植物发育相关蛋白GhWRKY42及其编码基因和应用的制作方法

本发明涉及一种植物发育相关蛋白ghwrky42及其编码基因和应用。
背景技术：
：衰老是一种自然现象，广泛存在于多种生物当中。在植物中，衰老可以划分为三个主要的阶段：衰老的起始阶段(发生于成熟的叶片中)，衰老的扩展阶段(发生于衰老的叶片)以及终端衰老的细胞死亡阶段(发生于死亡的叶片)。在衰老过程中，遗传和环境因素作用于成熟的叶片，引起衰老的起始，造成叶绿素、细胞膜、细胞核以及蛋白质的降解和营养物质的重新分配。棉花是中国重要的经济作物和纺织原料，对中国国民经济的发展具有无可替代的作用。我国粮棉争地的矛盾突出，短季棉品种的选育和推广，可以缓解粮棉争地的矛盾。短季棉是一种生育期较短的棉花生态型品种，可以在特定的生态条件下适应一定的社会和经济水平，但短季棉早熟往往伴随着早衰。在棉花生产中，棉花早衰现象的发生，造成铃重减轻、衣分下降、纤维强度和成熟度下降，使棉花减产降质。技术实现要素：本发明的目的是提供一种植物发育相关蛋白ghwrky42及其编码基因和应用。本发明提供的蛋白质，获自陆地棉(gossypiumhirsutumlinn.)，命名为ghwrky42蛋白，是如下(a)或(b)或(c)：(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物株高相关的由序列1衍生的蛋白质；(c)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物早衰相关的由序列1衍生的蛋白质。为了使(b)或(c)中的蛋白质便于纯化和检测，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。表1标签的序列标签残基序列poly-arg5-6(通常为5个)rrrrrpoly-his2-10(通常为6个)hhhhhhflag8dykddddkstrep-tagii8wshpqfekc-myc10eqkliseedl上述(b)或(c)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(b)中的蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列2或序列3所示的dna序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。ghwrky42蛋白的编码基因，命名为ghwrky42基因，也属于本发明的保护范围。ghwrky42基因具体为如下(1)至(6)中任一所述的dna分子：(1)编码区如序列表中序列2所示的dna分子；(2)序列表中序列3所示的dna分子；(3)在严格条件下与(1)或(2)限定的dna序列杂交且编码植物株高相关蛋白的dna分子；(4)来源于棉花的与(1)或(2)限定的dna序列具有95％以上同源性且编码植物株高相关蛋白的dna分子；(5)在严格条件下与(1)或(2)限定的dna序列杂交且编码植物早衰相关蛋白的dna分子；(6)来源于棉花的与(1)或(2)限定的dna序列具有95％以上同源性且编码植物早衰相关蛋白的dna分子。上述严格条件可为用0.1×sspe(或0.1×ssc)，0.1％sds的溶液，在dna或者rna杂交实验中65℃下杂交并洗膜。含有ghwrky42基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。可用现有的表达载体构建含有ghwrky42基因的重组表达载体。所述表达载体包括双元农杆菌载体和可用于微弹轰击的载体等。使用ghwrky42基因构建重组表达载体时，可在其转录起始核苷酸前加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用ghwrky42基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是atg起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物或转基因微生物进行鉴定及筛选，可对所用表达载体进行加工，如加入在植物或微生物中表达可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。