本发明属于检测试剂盒技术领域，具体涉及一种用于检测鸡玫瑰冠位点基因的引物、试剂盒及检测方法。
背景技术：
鸡冠亦称肉冠。鸡等一部分鸟类的头部背侧的肉质隆起，缺乏羽毛，不同品种有不同冠形，冠形为品种特征之一，包括单冠、玫瑰冠、豆冠、肉垫冠、草莓冠、杯状冠、羽毛冠等7种，冠的颜色大多为红色，色泽鲜艳、细致、丰满、滋润是健康的征状。
育种生产中，由于玫瑰冠杂合子个体的存在，导致玫瑰冠品种纯繁时出现单冠个体。常规的方法是每一代淘汰单冠个体，逐代降低群体中单冠相关等位基因的频率。另外一种方法是通过测交的手段，剔除玫瑰冠杂合子。上述第一种方法进展缓慢，而测交的方法步骤繁琐，工作量大且容易出错，测交的周期也比较长。
玫瑰冠表型相对于单冠表型是一种单位点控制的显性性状，因而在保种和育种的过程中，根据表型无法准确区分显性纯合子和杂合子个体，造成选育效率低下。利用分子遗传学新技术，找到影响玫瑰冠性状的分子标记，通过标记辅助选择，可以迅速准确地鉴定候选个体的基因型，从根本上解决这一性状选育的难题。
技术实现要素：
本发明主要提供了一种用于检测鸡玫瑰冠位点基因的引物、试剂盒及检测方法，由于引物可以检测与玫瑰冠相关的等位基因的基因型，因此可以做到100％的准确。其技术方案如下：
一种用于检测鸡玫瑰冠位点基因的引物，包括引物p1、p2和p3，各引物序列如下：
引物p1：5’-ctccggcccgcatcctcctg-3’，如序列seqidno：1所示；
引物p2：5’-gctctgggacgcaaatgtttctg-3’，如序列seqidno：2所示；
引物p3：5’-agccgtcgtagtgcgcgttca-3’，如序列seqidno：3所示。
一种用于检测鸡玫瑰冠性状的分子标记，其核苷酸序列如seqidno：4和/或seqidno：5所示。
一种检测鸡玫瑰冠性状的试剂盒，包括引物p1、p2和p3。
优选的，所述试剂盒还包括pcrmix、双蒸水和dna模板。
一种鸡玫瑰冠性状的检测方法，包括以下步骤：
(1)抽取被检测个体的血样dna；
(2)以待测鸡的基因组dna为模板，采用权利要求1中的引物p1、p2和p3进行pcr扩增反应；
(3)扩增得到的pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据电泳结果鉴定玫瑰冠等位基因的基因型。
优选的，步骤(2)中pcr扩增反应程序为：94℃变性3min；94℃30s，68℃30s，72℃1min，32次循环；72℃延伸10min，得到pcr扩增产物。
优选的，步骤(3)中电泳结果判断方法为，根据电泳图谱中条带的大小进行判定，rr基因型表现为187bp条带，rr基因型表现为493bp条带和187bp条带，rr基因型表现为493bp条带。
引物p1、p2和p3或分子标记可以在鸡育种中进行应用。
采用上述方案，本发明具有以下优点：
(1)表型是由基因型决定的，本发明是针对决定玫瑰冠的基因进行直接选择，因此经过选择后的玫瑰冠个体全部为玫瑰冠纯合子个体，因此可保证后代不再出现单冠个体，可以做到100％的准确检测；
(2)本案的分子标记位点是决定玫瑰冠性状的致因突变，虽然现有技术中也有关于其他位点检测的报道，比如有根据ccdc108基因内含子3中的扩增片段长度多态性，但其采用的是与本案中的致因突变连锁的位点，不能达到准确率100％的检测目的；
(3)引物设计巧妙性。本案利用致因突变(倒位)的特点，巧妙的设计了三条引物，其中p1为通用的上游引物，p2在野生型状态下为下游引物、p3为上游引物，野生型状态下只有p2可以与p1配对产生扩增产物；突变状态下p2为上游引物而p3为下游引物，突变状态下只有p3可以与p1配对产生扩增产物。该方案只需要三条引物即可达到对玫瑰冠分型的目的。而有的方案设计了四条引物，虽然也能够检测突变位点，但是由于引物多，容易形成二聚体以及非特异性条带，因此导致目的条带扩增效率低，成功率也较低，对pcr扩增所需要的酶、体系以及扩增条件要求比较严格。
(4)本案从拿到待检个体血样到决定被检个体的选淘只需要2天时间，每人每天至少可以完成144个个体的检测，检测周期短，速度快。
附图说明
图1为各样本pcr电泳结果图，其中1、2、3、4为rr基因型的玫瑰冠杂合子个体，5、7、8、10、11为rr基因型的玫瑰冠纯合子个体，6、9为rr基因型的单冠个体。
具体实施方式
以下实施例中的实验方法如无特殊规定，均为常规方法，所涉及的实验试剂及材料如无特殊规定均为常规生化试剂和材料。
鸡玫瑰冠性状的检测过程如下：
(1)样品采集
采集江苏兴牧农业科技有限公司的玫瑰冠丝羽乌骨鸡11只，翅静脉采集血样0.3ml，置于装有70μl抗凝剂的离心管中，保存于-20℃冰箱备用。
(2)基因组dna提取
用omga的血液dna提取试剂盒(购自广州飞扬生物工程有限公司)对样本dna进行抽提，具体步骤参照说明书；
(3)pcr扩增
1)引物信息
p1：5’-ctccggcccgcatcctcctg-3’，如序列seqidno：1所示，
p2：5’-gctctgggacgcaaatgtttctg-3’，如序列seqidno：2所示
p3：5’-agccgtcgtagtgcgcgttca-3’，如序列seqidno：3所示
2)pcr扩增体系
扩增体系：2×pcrsupermix(购自北京全式金生物技术有限公司)，5μl，双蒸水3.68μl，1μl的dna模板，p1引物0.1μl，p2引物0.12μl，p3引物0.1μl；
3)pcr扩增反应程序
94℃变性3min；94℃30s，68℃30s，72℃1min，32次循环；72℃延伸10min，得到pcr扩增产物；
(4)琼脂糖凝胶电泳
抽取10μlpcr产物，1.5％的琼脂糖凝胶电泳(电压：120v，电泳时间15min)，凝胶成像系统检测，电泳图谱参见图1；
(5)结果判定
根据电泳图谱中条带的大小判定：若只有493bp条带则为单冠(基因型标记为rr)，其为seqidno：5所示的纯合体；若有493bp和187bp的片段，则为玫瑰冠杂合子(基因型标记为rr)，其为seqidno：4和seqidno：5所示的杂合体；若只有187bp条带则为玫瑰冠纯合子(基因型标记为rr)，其为seqidno：4所示的纯合体。测交结果以及检测结果见表1。
表1玫瑰冠基因型分子检测结果
由表1可知分子检测结果与测交结果完全一致。说明了该方法可靠性，检测精准度高。
对本领域的技术人员来说，可根据以上描述的技术方案以及构思，做出其它各种相应的改变以及形变，而所有的这些改变以及形变都应该属于本发明权利要求的保护范围之内。
sequencelisting
<110>江苏立华牧业股份有限公司
<120>一种用于检测鸡玫瑰冠位点基因的引物、试剂盒及检测方法
<130>1
<160>5
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<213>人工序列
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