一种对胃蛋白酶抗性提高的纤维素酶酶E4及其应用的制作方法

本发明涉及一种纤维素酶胃蛋白酶e4，特别是一种对胃蛋白酶抗性提高的纤维素酶e4。

背景技术：

纤维素酶是指能降解纤维素的一类酶的总称，是一个由多种水解酶组成的复杂酶系，主要来自于真菌和细菌。根据各酶功能的不同主要分为三类：(1)葡聚糖内切酶(1,4-β-d-glucanglucanohydrolase，ec.3.2.1.4)，来自于真菌简称为eg；来自于细菌简称成为len，这类酶一般作用于纤维素内部的非结晶区，随机水解β-1,4糖苷键，将长链纤维素分子截断，产生大量带非还原性末端的小分子纤维素；(2)葡聚糖外切酶(1,4-β-d-glucancellobihydrolase，ec.3.2.1.91)，来自于真菌简称为cbh；来自于细菌简称成为cex，这类酶作用于纤维素线性分子末端，水解β-1,4糖苷键，每次切下一个纤维二糖分子，故又称为纤维二糖水解酶(cellobiohydrolase)；(3)β-葡聚糖苷酶(β-1,4-glucosidase，e.c3.2.1.21，简称bg)，这类酶将纤维二糖水解成葡萄糖分子。

作为纤维素酶的重要组成部分纤维素酶e4，它是由褐色热单胞菌(thermomonosporafusca)产生的，t.fusca是一种生存在土壤中的嗜热的丝状放线菌，其产生6种结构和功能各有特点的纤维素酶。包括：两种外切纤维素酶，三种内切纤维素酶，褐色热单胞菌产生的另外一种，也是最为独特的一种纤维素酶为cel9a(ex-e4)，它同时表现出内切酶和外切酶的共同的活性，具有较高的研究利用价值，因此也是饲用酶制剂中纤维素用酶的首选。

我国配合饲料中除一般玉米-豆粕型日粮，还有在玉米-豆粕型日粮基础上加入10％-40％的大麦或小麦、次粉、麦麸、统糠、棉粕等非常规饲料原料，这使得饲料中非淀粉多糖(nsp)和植酸等抗营养因子增多降低了畜禽对饲粮中营养物质的消化、吸收及利用，影响畜禽健康和生产性能。因此饲用酶制剂在饲料工业中占有重要地位。另外，外国低价格小麦、大麦产品的涌入，将进一步刺激饲用酶制剂的市场需求。目前，饲用酶制剂在世界各国广泛应用于猪、家禽、反刍动物、水产动物的饲粮中。随着生物技术的发展，通过微生物发酵方法可大量人工制成各种酶制剂，为其在饲料工业中大规模应用提供了保障。

麦类日粮中各种植物性饲料原料都由无数植物细胞构成，细胞的细胞壁包裹着淀粉、蛋白质、脂肪等营养物质。细胞壁主要由纤维素，半纤维素、果胶和木质素等构成，饲料粉碎工序难以破坏细胞壁。单胃动物消化酶液无法消化细胞壁物质，而nsp酶降解细胞壁中的细胞壁物质，使细胞壁崩解，释放出被细胞壁包裹的养分，为动物所利用。作为nsp酶中重要组成部分纤维素酶发挥着重要作用。

饲料用酶是在进入养殖动物消化道之后发挥作用的，它本身作为一种具有生物活性的蛋白，其发挥作用受到动物消化道环境的影响，而胃中较低的ph值可能对酶的活性有很大影响，降低了酶制剂的使用效率。因此获得具有蛋白酶抗性的酶制剂很有必要。

技术实现要素：

本发明的首要目的是提供一种对胃蛋白酶抗性提高的纤维素酶e4。

本发明是对纤维素酶e4的基因进行定点突变。由褐色热单胞杆菌(thermonosporafusca)中获得得纤维素酶e4已经被测序。genbank登录号为l20093.1，长度为2502bp，编码834个氨基酸残基。

根据本发明所述的一种定点突变改造的纤维素酶e4，是是由氨基酸序列为seqidno.1的来源于褐色热单胞杆菌(thermonosporafusca)的纤维素酶e4中制造多个氨基酸取代而产生的、对胃蛋白酶抗性更强的纤维素分解酶，所述的氨基酸取代是第691位和第800位的取代。

根据本发明所述的定点突变改造的纤维素酶e4的进一步特征，所述在第691位的氨基酸取代是用组氨酸取代亮氨酸；在800位的氨基酸取代是用组氨酸取代亮氨酸。

本发明所述的突变体纤维素酶(命名为me4^l691h,l800h)，经模拟胃液(ph＝1.2，3.2mg/ml胃蛋白酶溶液)处理1h后，其半衰期比野生型酶延长了83min，其对胃蛋白酶的抗性比野生型e4提高5.88倍，因此该酶蛋白不仅依然对纤维素具有催化功能，而且提高了其对胃蛋白酶的耐受性，其他酶学性质与野生型酶基本一致，仅在数值表征上稍逊。