从转基因安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以表型筛选转化植物或微生物。所述重组表达载体具体可为：在pbi121载体的xbai和saci酶切位点之间插入ghwrky42基因得到的重组质粒pbi121-ghwrky42。本发明还保护一种制备转基因植物的方法，包括如下步骤：抑制出发植物中ghwrky42基因的表达，得到转基因植物；所述转基因植物的株高低于所述出发植物。抑制出发植物中ghwrky42基因的表达的实现方法具体如下：将重组质粒pclcrva-ghwrky42和pclcrvb质粒共同导入出发植物。重组质粒pclcrva-ghwrky42为将序列表的序列2自5’末端第53-373位核苷酸插入pclcrva质粒的spei和asci酶切位点之间得到的重组质粒。所述出发植物为单子叶植物或双子叶植物。所述出发植物具体可为棉花或拟南芥。本发明还保护一种植物育种的方法，包括如下步骤：降低目的植物中ghwrky42蛋白的含量和/或活性，从而降低目的植物的株高。所述目的植物为单子叶植物或双子叶植物。所述目的植物具体可为棉花或拟南芥。本发明还保护一种制备转基因植物的方法，包括如下步骤：在出发植物中导入ghwrky42基因，得到转基因植物；所述转基因植物的衰老早于所述出发植物。所述出发植物为单子叶植物或双子叶植物。所述出发植物具体可为棉花或拟南芥。所述ghwrky42基因具体可通过重组质粒pbi121-ghwrky42导入出发植物。所述出发植物为单子叶植物或双子叶植物。所述出发植物具体可为棉花或拟南芥。本发明还保护ghwrky42蛋白的应用，为如下(d1)至(d4)中的至少一种：(d1)调控植物的株高；(d2)增加植株的株高；(d3)调控植物的衰老；(d4)促使植物早衰。所述植物为单子叶植物或双子叶植物。所述植物具体可为棉花或拟南芥。本发明还保护用于抑制ghwrky42基因表达的物质的应用，为如下(d5)至(d6)中的至少一种：(d5)降低植物的株高；(d6)抑制植物衰老。所述植物为单子叶植物或双子叶植物。所述植物具体可为棉花或拟南芥。抑制出发植物中ghwrky42基因的表达的物质具体如下：重组质粒pclcrva-ghwrky42和pclcrvb质粒。重组质粒pclcrva-ghwrky42为将序列表的序列2自5’末端第53-373位核苷酸插入pclcrva质粒的spei和asci酶切位点之间得到的重组质粒。本发明还保护ghwrky42蛋白、ghwrky42基因、所述重组表达载体或以上任一所述方法，在植物育种中的应用。所述植物为单子叶植物或双子叶植物。所述植物具体可为棉花或拟南芥。所述育种的目标为获得株高降低的植物。所述育种的目标为获得不早衰的植物。所述育种的目标为获得株高增高的植物。所述育种的目标为获得早衰的植物。本发明的发明人从叶片衰老的表达谱中筛选到一个的衰老相关的ghwrky42基因，从荧光定量结果表明该基因与衰老相关。在拟南芥中过表达ghwrky42基因，促使拟南芥衰老提前。沉默棉花内源ghwrky42基因，促使棉花株高降低。本发明对于培育株高降低的植物以及培育抑制早衰的植物具有突出的应用价值，将对植物育种产生重大影响。附图说明图1为实施例1的步骤一的结果。图2为实施例1的步骤二的结果。图3为实施例1的步骤三的结果。图4为实施例2的步骤四的结果。图5为实施例2的步骤五的结果。图6为实施例2中衰老叶片数量占叶片总数量的比例以及叶片的叶绿素含量。图7为实施例3的步骤7的结果。图8为实施例3的步骤8的结果。图9为实施例3的步骤9的结果。具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。中棉所10号、中棉所74号和辽4086均为棉花品种。中棉所10号和中棉所74号为短季棉品种，具有显著的早衰现象。辽4086为短季棉品种，不具有早衰现象。经过大量序列分析和功能验证，从棉花中发现一个新蛋白，如序列表的序列1所示，将其命名为ghwrky42蛋白(由345个氨基酸残基组成)。ghwrky42蛋白的等电点为9.38，相对分子量为37.88kda。