本发明属于生命科学领域，具体涉及一种将外源性哺乳动物胞浆蛋白高效定位于细胞核内的方法及其应用。
背景技术：
蛋白质在细胞中的定位对于蛋白发挥其功能具有重要意义，一旦发生错误的定位，将会对正常细胞的活动产生不可逆的恶果，例如发育的缺陷和肿瘤的产生。一些蛋白由于含有核定位序列信号(nuclearlocalizationsignal，nls)，通过与核输入蛋白importin结合，继而发生一系列反应，进入到细胞核内发挥其相应的功能，如转录促进因子和转录抑制因子。但是仍然有很多并不具有nls的蛋白能够定位于细胞核内，可能依赖的其他途径，如分子伴侣等。因此，研究蛋白质在细胞核中的定位及其定位后发挥的功能至关重要。将外源性细胞浆定位的蛋白人工定位于细胞核中，现有的方法是利用分子克隆的手段导入核定位序列信号nls。然而，目前只能一次导入1-2条核定位序列信号，不能满足同时导入多条，因此，量效关系无法获得，导致后期实验结果的不准确。在质粒构建时一般采取的是双酶切的方法，现有的技术在质粒构建时，一般采用的是双酶切的方法，是将nls两端设计双酶切位点，同时在载体上进行双酶切，一次只能插入一段nls，既不方便也达不到插入多条的要求。或者在体外直接合成一条或者多条nls，但是这种方法一般最多合成两条即54个碱基，太长了会增加成本。
本发明方法中nls在与表达载体进行连接的时候，小片段的nls可以利用单酶(sali)进行酶切所导致的粘性末端进行自连，且连接的数量随机不等，之后再与酶切过的载体粘性末端进行连接，故而产生数量不等的nls载体。因此本发明方法可以一次性插入多条nls，也可以达到同时获得插入1～n条nls的多种质粒载体(n为1～5)。
技术实现要素：
本发明的目的是为克服上述现有技术的不足，提供一种将外源性哺乳动物胞浆蛋白高效定位于细胞核内的方法及其应用。以期实现通过一次性构建带有1～5个核定位序列信号(nls)的胞浆蛋白，转染这种质粒到sufu基因敲除的小鼠成纤维细胞(sufu-/-mefs)中，研究这种胞浆蛋白在胞浆/胞核的定位与其在细胞中的生物学活性和功能的量效关系。
为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：
一种将外源性哺乳动物胞浆蛋白高效定位于细胞核内的方法，包括以下步骤：
(1)构建prk5-sufu-gfp表达载体：在prk5载体(图1)的多克隆位点sali和hindiii之间插入绿色荧光蛋白gfp，即成为prk5-gfp表达载体，再在clai和sali之间插入一个胞浆蛋白sufu的cdna序列，即构建为prk5-sufu-gfp表达载体；
(2)外源性合成带有粘性末端的双链核定位序列信号(nls)：使用来自大t抗原的核定位序列信号肽pkkkrkv，首先合成带有单酶切位点sali(gtcgac)的两条单链nls序列，利用退火将两条单链合成为一条双链，即得到带有粘性末端的双链核定位序列信号；
(3)构建插入nls数量不等的核定位载体(prk5-sufu-nnls-gfp，简写为snng)：利用分子克隆技术，将nls序列连接至prk5-sufu-gfp的sufu和gfp中间的sali酶切位点处，利用sali单酶将prk5-sufu-gfp表达载体进行酶切，再利用连接酶将nls连接到载体内，之后进行转化、涂板，第二天长出单克隆之后进行菌落pcr，跑page胶，观察插入片段大小，插入片段比阴性对照多27n个碱基(27为一个nls的碱基数，n≥1，n为整数)，挑出所有阳性克隆，进行测序，即得到插入nls数量不等的核定位载体(prk5-sufu-nnls-gfp，简写为snng)；
(4)观察胞浆蛋白核定位情况：将核定位载体prk5-sufu-nnls-gfp转染至sufu基因敲除的小鼠成纤维(sufu-/-mefs)细胞内，使用dapi染细胞核，之后利用荧光显微镜观察核定位载体prk5-sufu-nnls-gfp在细胞中的定位情况，并进行统计分析。
上述核定位载体prk5-sufu-nnls-gfp的应用，包括：
(1)核定位载体prk5-sufu-nnls-gfp在将外源性哺乳动物胞浆蛋白高效定位于细胞核内的应用；
(2)利用荧光素酶报告基因系统检测载体prk5-sufu-nnls-gfp对gli1转录活性的调控；
(3)利用荧光定量pcr方法检测载体prk5-sufu-nnls-gfp对hedgehog信号通路下游靶基因gli1和ptch1的mrna表达水平影响，获得插入数量不等的nls的prk5-sufu-gfp对hedgehog信号通路活性调节的量效关系。