进一步地，本发明提供了一种dna分子，其编码本发明所述的对胃蛋白酶抗性提高的纤维素酶。

优选地，本发明所述的dna分子的核苷酸序列为seqidno.3。

本发明的另一个目的是提供一种载体，其含有本发明所述的dna分子。

本发明的又一个目的是提供一种宿主细胞，其含有本发明所述的dna分子，或者含有本发明所述的载体。

上述载体和宿主细胞都可以通过本领域公知的技术手段进行制备。

本发明还提供了本发明所述的对胃蛋白酶抗性提高的纤维素酶e4的生产方法，包括在适于e4表达的条件下培养本发明所述的宿主细胞，并从培养基中分离所述的纤维素酶e4。

当本发明所述的dna分子以合适的取向和正确的阅读框插入到所述的载体，或者转入所述的宿主细胞中，所述的dna分子可以在任何真核或者原核表达系统中表达。许多宿主-载体系统都可以用来表达蛋白质编码序列。宿主-载体系统包括但不限于：用噬菌体、质粒或粘粒转化的细菌；含有酵母载体的微生物，如酵母；用病毒感染的哺乳动物细胞系统；用病毒感染的昆虫细胞系统；用细菌感染的植物细胞系统。本发明优选的载体包括病毒载体、质粒、粘粒或者寡核苷酸。

本发明优选的宿主为原核系统如大肠杆菌；本发明优选的蛋白质表达方法为低温iptg诱导分泌表达。

由于可用于制备饲料或食品，结合目前的饲料和食品的加工工艺，本发明进一步提供了所述的定点突变改造的纤维素酶e4在制备饲料或食品或其添加剂中的应用。

附图说明

图1和图2分别显示本发明所述的野生型e4蛋白与突变体在经胃蛋白酶处理后不同时间点的sds-page鉴定结果。目的蛋白条带的大小为100kd左右。

图3是本发明所述的灰度扫描结果算出的蛋白残留率。

图4是由公式c＝c0e^-kt得到的图。

具体实施方式

本文中所采用的术语，除非另有说明，均为本领域技术人员所通常理解的含义。以下提供在本发明中使用的一些特殊术语的定义。

“wte4”表示野生型纤维素酶e4，其基因以斜体wte4表示。

“me4^l691h,l800h”表示突变体纤维素酶e4，其基因以me4^l691h,l800h表示。

实施例1：全基因合成wte4，me4^l691h,l800h基因

本发明委托华大基因公司利用全基因合成手段获取了来源于thermonosporafusca的纤维素酶e4基因(l20093.1)和突变体me4^l691h,l800h，其载体为pet28a⁺，含kan抗性。宿主菌为top10。

实施例2：含目的基因的pet28⁺质粒转化bl21(de3)

1、利用质粒抽提试剂盒抽提含目的基因的pet28⁺质粒

(1)柱平衡步骤：向吸附柱cp4中(吸附柱放入收集管中)加入600ul的平衡液bl，12,000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

(2)取5ml过夜培养的菌液加入离心管中，12,000rpm离心1min，尽量吸除上清。

(3)向留有菌体沉淀的离心管中加入250ul溶液p1(已加入rnasea)，使用涡旋振荡器彻底悬浮细菌细胞沉淀。

(4)向离心管中加入250ul溶液p2，温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解。

(5)向离心管中加入350ul溶液p3，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，此时会出现白色絮状沉淀。12,000rpm离心10min，此时在离心管底部形成沉淀。

(6)将上一步收集的上清液分次加入吸附柱cp4中，12,000rpm1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱cp4放入收集管中。

(7)向吸附柱cp4中加入500ul去蛋白液pd,12,000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱cp4重新放回收集管中。

(8)向吸附柱cp4中加入600ul漂洗液pw(已加入无水乙醇)，12,000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱cp4放入收集管中。

(9)重复操作步骤8。

(10)吸附柱cp4放入收集管中，12,000rpm离心2min，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。接着打开cp4盖，置于室温放置10分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

(11)将吸附柱cp4置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50ul，65℃ddh2o，室温放置2min，12,000rpm离心2min，将质粒溶液收集到离心管中。

2.质粒转化进入bl21(de3)感受态细胞中。感受态细胞购于北京鼎国昌盛生物技术有限公司。

(1)于-80℃冰箱取出冰冻的感受态细胞50ul，置于冰上解冻。

(2)往感受态细胞中加入待转入的质粒，混匀。冰上放置30min。

(3)42℃热击90s，立即置于冰上冷却2min。

(4)加入800ul不含抗性的lb液体培养基，混匀。37℃，180rpm振荡培养1h。

(5)4000rpm，离心2min。弃去部分上清，留约200ul上清用于重悬细胞。

(6)在含有100ug/mlkan的lb平板上涂布，静止30min后，37℃倒置培养过夜。

3.待转化子长出后利用ecori和xhoi双酶切跑电泳结果显示有5.3kbp和2.5kbp两条带，表明转化成功。

实施例3：探索野生型wte4与突变体me4^l691h,l800h蛋白的表达条件

为了找到最适合野生型wte4与突变体me4^l691h,l800h蛋白可溶性表达的温度和iptg浓度，实验设置了三组温度，分别为22℃，30℃，37℃。iptg也分为三个浓度，分别是0.2mm，0.6mm，1.0mm，两两组合共九个实验组进行诱导，得到了最佳可溶性诱导条件。

