一种高产β‑1,3‑葡聚糖枯草芽孢杆菌及其应用的制作方法

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种高产β-1,3-葡聚糖枯草芽孢杆菌菌株及其发酵培养方法。

背景技术：

β-1,3葡聚糖是一类主链结构由β-1,3-糖苷键连接，通常含有不同比例和大小的β-1,3，β-1,4，β-1,6糖苷键连接的支链的大分子多糖。20世纪60年代，就已证明β-1,3葡聚糖具有增强哺乳动物免疫活力、抗肿瘤、抗细菌、抗病毒、降低胆固醇和血脂、促进伤口愈合等作用，显示了其在药学领域的潜在应用价值，受到广泛的关注；近年来的研究表明，β-1,3葡聚糖应用在日化产品中，可以起到保湿、抗炎、抗衰老、去皱、去头屑、退黄、加快修复、增加皮肤弹性的作用，应用于畜禽养殖可以增强畜禽的机体免疫力、改善胃肠功能等，进一步拓展了β-1,3葡聚糖应用领域。

传统上生产β-葡聚糖的方法是从香菇、酵母、燕麦、青稞中提取获得。由于受到原料生产规模、生产周期的限制，通过提取方式生产β-葡聚糖远远不能满足的市场需求。为了改进β-葡聚糖生产方式，提升β-葡聚糖的产量，近年来，国内外研究中开展了高产β-葡聚糖的微生物的筛选研究，目前已经筛选出的适于规模化生产β-葡聚糖微生物包括啤酒酵母、枯草芽孢杆菌等，国外已经开展了通过微生物发酵培养规模化生产β-葡聚糖细菌来源的β-葡聚糖酶的尝试，但我国微生物发酵生产β-葡聚糖的相关研究起步较晚，以啤酒酵母为主，其他来源较少。但啤酒酵母生产β-葡聚糖仍存在原料转化利用率低，产品纯度低、品质差等缺点，难以适应当前市场对高品质β-葡聚糖的需求。

技术实现要素：

本发明公开了一种高产β-1,3-葡聚糖枯草芽孢杆菌菌株zjs-1。本发明的菌株zjs-1通过发酵培养直接转化蔗糖合成β-1,3-葡聚糖，即直接以蔗糖为碳源，通过生物转化合成β-1,3-葡聚糖。

发明人通过菌落拉丝法和液体培养物中葡聚糖产量的方法从南京市钟山风景区林下土壤中筛选得到，命名为zjs-1，该菌菌落呈白色，粗糙褶皱，边缘不整齐。分类命名：枯草芽孢杆菌，bacillussubtilis。其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号是：cgmccno.12176。保藏时间：2016年3月4日，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学研究微生物研究所。

高产β-1,3-葡聚糖菌株的筛选：

按照kh2po40.3-1.0g/l；cacl20.3-1.0g/l，mgso40.6-1.2g/l，feso4·7h2o0.6-1.2g/l，蔗糖3.0-8.0g/l，琼脂12.0-18.0g/l的浓度称取物质，重蒸水溶解定容，调ph6.5-7.0，115-121℃灭菌20-30分钟；制成筛选培养基；将采集的用于筛选的土样0.5-1.5g或水样1-2ml加入5ml液体培养基中，于30℃摇床中振荡培养48-72h用于富集产葡聚糖菌，之后将48-72h培养物以5％的接种量涂布于筛选平板培养基中，25-30℃倒置培养48-72h，利用菌落拉丝法检测各菌落的拉丝性能，选取具有明显拉丝性能的菌落转接到5-8ml筛选液体培养基中，28-32℃，150-300rpm震荡培养24-48h，取样利用刚果红法测定各培养物中β-1,3-葡聚糖含量，选取β-1,3-葡聚糖含量最高的菌株，筛选结果见图1。由图1可知，1号菌株zjs-1的β-1,3-葡聚糖产量最高，因此选取菌株zjs-1为高产β-1,3-葡聚糖的菌株，对其进行遗传分析和培养条件优化。

产β-1,3-葡聚糖菌株的16srdna鉴定：

菌种鉴定通过16srdna序列分析完成。挑取菌株zjs-1斜面培养物适量，加至5-10ml液体种子培养基中，28-32℃培养过夜，取2ml菌液，5000×g离心5min，弃上清液，在沉淀中加入200-300μl细胞裂解液，加入10-20μl蛋白酶k，56℃水浴1-2h。100℃沸水浴加热10-15min后，12000rpm离心10min，取上清液进行pcr反应。引物序列如下：