将编码ghwrky42蛋白的基因命名为ghwrky42基因，cdna中的开放阅读框如序列表的序列2所示(1038bp)，基因组dna中的序列如序列表的序列3所示(1193bp,包含3个外显子，2个内含子；第753-831位核苷酸和第959-1034位核苷酸为内含子)。pbi121载体：北京华越洋生物，产品目录号dwf9808。根癌农杆菌lba4404：北京华越洋生物，产品目录号wr5221-10。pclcrva质粒、pclcrvb质粒(辅助质粒)和pclcrva-pds质粒(阳性对照质粒)，均记载于参考文献：z.gu,c.huang,f.li,etal.,aversatilesystemforfunctionalanalysisofgenesandmicrornasincotton,plantbiotechnol.j.12(2014)638-649.doi:10.1111/pbi.12169.。实施例1、ghwrky42基因的表达情况分析一、组织表达分析1、分别提取中棉所10号各个组织的总rna并反转录为cdna。各个组织分别如下：出苗10天的根，出苗10天的茎，盛花期的叶片，盛花期的雄蕊，盛花期的雌蕊，盛花期的花瓣，开花十天后的纤维，开花十天后的胚珠。2、以步骤1得到的cdna为模板，以ghactin基因为内参基因，通过荧光定量pcr检测ghwrky42基因的相对表达水平。用于检测ghwrky42基因的引物如下：上游引物：5’-ttttatgacggtgaaaacagggg-3’；下游引物：5’-acgatgaacatggctgcttactatc-3’。用于检测ghactin基因的引物如下：上游引物：5’-atcctccgtcttgaccttg-3’；下游引物：5’-tgtccgtcaggcaactcat-3’。结果见图1。ghwrky42基因主要在根、茎、叶中表达(其中在茎中的表达量最高，其次是根和叶片)，在生殖器官中的表达量都相对较低。二、发育阶段表达分析1、取中棉所74号的五个不同发育阶段的真叶，分别提取总rna并反转录为cdna。阶段1：新展平的叶片(没有衰老)；阶段2:成熟的叶片(没有衰老)；阶段3：衰老早期的叶片(<25％衰老黄化面积)；阶段4：衰老中期的叶片(大约50％衰老黄化面积)；阶段5：衰老后期的叶片(>75％衰老黄化面积)。2、以步骤1得到的cdna为模板，以ghactin基因为内参基因，通过荧光定量pcr检测ghwrky42基因的相对表达水平。引物序列同步骤一的2。结果见图2。随着叶片的衰老，ghwrky42基因的表达量逐渐的升高。三、品种差异性1、将中棉所10号和辽4086分别种植于温室，从子叶展平期开始每周取样一次子叶，直到子叶完全衰老黄化为止。实际操作中，从子叶展平期开始计时，分别于第1周至第8周，每周取样。2、分别取步骤1得到的各个叶片，提取总rna并反转录为cdna。3、以步骤2得到的cdna为模板，以ghactin基因为内参基因，通过荧光定量pcr检测ghwrky42基因的相对表达水平。引物序列同步骤一的2。结果见图3。ghwrky42基因显示出较强的品种特异性，在中棉所10号中的表达量显著高于在辽4086中，并且随着叶片的衰老进程表达量逐渐升高。以上结果表明，ghwrky42蛋白参与了棉花叶片的衰老过程。实施例2、转基因拟南芥的制备和表型鉴定一、重组质粒的构建将序列表的序列2所示的dna分子插入pbi121载体的xbai和saci酶切位点之间，得到重组质粒pbi121-ghwrky42。二、转基因植物的获得1、将重组质粒pbi121-ghwrky42导入根癌农杆菌lba4404，得到重组农杆菌。2、采用步骤1得到的重组农杆菌，采用花序浸染法对哥伦比亚生态型拟南芥进行遗传转化，收获种子，即为t0代种子。t0代种子长成的植株即为t0代植株。t0代植株自交后收获的种子即为t1代种子。t1代种子长成的植株即为t1代植株。t1代植株自交后收获的种子即为t2代种子。t2代种子长成的植株即为t2代植株。t2代植株自交后收获的种子即为t3代种子。t3代种子长成的植株即为t3代植株。将t1代植株、t2代植株以及抽样的t3代植株进行pcr鉴定，具体方法为：提取植株的基因组dna并作为模板，采用f1和r1组成的引物对进行pcr扩增，如果得到约1.0kb的pcr扩增产物，鉴定结果为阳性。