菌落形态图。

图3为基于16srdna序列构建的菌株lm-n系统发育树。

图4为菌株lm-n对灰霉病菌(a)、立枯丝核菌(b)、小麦赤霉病菌(c)生长的影响。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1

1材料与方法

1.1培养基和试剂

牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏0.3g，蛋白胨0.5g，nacl0.3g，琼脂2g，水100ml，ph7.2～7.4，用于拮抗菌的培养。

pda培养基：马铃薯20g，葡萄糖2g，琼脂2g，水100ml，ph自然。用于病原真菌的培养。

富集培养基：马铃薯200g，葡萄糖10g，牛肉膏3g，蛋白胨5g，nacl5g，kh2po42g，mgso41g，琼脂20g，水1l，ph7.2。用于对峙培养，抑菌率测定。

lb液体培养基：蛋白胨10g/l，氯化钠5g/l，酵母膏10g/l，溶剂为蒸馏水，ph值7.0。用于种子液制备。

1.2优势降解菌株选育

1.2.1菌株来源

采集浙江省宁波市奉化草莓大棚草莓植株根围土壤。

1.2.2降解菌株的分离、纯化和筛选

称取10g土样，加入90ml无菌水振荡2h形成悬独液，取1ml液体加入装有9ml无菌水试管中振荡形成10^-2稀释，10倍系列稀释至10^-6，从每个梯度稀释液吸取0.1ml于牛肉膏蛋白胨培养基培养基上，用无菌玻璃涂棒将菌液在牛肉膏蛋白胨培养基平板上涂抹均匀。涂抹好的平板置于30℃恒温箱培养48h，从平板中挑取单菌落反复进行平板划线分离培养，直到筛选得到单个菌落，将纯菌落接种到斜面培养基上，于4℃冰箱内保存。

将活化24h、直径6mm的草莓灰霉病菌菌饼(浙江大学植物病理实验室提供，公知，为各植物病理实验室保存的常见病菌)接种在pda平板中心，用接种针将上述分离纯化的细菌呈三角状接入pda平板，距离中心约2cm，置于30℃恒温培养箱观察对峙培养抑菌情况。将抑菌作用明显的菌株保存备用，筛选得到菌株lm-n。

1.2.3菌株形态特征观察及生理生化特性测定

1.2.3.1形态学鉴定：革兰氏染色及菌落形态观察

取培养24h的菌株lm-n单菌落，涂于载玻片上进行革兰氏染色并在显微镜下观察；

取培养取培养24h的菌株lm-n戊二醛固定液过夜，送电镜室后续处理并进行扫描电镜观察其形态特征。测定结果见图1和图2。

从图1、图2可以看出：菌株lm-n为杆状细菌，革兰氏阳性菌，菌落直径2-3mm呈圆形，乳白色、不透明、中央隆起有褶皱，边缘呈锯齿状。

1.2.3.2生理生化特性鉴定

生理生化特性测定参照《常见细菌系统鉴定手册》(东秀珠，蔡妙英)。

测定结果如下：菌株lm-n最适培养基为牛肉膏蛋白胨培养基，培养温度为30℃，适宜生长ph为6～7，可以利用葡萄糖、蔗糖、淀粉、甘露醇、麦芽糖、乳糖、木糖为碳源，可以使明胶液化，甲基红试验为阳性，其他生理生化特性见表1。

表1:菌株lm-n的生理生化特性

注：+阳性反应；-阴性反应

1.3分子生物学鉴定

该菌株16srdna基因序列(1437bp，seqidno.1)如下所示：

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本发明菌株由采集浙江省宁波市奉化县溪口镇的草莓大棚植株根围土壤中筛选获得，16srdna测序鉴定其基因序列，将基因序列与ncbi数据库中已有的16srdna进行相似性比较，相似性为99％，分析后构建系统发育树，鉴定菌株lm-n为芽孢杆菌属(bacillus)中的甲基营养型芽孢杆菌(bacillusmethylotrophicus)，命名为甲基营养型芽孢杆菌(bacillusmethylotrophicus)lm-n，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，100101，保藏编号：cgmccno.13541，保藏日期：2017年01月06日。。

实施例2菌株lm-n对灰霉病菌、立枯丝核菌、小麦赤霉病菌的拮抗性及抑菌率

测定

本实施例所述草莓灰霉病菌、小麦赤霉病菌、立枯丝核菌由浙江大学农业与生物技术学院植物病理学研究室提供(常规公知)。

供试病原真菌(草莓灰霉病菌(botrytiscinerea)、立枯丝核菌(rhizoctoniasolani)、小麦赤霉病菌(fusariumheadblight)，市售均可，为各植物病理实验室保存的常见病菌)在pda平板上28℃活化48h，用打孔器(直径6mm)在菌落边缘对称位置制取菌饼，将菌丝面朝下接种于富集培养基平板中央，28℃黑暗培养至菌饼直径达到2cm，用相同孔径灭菌单层滤纸片，在供试生防菌(甲基营养型芽孢杆菌lm-n)菌液(lb液体培养基30℃培养24h)中浸湿，均匀摆放在pda平板上。滤纸片距供试病原真菌的菌饼中心30mm对称摆放，4天后测量供试病原真菌的菌落直径以及供试生防菌对供试病原真菌的抑制率。以清水为对照。抑制率(％)＝(对照菌落直径-处理菌落直径)/对照菌落直径×100％。试验结果见图4和表2，图4中植物病原菌从左至右分别为草莓灰霉病菌、立枯丝核菌、小麦赤霉病菌。

