一种单环刺螠生物活性肽及其制备方法与流程

本发明涉及生物活性肽技术领域，尤其是涉及一种单环刺螠生物活性肽及其制备方法。

背景技术：

单环刺螠，俗名：海肠、海肠子，属于螠虫动物门、螠纲、无管螠目、刺螠科、刺螠属；个体肥大，肉味鲜美，体壁肌富含蛋白质和多种人体必需氨基酸。自古以来，在我国、日本和朝鲜沿海均作为名贵的海鲜食品，有较高的经济价值。人们的传统做法只食用其体壁，而废弃内脏，菜肴俗称海肠子。研究发现，单环刺螠蛋白质含量为18.25％,脂肪含量为0.12％，总糖含量为4.09％而且含有丰富的ca、mg、fe、zn等元素；也含有丰富的epa、dha和dpa。

高血压，血压的持续增加是动脉粥样硬化一个主要的诱发因素，其产生的后果,如心肌梗塞和中风是全球发病率和死亡率的主要原因。许多情况下高血压是过度和特异表达活动肾素-血管紧张素系统(ras)构成的发病机制。事实上,血管紧张素ii(angii)是ras途径的关键活性成分,不仅是一种有效的血管收缩剂，而且也有助于炎症、氧化应激在脉管系统的结构改造,导致长期不良后果如血管异常增殖血管平滑肌细胞和炎性变化(vsmc),血管重塑和动脉粥样硬化ras系统一直是药理开发研究的目标，通过干预措施来控制高血压及其病理并发症。然而,这些治疗方法通常需要终身治疗，产生不同程度的不良的影响和副作用。考虑到这些传统的局限性降压药,开发更安全的自然代谢产物作为这些降压药的替代品引起了广泛的兴趣。食品中蛋白质及其组分生物活性肽是潜在的宝藏。事实上,大量从鸡蛋、牛奶和海鲜来源的生物活性肽已经验证了降压活性,而单环刺螠体壁中所含的生物活性肽也具有类似的功效，具有良好的ace抑制作用。

技术实现要素：

为解决上述问题，本发明提供了一种单环刺螠生物活性肽，具有降压活性，并且能抑制血管内皮细胞增生；

本发明还提供了一种由单环刺螠体壁中提取单环刺螠生物活性肽的制备方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种单环刺螠生物活性肽，其氨基酸序列为thr-arg-gly-pro-pro。

本发明中的单环刺螠生物活性肽提取自单环刺螠的体壁中，该生物活性肽的c端为脯氨酸，n端为苏氨酸，符合具有ace抑制作用的多肽的一系列特征，其具有良好的ace抑制作用。

作为优选，单环刺螠生物活性肽的化学结构式为：

一种单环刺螠生物活性肽的制备方法，包括以下步骤：

a)剪碎脱脂：将单环刺螠体壁剪碎，并用丙酮脱脂处理，脱脂后离心除去上清液，干燥后制得单环刺螠体壁粉；

b)粗品制备：将单环刺螠体壁粉与水混合使单环刺螠体壁粉的质量浓度为0.04～0.06g/ml，然后在75～85℃中加热4小时，接着离心取上清液，制得粗品；

b)初次酶解：按每1g粗品添加4.5～5.5ml水的配比，将粗品与水混合，然后调节ph值至6.5～7.0，在向其中加入2～3wt％的木瓜蛋白酶并在55～65℃下加热4小时，接着在100℃下加热15分钟灭酶，最后在4500rpm下离心20分钟，取上清液为初次酶解液；

c)再次酶解：向初次酶解液中加入0.45～0.55wt％的胰蛋白酶，在ph为9.5～10.5温度为60℃下加热4小时，接着接着在100℃下加热15分钟灭酶，最后在4500rpm下离心20分钟，取上清液为再次酶解液；

d)减压浓缩：将再次酶解液浓缩至原体积的1/20，接着使用95vol％乙醇沉淀，使乙醇浓度为80vol％，制得浓缩液，将浓缩液在4℃下保存；

e)冷冻干燥：将浓缩液冷冻干燥，制得单环刺螠体壁酶解产物；

f)分离纯化：将单环刺螠体壁酶解产物依次采用凝胶色谱柱层析法和高效液相色谱法分离纯化得到单环刺螠生物活性肽。

作为优选，步骤f分离纯化具体为：

一、凝胶色谱柱层析：取单环刺螠体壁酶解产物用蒸馏水溶解成100mg/ml溶液，采用sephadexg-15凝胶色谱柱2.0cm×100cm进行分离纯化，自动部分收集器收集，每管收集3ml，280nm测定吸光度，收集各峰，冻干备用，制得酶解层析产物；