优选的，步骤(2)所述nls的序列为：
正向：5-“gtcgacccgaagaagaagcgtaaggtc”-3，如seqidno.1所示；
反向：5-“cagctggaccttacgcttcttcttcgg”-3，如seqidno.2所示。
本发明的有益效果：
本发明方法中nls在与表达载体进行连接的时候，小片段的nls可以利用单酶(sali)切所导致的粘性末端进行自连，且连接的数量随机不等，之后再与酶切过的载体的粘性末端进行连接，故而产生数量不等的nls载体。因此本发明方法可以一次性插入多条nls，达到同时获得插入1～5条nls的多种质粒载体。
本发明方法可以实现通过一次性构建带有1～5个核定位序列信号(nls)的胞浆蛋白，转染这种质粒到小鼠成纤维细胞(mefs)中，研究这种胞浆蛋白在胞浆/胞核的定位与其在细胞中的生物学活性和功能的量效关系。
附图说明
图1是prk5质粒载体图谱；
图2a为nls插入数量不等的sufu-gfp载体基因片段示意图；
图2b为nls插入数量不等的sufu-gfp(即snng)在sufu基因敲除的小鼠成纤维细胞系(sufu-/-mefs)中的定位情况；
图3a是s5ng对hedgehog信号通路下游靶基因gli1mrna表达的影响；
图3b是s5ng对hedgehog信号通路下游靶基因ptch1mrna表达的影响；
图4是不同质粒对蛋白gli1转录活性的影响。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明进行进一步的阐述，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。
以下实施例所使用的仪器设备为：chemidocxrs凝胶成像系统(bio-rad公司，美国)；7500型荧光定量pcr仪(appliedbiosystems公司，美国)；ix-71型荧光倒置显微镜(olympus公司，日本)；伯乐垂直电泳系统(bio-rad公司，美国)smartspecplus核酸蛋白测定仪(bio-rad公司，美国)；其他未列出的设备为常用设备。
以下实施例所使用的细胞及试剂为：小鼠成纤维细胞系(mefs)和prk5-sufu-gfp质粒由南京医科大学程雁教授实验室馈赠；dmem细胞培养基(invitrogenlifetechnologies公司，美国)和小牛血清购自gibco公司；nls序列和菌落pcr序列合成由金思瑞(南京，中国)完成；sali限制性内切酶购置于newenglandbiolabs公司(美国)；dnat4连接酶、rna逆转录试剂盒和荧光定量pcr反应mix购置于大连宝生物公司(中国)；dapi核染料剂购置于sigma公司(美国)；pcr反应taq酶mix、割胶回收、质粒小提试剂盒和dh5α感受态细菌购置于天根公司(中国)。
实施例1：
一种将外源性哺乳动物胞浆蛋白高效定位于细胞核内的方法步骤如下：
(1)将合成的单链nls序列，正向：5-“gtcgacccgaagaagaagcgtaaggtc”-3，seqidno.1所示；反向：5-“cagctggaccttacgcttcttcttcgg”-3，seqidno.2所示；利用退火合成双链dna，反应体系如下：
10x退火缓冲液2ul(100mmtris-hcl(ph＝7.5)，10mmedta，1mnacl)
oligonucleotide1终浓度100nm
oligonucleotide2终浓度100nm
核酸酶-free水补齐到20ul
反应条件：95℃：5分钟，70℃：10分钟，逐渐冷却到室温。
(2)同时将利用sali酶将prk5-sufu-gfp进行单酶切，反应体系如下：
prk5-sufu-gfp2ug
10xnebcutsmartbuffer5ul
sali酶1ul
ddh2o补齐到50ul
反应条件：37℃，30min。
(3)将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，后割胶回收，电泳条件为140v30min，割胶回收步骤参考试剂盒内。
(4)将割胶回收产物同nls双链dna进行连接，得到连接产物，反应体系如下：
回收产物5ul
nls双链3ul
t4连接酶1ul
10xt4连接酶buffer1ul
反应条件为16℃，过夜。
(5)第二天将连接产物进行转化，后涂板过夜。