上游引物：5'-cggctcccttgttacgactt-3'

下游引物：5'-agagtttgatactggctcag-3'

pcr产物纯化后进行测序，测得菌株zjs-1的16srdna序列。测序结果如seqidno：1所示。

本发明还公开了以蔗糖为原料，通过zjs-1菌株发酵培养转化生产β-1,3-葡聚糖的方法，优选的方法如下：

a.将权利要求1的菌株接种于菌种活化培养基，静置恒温培养；

b.从菌种活化培养基上刮取活化的菌株转接到液体种子培养液培养，作为发酵培养的种子液；

c.将种子液接种到发酵培养液中，于发酵罐发酵，即得。

a步骤中，优选的活化培养基中含kh2po40.3-1.0g/l、cacl20.3-1.0g/l、mgso40.6-1.2g/l、feso4·7h2o0.6-1.2g/l、蔗糖3.0-8.0g/l和琼脂12.0-18.0g/l。优选活化培养基ph为6.5-7.0；恒温培养温度优选为25-30℃；培养时间优选2-3天。

b步骤中，液体种子培养液优选含蛋白胨8.0-10.0g/l、酵母浸粉3.0-5.0g/l和氯化钠3.0-5.0g/l。液体种子培养液ph优选为7.0-7.8。

b步骤中，在液体种子培养液中的培养温度优选为28-32℃、优选在摇床中以150-300rpm的速度震荡培养48-72h，至培养液od600值在0.6-0.9之间时结束培养，作为发酵培养的种子液。

c步骤中，发酵培养液中优选含蛋白胨0-3.0g/l、酵母浸粉0-1.5g/l和蔗糖120g/l，发酵培养液ph优选7.0-7.8。

c步骤中，种子液与发酵培养液的体积比优选为1:300～1:800。发酵罐发酵温度优选为25-35℃，发酵时间优选为5-9天。

本发明培养液都是以水为基质，上述优选的成分溶解在水中制成培养基或培养液。

本发明方法蔗糖转化率达85-95％，β-1,3-葡聚糖粗品得率可高达60％。

本发明利用从土壤中筛选获得的高产β-1,3-葡聚糖菌株，通过优化发酵条件的控制，实现蔗糖的高效转化制备β-1,3-葡聚糖菌，可实现β-1,3-葡聚糖菌的工业化制备，避免或降低了传统β-1,3-葡聚糖菌提取制备方式高度依赖原料来源的缺点，同时拓展了蔗糖资源的高值加工利用，基于当前食品、医药、养殖领域对β-1,3-葡聚糖的市场需求，本发明具有良好的应用前景。

附图说明

图1是产葡聚糖菌株的筛选结果

图2是产葡聚糖菌株的培养基筛选

图3是产葡聚糖枯草芽孢杆菌zjs-1培养基碳源浓度和生物量的关系

图4是产葡聚糖枯草芽孢杆菌zjs-1培养基碳源浓度对产物积累的影响

具体实施方式

实施例1

菌株筛选

按照kh2po41.0g/l；cacl21.0g/l，mgso41.0g/l，feso4·7h2o1.0g/l，蔗糖5.0g/l的浓度称取物质，重蒸水溶解定容，调ph7.0，115℃灭菌30分钟制成筛选培养基；将采集的用于筛选的土样1.0g加入5ml液体培养基中，于30℃摇床中振荡培养60h后，将培养物以5％的接种量涂布于筛选平板培养基中，28℃倒置培养48h，利用菌落拉丝法检测各菌落的拉丝性能，选取具有明显拉丝性能的菌落转接到5ml筛选液体培养基中，28℃，200rpm震荡培养30h，取样利用刚果红法测定各培养物中β-1,3-葡聚糖含量，选取β-1,3-葡聚糖含量最高的菌株。命名为zjs-1，该菌菌落呈白色，粗糙褶皱，边缘不整齐。分类命名：枯草芽孢杆菌，bacillussubtilis。其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号是：cgmccno.12176。保藏时间：2016年3月4日，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学研究微生物研究所。