二、高效液相色谱法分离纯化：将酶解层析产物用高效液相色谱分离纯化，色谱条件如下：色谱柱为反相c18键合硅胶柱；流动相：水，乙腈；检测波长为254nm和280nm，收集主要色谱峰，冻干得到单环刺螠生物活性肽。

作为优选，高效液相色谱法分离时的条件如下：

0min：水100％，乙腈0％；

4min：水100％，乙腈0％；

16min：水70％，乙腈30％；

17min：水0％，乙腈100％；

35min：水0％，乙腈100％。

作为优选，步骤一凝胶色谱柱层析时，流动相为蒸馏水，洗脱速度为0.5ml/min。

作为优选，步骤二高效液相色谱分离纯化时，流速为1.0ml/min，柱温为30℃。

因此，本发明具有以下有益效果：具有较好的ace抑制活性，还能抑制angii诱导的血管内皮细胞的增殖。

附图说明

图1为本发明获得的生物活性肽的凝胶纯化图；

图2为本发明获得的生物活性肽的液相纯化图；

图3为本发明获得的生物活性肽的质谱图；

图4为本发明获得的生物活性肽的细胞增殖抑制示意图；

其中，图1中的f2为含有活性肽的组分。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明的技术方案作进一步的说明。

显然，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

一种单环刺螠生物活性肽，其氨基酸序列为thr-arg-gly-pro-pro。

一种单环刺螠生物活性肽的制备方法，包括以下步骤：

a)剪碎脱脂：将单环刺螠体壁剪碎，并用丙酮脱脂处理，脱脂后离心除去上清液，干燥后制得单环刺螠体壁粉；

b)粗品制备：将单环刺螠体壁粉与水混合使单环刺螠体壁粉的质量浓度为0.04g/ml，然后在75℃中加热4小时，接着离心取上清液，制得粗品；

b)初次酶解：按每1g粗品添加4.5ml水的配比，将粗品与水混合，然后调节ph值至6.5，在向其中加入2wt％的木瓜蛋白酶并在55℃下加热4小时，接着在100℃下加热15分钟灭酶，最后在4500rpm下离心20分钟，取上清液为初次酶解液；

c)再次酶解：向初次酶解液中加入0.45wt％的胰蛋白酶，在ph为9.5温度为60℃下加热4小时，接着接着在100℃下加热15分钟灭酶，最后在4500rpm下离心20分钟，取上清液为再次酶解液；

d)减压浓缩：将再次酶解液浓缩至原体积的1/20，接着使用95vol％乙醇沉淀，使乙醇浓度为80vol％，制得浓缩液，将浓缩液在4℃下保存；

e)冷冻干燥：将浓缩液冷冻干燥，制得单环刺螠体壁酶解产物；

f)分离纯化：将单环刺螠体壁酶解产物依次采用凝胶色谱柱层析法和高效液相色谱法分离纯化得到单环刺螠生物活性肽；

其中，步骤f分离纯化具体为：

一、凝胶色谱柱层析：取单环刺螠体壁酶解产物用蒸馏水溶解成100mg/ml溶液，采用sephadexg-15凝胶色谱柱2.0cm×100cm进行分离纯化，自动部分收集器收集，每管收集3ml，280nm测定吸光度，收集各峰，冻干备用，制得酶解层析产物；凝胶色谱柱层析时，流动相为蒸馏水，洗脱速度为0.5ml/min；

二、高效液相色谱法分离纯化：将酶解层析产物用高效液相色谱分离纯化，色谱条件如下：色谱柱为反相c18键合硅胶柱；流动相：水，乙腈；检测波长为254nm和280nm，收集主要色谱峰，冻干得到单环刺螠生物活性肽；流速为1.0ml/min，柱温为30℃；