(6)待16小时长出单克隆之后，设计插入的酶切位点sali两端的正反向引物(正向“caaacttcccaaagagtacagc”，如果seqidno.3所示；反“cgcccttgctcaccatca”，如果seqidno.4所示；)，利用普通pcr进行扩增，阴性长度为107bp，之后利用page胶，跑垂直电泳(只有page胶可以分辨出来，普通的琼脂糖分辨率较低)，条件为1xtbe缓冲液，恒压140v，40min，染胶观察片段大小与阴性结果进行比较。
15ml的8％page胶配方如下：
(7)挑出阳性克隆，即含有nls序列的阳性克隆至lb培养基中摇菌过夜，第二天小提质粒(snng)，测序。
(8)将提取的阳性质粒和对照质粒转染至小鼠成纤维细胞(mefs)中(细胞种于爬片内)，第二天固定细胞，用dapi染核，荧光显微镜观察sufu蛋白入核的情况(图2)。
图2a为nls插入数量不等的sufu-gfp载体基因片段示意图；图2b为nls插入数量不等的sufu-gfp(即snng)在sufu基因敲除的小鼠成纤维细胞系(sufu-/-mefs)中的定位情况；图2b中，竖列图组ⅰ为绿色，为插入不同数量nls的sufu-gfp-融合蛋白；竖列图组ⅱ为蓝色，为染dapi的细胞核；竖列图组ⅲ是ⅰ和ⅱ两者的合并图。
由图2b可以看出，未插入任何nls的野生型sufu-gfp(即对照质粒)全部在细胞浆中表达；插入一条nls的prk5-sufu-gfp，即s1ng在细胞浆中表达多于在细胞核内；插入三条nls的prk5-sufu-gfp，，即s3ng在细胞浆中表达少于在细胞核内；插入五条nls的prk5-sufu-gfp，即s5ng全部在细胞核中表达。
由上述可以得出，在sufu被敲除的成纤维细胞中，随着nls插入数量的增加，snng在细胞核中的定位也相应增加，即nls插入数量的增加可以使外源性哺乳动物胞浆蛋白sufu成功高效定位在细胞核中。
实施例2：
将对照质粒和阳性质粒转染至sufu基因敲除的mefs中，24小时后收细胞提取rna，进行荧光定量pcr实验，检测s5ng对hedgehog信号通路下游靶基因ptch1和gli1的表达差异(图3a和图3b)。
实施例3：
将对照质粒和阳性质粒转染至sufu基因敲除的mefs中，同时转染8xgli转录因子结合位点的荧光素酶报告基因和海参基因质粒，48小时后，利用报告基因检测系统检测，得到不同的质粒对gli1蛋白转录调控的影响(图4)。
sufu作为hedgehog信号通路中间调节因子，调控转录因子gli1的转录活性，sufu的定位必将影响其对gli蛋白的转录活性的调节。因此，利用荧光素酶报告基因系统检测这些插入不同数量nls的sufu-gfp质粒对gli1转录活性的调控；同时利用荧光定量pcr的方法检测插入数量不等nls的sufu-gfp对hedgehog信号通路下游靶基因gli1和ptch1的mrna表达水平影响，获得插入数量不等nls的sufu-gfp与hedgehog信号通路活性调节的量效关系。
实施例1可得到插入不同数量的nls，并研究了对胞浆蛋白sufu的活性及功能的影响，实施例2和实施例3均为插入5个nls序列后的sufu基因对hedgehog信号通路的影响，可用来研究插入数量不等nls的sufu-gfp与hedgehog信号通路活性调节的量效关系的基础。此发明只是把焦点放在了入核的定位信号，今后还可以将关注点放在其他细胞器的定位信号，如出核等信号上。
上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。
序列表
<110>江西省妇幼保健院
<120>一种将外源性哺乳动物胞浆蛋白高效定位于细胞核内的方法建立及其应用
<130>2017
<160>4
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>27
<212>dna
<213>人工序列()
<400>1
gtcgacccgaagaagaagcgtaaggtc27
<210>2
<211>27
<212>dna
<213>人工序列()
<400>2
cagctggaccttacgcttcttcttcgg27
<210>3
<211>22
<212>dna
<213>人工序列()
<400>3
caaacttcccaaagagtacagc22
<210>4
<211>18
<212>dna
<213>人工序列()
<400>4
cgcccttgctcaccatca18