如果某一t2代植株及其抽样检测的t3代植株均pcr鉴定为阳性，该t3代植株及其自交后代为一个纯合的转基因株系。f1：5’-gacgcacaatcccactatcc-3’；r1：5’-ttacgaagattccaggatgaga-3’。随机取3个纯合的转基因株系(1﹟株系、2﹟株系和3﹟株系)进行后续鉴定。三、转空载体植物的获得用pbi121载体代替重组质粒pbi121-ghwrky42，参照步骤二，得到转空载体株系。四、ghwrky42基因表达水平的鉴定待测植株分别为：1﹟株系的t3代植株、2﹟株系的t3代植株、3﹟株系的t3代植株和哥伦比亚生态型拟南芥(wt)。每个株系对3个植株取样，结果取平均值。1、提取待测植株的总rna并反转录为cdna。2、以步骤1得到的cdna为模板，以actin2基因为内参基因，通过荧光定量pcr检测ghwrky42基因的相对表达水平。用于检测ghwrky42基因的引物如下：上游引物：5’-ttttatgacggtgaaaacagggg-3’；下游引物：5’-acgatgaacatggctgcttactatc-3’。用于检测actin2基因的引物如下：上游引物：5’-aagctctcctttgttgctgtt-3’；下游引物：5’-gacttctgggcatctgaatct-3’。结果见图4。五、表型鉴定待测种子分别为：1﹟株系的t3代种子、2﹟株系的t3代种子、3﹟株系的t3代种子、转空载体株系的t3代种子和哥伦比亚生态型拟南芥(又称野生型拟南芥，用wt表示)。所有待测种子进行平行操作。每个株系取20粒种子，进行三此重复，结果取平均值。1、将待测种子播种于1/2ms培养基平板上进行萌发和育苗。2、将步骤1中萌发14天后的幼苗移栽到营养土上进行培养，持续观察表型，分别于培养4周后、培养5周后、培养7周后拍照并统计衰老叶片数量占叶片总数量的比例并检测叶片的叶绿素含量。检测叶绿素含量的方法：shahst,pangcy,fansl,songmz,arains,yusx:isolationandexpressionprofilingofghnactranscriptionfactorgenesincotton(gossypiumhirsutuml.)duringleafsenescenceandinresponsetostresses.gene2013,531(2):220-234。照片见图5。与哥伦比亚生态型拟南芥相比，转基因拟南芥出现提前衰老的表型现象(莲座叶和植株均有表现)。培养4周后转基因拟南芥开始出现衰老的表型，培养7周后转基因拟南芥的莲座叶已经出现了严重衰老的现象、植株也表现出失绿和黄化干枯的表型。转空载体拟南芥和哥伦比亚生态型拟南芥的表型一致。培养4周后，衰老子叶数量占子叶总数量的百分比见图6a。生长四周的时候转基因拟南芥衰老子叶的比例极显著的高于哥伦比亚生态型拟南芥。转空载体拟南芥和哥伦比亚生态型拟南芥的数据统计结果无显著差异。培养5周后，衰老莲座叶数量占总莲座叶数量的百分比见图6b。生长到五周的时候转基因拟南芥衰老莲座叶的比例极其显著的高于哥伦比亚生态型拟南芥。转空载体拟南芥和哥伦比亚生态型拟南芥的数据统计结果无显著差异。培养7周后，全植株的莲座叶的叶绿素含量见图6c。生长到七周的时候转基因拟南芥的叶绿素含量极显著的低于哥伦比亚生态型拟南芥。转空载体拟南芥和哥伦比亚生态型拟南芥的数据统计结果无显著差异。上述结果表明，转基因拟南芥比野生型拟南芥的衰老提前。实施例3、转基因棉花的制备和表型鉴定1、将序列表的序列2自5’末端第53-373位核苷酸插入pclcrva质粒的spei和asci酶切位点之间，得到重组质粒pclcrva-ghwrky42。2、将重组质粒pclcrva-ghwrky42导入根癌农杆菌lba4404，得到重组农杆菌a。将pclcrvb质粒导入根癌农杆菌lba4404，得到重组农杆菌b。将pclcrva质粒导入根癌农杆菌lba4404，得到重组农杆菌v。将pclcrva-pds质粒导入根癌农杆菌lba4404，得到重组农杆菌p。3、将中棉所10号播种于育苗钵中，培养至子叶完全展平、真叶尚未出现时进行步骤5。培养条件：23-25℃，16小时光照/8小时黑暗。4、制备侵染液用渗透液重悬重组农杆菌a的菌体，得到od600nm＝1.5-2.0的菌液a。