其中，高效液相色谱法分离时的条件如下：

0min：水100％，乙腈0％；

4min：水100％，乙腈0％；

16min：水70％，乙腈30％；

17min：水0％，乙腈100％；

35min：水0％，乙腈100％。

实施例2

一种单环刺螠生物活性肽，其氨基酸序列为thr-arg-gly-pro-pro。

一种单环刺螠生物活性肽的制备方法，包括以下步骤：

a)剪碎脱脂：将单环刺螠体壁剪碎，并用丙酮脱脂处理，脱脂后离心除去上清液，干燥后制得单环刺螠体壁粉；

b)粗品制备：将单环刺螠体壁粉与水混合使单环刺螠体壁粉的质量浓度为0.05g/ml，然后在80℃中加热4小时，接着离心取上清液，制得粗品；

b)初次酶解：按每1g粗品添加5.0ml水的配比，将粗品与水混合，然后调节ph值至6.8，在向其中加入2.5wt％的木瓜蛋白酶并在60℃下加热4小时，接着在100℃下加热15分钟灭酶，最后在4500rpm下离心20分钟，取上清液为初次酶解液；

c)再次酶解：向初次酶解液中加入0.50wt％的胰蛋白酶，在ph为10.0温度为60℃下加热4小时，接着接着在100℃下加热15分钟灭酶，最后在4500rpm下离心20分钟，取上清液为再次酶解液；

d)减压浓缩：将再次酶解液浓缩至原体积的1/20，接着使用95vol％乙醇沉淀，使乙醇浓度为80vol％，制得浓缩液，将浓缩液在4℃下保存；

e)冷冻干燥：将浓缩液冷冻干燥，制得单环刺螠体壁酶解产物；

f)分离纯化：将单环刺螠体壁酶解产物依次采用凝胶色谱柱层析法和高效液相色谱法分离纯化得到单环刺螠生物活性肽；

其中，步骤f分离纯化具体为：

一、凝胶色谱柱层析：取单环刺螠体壁酶解产物用蒸馏水溶解成100mg/ml溶液，采用sephadexg-15凝胶色谱柱2.0cm×100cm进行分离纯化，自动部分收集器收集，每管收集3ml，280nm测定吸光度，收集各峰，冻干备用，制得酶解层析产物；凝胶色谱柱层析时，流动相为蒸馏水，洗脱速度为0.5ml/min；

二、高效液相色谱法分离纯化：将酶解层析产物用高效液相色谱分离纯化，色谱条件如下：色谱柱为反相c18键合硅胶柱；流动相：水，乙腈；检测波长为254nm和280nm，收集主要色谱峰，冻干得到单环刺螠生物活性肽；流速为1.0ml/min，柱温为30℃；

其中，高效液相色谱法分离时的条件如下：

0min：水100％，乙腈0％；

4min：水100％，乙腈0％；

16min：水70％，乙腈30％；

17min：水0％，乙腈100％；

35min：水0％，乙腈100％。

实施例3

一种单环刺螠生物活性肽，其氨基酸序列为thr-arg-gly-pro-pro。

一种单环刺螠生物活性肽的制备方法，包括以下步骤：

a)剪碎脱脂：将单环刺螠体壁剪碎，并用丙酮脱脂处理，脱脂后离心除去上清液，干燥后制得单环刺螠体壁粉；

b)粗品制备：将单环刺螠体壁粉与水混合使单环刺螠体壁粉的质量浓度为0.06g/ml，然后在85℃中加热4小时，接着离心取上清液，制得粗品；

b)初次酶解：按每1g粗品添加5.5ml水的配比，将粗品与水混合，然后调节ph值至7.0，在向其中加入3wt％的木瓜蛋白酶并在65℃下加热4小时，接着在100℃下加热15分钟灭酶，最后在4500rpm下离心20分钟，取上清液为初次酶解液；

c)再次酶解：向初次酶解液中加入0.55wt％的胰蛋白酶，在ph为10.5温度为60℃下加热4小时，接着接着在100℃下加热15分钟灭酶，最后在4500rpm下离心20分钟，取上清液为再次酶解液；