实施例4：野生型wte4与突变体me4^l691h,l800h蛋白的sds-page电泳检测

(1)配置10ml10％的分离胶，混匀后用移液枪往玻板中灌胶，直到离短玻板顶部2～3厘米处停止，然后用蒸馏水封住胶面，可轻轻抬起制胶器一端然后放下使胶面平整，聚合40min后到弃蒸馏水，用滤纸吸去多余水分；

(2)配置4ml5％的浓缩胶，均匀的灌在分离胶之上，插入相应规格的柱子同时应避免产生气泡，聚合30min待胶凝固；

(3)装好电泳槽，将槽内灌电泳液，体积宜大于电泳槽体积的一半，把制好的胶移入电泳槽中，小心拔去样品梳子；

(4)依次点样，点样量不宜过多，15ul每孔为合适；

(5)电泳开始时先设置90v跑胶，指示剂至浓缩胶部分将电压改为150v继续电泳，目的条带跑到中间位置时可停止电泳；

(6)小心剥下凝胶，考马斯亮蓝r-250染色30min后，脱色液脱色至背景较浅蛋白条带清晰即可；

(7)凝胶成像并观察结果。

实施例5：野生型wte4与突变体me4^l691h,l800h蛋白的表达纯化

1.样品准备

(1)将野生型wte4与突变体me4^l691h,l800h菌株接种于含kan抗性的5mllb液体培养基中，37℃，200rpm过夜培养。次日按1:1000扩大培养转接至含100ug/mlkan抗性的250mllb液体培养基中。待其od＝0.6-1.0时加入0.2mm的iptg进行诱导，诱导条件为22℃，160rpm，24h。

(2)用iptg诱导24h后收集菌体。菌液用250ml离心管于4℃，6000g，离心20min后弃去上清。

(3)菌体沉淀用适量tris-hcl(ph＝7.4)重悬，重悬液用超声仪进行超声破碎，破碎的菌液用10ml离心管10,000g20min4℃离心两次，并过0.45um的微孔滤膜去除杂质作为纯化上样液。

2.蛋白纯化

(1)柱平衡

通过纯化条件的优化后，加入含20mm咪唑的tris-hcl(ph＝7.4)开始平衡层析柱，直到紫外，电导峰基线平衡为止。

(2)上样

向层析柱中加入粗酶液，开始进样，此时控制流速在1ml/min-2ml/min，观察紫外峰，此峰为未和ni结合的杂蛋白，可收集峰尖处的粗酶液做sds-page检测。

(3)洗涤

进样完毕后，用tris-hcl(ph＝7.4)冲洗管路中未结合的蛋白，之后用含适量浓度的咪唑洗脱杂蛋白，如若洗杂过程中有目的蛋白洗脱下来，可适量降低或不加咪唑作为洗杂液。

(4)洗脱

用含有500mm咪唑的洗脱液(elutionbuffer)梯度洗脱层析柱，收集洗脱峰做sds-page电泳检测。

(5)清洗层析柱

向层析柱中加入1mnaoh清洗层析柱3个柱体积，然后用超纯水清洗，直至吸光值接近基线水平。向柱内加入5倍凝胶体积的20％乙醇，使凝胶保存在乙醇中。

实施例6：野生型wte4与突变体me4^l691h,l800h蛋白的胃蛋白酶抗性检测

将野生型wte4与突变体me4^l691h,l800h重组蛋白分别用人工模拟胃液消化不同时间点后(野生型wte4与突变体me4^l691h,l800h蛋白的添加量相同，人工模拟肠液和反应酶液蛋白含量按照质量比为4:13的比例在37℃温浴)，测定了不同时间点蛋白残留量，结果如图3所示。

胃蛋白酶催化e4蛋白的反应符合酶催化底物的一级反应特征，底物的消耗可用如下公式表征：lnc＝-kt+lnc0，其中，c0表示底物的初始浓度，c表示反应过程中底物的浓度，根据该公式可推导得到如下公式

c＝c0e^-kt

由公式c＝c0e^-kt可得图4。

从lnc＝-kt+lnc0公式可以看出若以lnc对时间t作图理应得到一条直线，直线斜率的负值就是反应速率常数k，当t＝t1/2时，则c＝c0/2代入式子lnc＝-kt+lnc0得

k＝(ln2)/t1/2

t1/2＝0.693/k

因此wte4半衰期为17min，me4^l691h,l800h半衰期为100min。

sequencelisting

<110>暨南大学

<120>一种对胃蛋白酶抗性提高的纤维素酶e4及其应用

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