表2菌株lm-n对多种植物病原菌抑制率

结果表明：甲基营养型芽孢杆菌cgmccno.13541对灰霉病菌的抑制率最强，高达84％，对立枯丝核菌的抑制效果次之，为72％，对小麦赤霉病菌的抑制率为68％。综合看来甲基营养型芽孢杆菌cgmccno.13541对多种植物病原菌都有较强大的抑制作用，具有很大的推广价值。

实施例3甲基营养型芽孢杆菌cgmccno.13541发酵液对草莓灰霉病田间效果验证

3.1供试药剂

甲基营养型芽孢杆菌cgmccno.13541发酵液；50％扑海因可湿性粉剂(市售)。

所述发酵液按如下方法制备：

(1)将甲基营养型芽孢杆菌lm-n接种至牛肉膏蛋白胨培养基，在30℃培养20～24h，获得斜面菌体；所述牛肉膏蛋白胨培养基组成为：牛肉膏3g/l，蛋白胨5g/l，氯化钠3g/l，琼脂20g/l，溶剂为蒸馏水，ph值7.0；

(2)挑取斜面菌体接种至lb液体培养基，在30℃培养24h，获得种子液；所述lb液体培养基组成为：蛋白胨10g/l，氯化钠5g/l，酵母膏10g/l，溶剂为蒸馏水，ph值7.0；

(3)发酵培养：将种子液以体积浓度4％的接种量接种至发酵培养基，在30℃、200rpm下发酵3天，获得发酵液，菌体含量在1.0×10⁷cfu/ml；所述发酵培养基组成为：40g/l黄豆饼粉(市售，发酵培养基专用)，10g/l葡萄糖，3g/l蛋白胨，2g/lnacl，2g/lcaco3，溶剂为蒸馏水，ph值7.0；

3.2供试作物与防治对象

供试作物：草莓，品种为红颜

防治对象：灰霉病

3.3试验地概况

试验地设在浙江宁波市奉化溪口草莓种植基地，于2016年在该地草莓种植大棚内进行防治草莓灰霉病试验。所有试验小区的土壤类型、施肥灌溉措施均一致，符合当地农业生产规范。

3.4试验设计

本试验设计了甲基营养型芽孢杆菌cgmccno.13541发酵液(菌体含量在1.0×10⁷cfu/ml)清水稀释400倍、600倍、800倍，50％扑海因可湿性粉剂用清水稀释800倍及清水对照共5个处理，每个小区8m²，重复3次。

3.5试验调查及统计方法

于喷施药剂前、后10天调查病情指数，试验期间共调查2次。采用随机抽样方法进行调查。每个小区随机5株，每株选3个枝标记，施用前后均从完全展开叶往下数5片叶进行调查记录。施用药剂期间观察是否产生药害。

分级标准如下：

0级：无病斑；

1级：病斑面积占整个叶面积5％以下；

3级：病斑面积占整个叶面积6％～10％；

5级：病斑面积占整个叶面积11％～20％；

7级：病斑面积占整个叶面积21％～50％；

9级：病斑面积占整个叶面积51％以上。

按下列公式计算病情指数和防治效果：

病情指数＝∑(各级病叶数×相对级数值)/(调查病叶数×最高代表极值)*100

防治效果(％)＝[1-(对照区药前病指×处理区药后病指)/(对照区药后病指×处理区药前病指)]×100

3.6供试药剂对草莓灰霉病的防治效果

表3甲基营养型芽孢杆菌cgmccno.13541发酵液对草莓灰霉病田间效果

试验

试验结果表明：施药后10天，甲基营养型芽孢杆菌cgmccno.13541发酵液稀释400倍时的防治效果最好，为75.33％；cgmccno.13541发酵液稀释600和800倍时防治效果差异不大，分别为71.24％、670.25％；50％扑海因稀释800倍时防治效果显著低于cgmccno.13541发酵液的处理。

4小结

从草莓灰霉病病情指数和防治效果来看，甲基营养型芽孢杆菌cgmccno.13541发酵液对草莓灰霉病有较好的的防治效果，效果可达75.33％。对人和果实无害，对环境友好，值得开发推广。

sequencelisting

<110>浙江大学

<120>甲基营养型芽孢杆菌及其应用

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