d)减压浓缩：将再次酶解液浓缩至原体积的1/20，接着使用95vol％乙醇沉淀，使乙醇浓度为80vol％，制得浓缩液，将浓缩液在4℃下保存；

e)冷冻干燥：将浓缩液冷冻干燥，制得单环刺螠体壁酶解产物；

f)分离纯化：将单环刺螠体壁酶解产物依次采用凝胶色谱柱层析法和高效液相色谱法分离纯化得到单环刺螠生物活性肽；

其中，步骤f分离纯化具体为：

一、凝胶色谱柱层析：取单环刺螠体壁酶解产物用蒸馏水溶解成100mg/ml溶液，采用sephadexg-15凝胶色谱柱2.0cm×100cm进行分离纯化，自动部分收集器收集，每管收集3ml，280nm测定吸光度，收集各峰，冻干备用，制得酶解层析产物；凝胶色谱柱层析时，流动相为蒸馏水，洗脱速度为0.5ml/min；

二、高效液相色谱法分离纯化：将酶解层析产物用高效液相色谱分离纯化，色谱条件如下：色谱柱为反相c18键合硅胶柱；流动相：水，乙腈；检测波长为254nm和280nm，收集主要色谱峰，冻干得到单环刺螠生物活性肽；流速为1.0ml/min，柱温为30℃；

其中，高效液相色谱法分离时的条件如下：

0min：水100％，乙腈0％；

4min：水100％，乙腈0％；

16min：水70％，乙腈30％；

17min：水0％，乙腈100％；

35min：水0％，乙腈100％。

相关测试：

1.序列测定：

利用氨基酸序列分析仪及质谱仪，对收集所得的组分进行氨基酸序列分析。

2.ace抑制活性的测定：

将cushman-cheung(1971)方法略作修改。原理是37℃、ph8.3条件下，ace催化水解血管紧张素ii(angii)模拟物马尿酰组氨酰亮氨酸(hhl)产生马尿酸(hip)，它在紫外228nm处具有特征吸收峰，通过生成物hip的变化计算ace抑制率。具体操作如下：用1.5ml离心管，空白对照组加入100μl5mmol/lhhl，用硼酸缓冲液(ph8.3)补足至120μl，37℃恒温水浴保温5min，加入5μl0.1u/mlace启动反应；样品组加入100μl5mmol/lhhl和20μl水解液后，37℃恒温水浴保温5min，加入5μl0.1u/mlace启动反应。之后两组均37℃恒温保持30min后，加入1mol/lhcl200μl中止反应，补加175μl硼酸缓冲液。用高效液相色谱法测定hip含量。对应的峰面积分别为s对照和s样品。

ace抑制率(％)＝(s对照－s样品)/s对照×100

商业用途的大鼠动脉血管平滑肌细胞(vsmc)，a7r5a7r5细胞在48孔组织培养板上dmem的培养基10％的胎儿牛血清(fbs)，孵化过夜。更换培养基，细胞中加入多肽4h，然后加入血管紧张素ii，继续孵化20h，细胞清洗并放置在新鲜的培养基(dmem含有1％的fbs)并添加1％的溴脱氧尿苷(brdu)。然后将这些细胞固定在70％乙醇(20分钟)，用1n盐酸(hcl)处理暴露抗原(20分钟)，用0.1％的triton-x-100的磷酸盐盐水进行细胞渗透(5分钟)。在磷酸盐缓冲液和1％的牛血清白蛋白被封闭(60分钟)。在4℃添加针对brdu的小鼠单克隆抗体，在添加主要抗体之前的所有步骤都是在室温下进行。添加抗体后隔夜后孵化添加二抗后在黑暗中孵化30分钟。细胞核被赫斯特33342染色。细胞被可视化奥林巴斯ix81荧光显微镜所有图像都在100倍放大。

测试结果：

1.序列测定结果：

如图1～3所示，本发明分离得到的1个新的生物活性肽thrargglypropro；

2.ace抑制活性的测定结果：

本发明分离得到单环刺螠生物活性肽，具有较好的ace抑制活性，其ic50为119.0±3.5mg/l。并且该五肽还能够抑制angii诱导的血管内皮细胞的增殖，如图4所示。

应当理解的是，对于本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

序列表

<110>浙江省海洋水产研究所

<120>一种单环刺螠生物活性肽及其制备方法

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>5

<212>prt

<213>单环刺螠(urechisunicinctus)

<400>1

thrargglypropro

15