实施例2

β-1,3-葡聚糖的制备

菌株活化培养基的筛选：分别按照kh2po41.0g/l；cacl21.0g/l，mgso41.0g/l，feso4·7h2o1.0g/l，蔗糖5.0g/l与kh2po41.0g/l；cacl21.0g/l，mgso41.0g/l，feso4·7h2o1.0g/l，葡萄糖5.0g/l的质量浓度称取物质，重蒸水溶解定容，调ph7.0，115℃灭菌30分钟分别制成蔗糖与葡萄糖培养基，取实施例1的枯草芽孢杆菌zjs-1菌种接至两种培养基中，28℃，200rpm震荡培养30h，取样离心测定各培养基中菌体的湿重，选取菌体湿重最大的培养基。筛选结果见附图2，由图2可见，以蔗糖为碳源的培养基更有利于产β葡萄菌株的生长和被他5葡聚糖的转化。

菌株的培养与保藏：称取kh2po41.0；cacl21.0，mgso41.0，feso4·7h2o1.0g，蔗糖5.0g，琼脂16.0g的质量浓度称取物质，重蒸水溶解定容至1l，调ph6.5，115℃灭菌30分钟，于平皿中倒平面，菌种保藏管中倒斜面培养基；取枯草芽孢杆菌zjs-1菌种，按照“s”形划线接种于平面培养基，28℃静置恒温培养3天后，选取无杂菌的菌落接种于斜面培养基上，28℃静置恒温培养3天后，于4℃保藏。

发酵培养基的筛选：称取蛋白胨10g/l，酵母浸粉5g/l，蔗糖由40g/l至200g/l不等，每10g/l为一个浓度梯度，于10l发酵罐中，重蒸水溶解定容至10l，调培养液ph7.4，通入蒸汽115℃灭菌30分钟；将100ml种子液分别接种到发酵培养液中，30℃，发酵8天，每天取样离心测定各培养基中菌体的湿重，选取菌体湿重最大的培养基。称取蛋白胨1g/l至10g/l，酵母浸粉0.5g/l至5g/l，蔗糖120g/l，于10l发酵罐中，重蒸水溶解定容至10l，调培养液ph7.4，通入蒸汽115℃灭菌30分钟；将100ml种子液分别接种到发酵培养液中，30℃，发酵8天，测蔗糖及葡聚糖的转化率，选择转化率最高的培养基。筛选结果见图3和图4。由图3和图4可见，培养基碳源浓度对产葡聚糖枯草芽孢杆菌zjs-1菌株的生物量和产物积累都存在影响，蔗糖浓度在80-120mg/kg时，zjs-1菌株的生物量和产物积累较高，说明zjs-1菌株培养转化蔗糖制备β葡聚糖市，蔗糖的适宜浓度为80-120mg/kg

培养发酵：称取kh2po41.0；cacl21.0，mgso41.0，feso4·7h2o1.0g/l，蔗糖5.0g/l，琼脂16.0g/l的质量浓度称取物质，重蒸水溶解定容至1l，调ph6.5，115℃灭菌30分钟；取枯草芽孢杆菌zjs-1菌种，按照“s”形划线接种于菌种活化培养基，28℃静置恒温培养2天；按照蛋白胨10.0g，酵母浸粉3.0g，氯化钠5.0g的质量浓度称取各物质，重蒸水溶解定容至1l，调培养液ph7.0-7.4，按照100ml/瓶分装于500ml三角瓶中，115℃灭菌30分钟；从菌种活化培养基上刮取活化的zjs-1转接到100ml液体种子培养液中，于30℃摇床中以200rpm的速度震荡培养72h，至培养液od600值在0.85，作为发酵种子液备用；称取蛋白胨300g，酵母浸粉50g，蔗糖9000g，于100l发酵罐中，重蒸水溶解定容至100l，调培养液ph7.4，通入蒸汽115℃灭菌30分钟；将100ml种子液接种到发酵培养液中，30℃，发酵8天，测得蔗糖转化率达91％，最终发酵液中β-1,3-葡聚糖的浓度为65.8g/l，得β-1,3-葡聚糖粗品4000g。

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<110>南京曜动节能环保科技有限公司

<120>一种高产β-1，3-葡聚糖枯草芽孢杆菌及其应用

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<213>枯草芽孢杆菌

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