用渗透液重悬重组农杆菌b的菌体，得到od600nm＝1.5-2.0的菌液b。用渗透液重悬重组农杆菌v的菌体，得到od600nm＝1.5-2.0的菌液v。用渗透液重悬重组农杆菌p的菌体，得到od600nm＝1.5-2.0的菌液p。渗透液：含10mmmgcl2、10mmmes、200μm乙酰丁香酮，余量为水。菌液a与菌液b等体积混合，得到侵染液a-b。菌液v与菌液b等体积混合，得到侵染液v-b。菌液p与菌液b等体积混合，得到侵染液p-b。5、取步骤3得到的植株，用针头划伤子叶背面，然后无针注射器将侵染液注入(每植株有两片子叶，均注入侵染液，注满为止，平均每片子叶注入0.4ml左右)，黑暗培养12小时。侵染液为步骤4制备的侵染液a-b、侵染液v-b或侵染液p-b，每种侵染液对20株植株进行操作。注入侵染液a-b的为试验组，注入侵染液v-b的为阴性对照组，注入侵染液p-b的为阳性对照组。设置不进行注入的20株中棉所10号，为空白对照组。6、完成步骤5后，培养植株。培养条件：23℃、光照16小时(光强120μem-2s-1)/8小时黑暗。培养3-4周后，注射侵染液p-b的植株陆续均出现漂白的症状，证明试验结果可信。7、步骤6中培养8周后，取自上而下的倒数第2片真叶，提取总rna并反转录为cdna，以cdna为模板，以ghactin基因为内参基因，通过荧光定量pcr检测ghwrky42基因的相对表达水平。引物序列同实施例1的步骤一的2。结果见图7。与空白对照组相比，试验组植株的ghwrky42基因的表达水平呈现极显著的降低。与空白对照组相比，阴性对照组植株的ghwrky42基因的表达水平无显著变化。8、步骤6中培养8周后，拍照。结果见图8。与空白对照组相比，试验组植株显著矮化。与空白对照组相比，阴性对照组植株的株高无显著变化。9、步骤6中培养8周后，进行株高统计。结果见图9。与空白对照组相比，试验组植株的株高显著降低。与空白对照组相比，阴性对照组植株的株高无显著变化。sequencelisting<110>中国农业科学院棉花研究所<120>植物发育相关蛋白ghwrky42及其编码基因和应用<130>gncyx171951<160>3<170>patentinversion3.5<210>1<211>345<212>prt<213>gossypiumhirsutumlinn.<400>1metalavalgluleumetmetsercysargasnglyaspserpheala151015alalysmetglugluasnalavallysglualaalaserglyleuglu202530servalglulysleuileargleuleuserglnthrglnglnglngln354045glnthrasnserasnasnglnglulystyrglnalaserserileser505560thrthrserasnserleuaspleuglumetaspcyslysalagluala65707580aspalaalavalserargphelysargvalileserleuleuglyarg859095thrargthrglyhisalaargpheargargalaprovalglnproasp100105110glngluglngluthrlysvaltyrtyralathrproileglnglnile115120125proproprovalthrthralatyrproleupropropropropropro130135140proprohishishishisargaspphemetthrvallysthrglygly145150155160leugluargileaspserserlysthrileasnphesertyrserser165170175alaglyasnserpheleuserserleuthrglyaspthraspserlys180185190glnprocysserserserseralapheglnilethrasnphesergln195200205valserseralaglylysproproleuserserserserserphelys210215220arglyscysserseraspasnleuglyserglylyscysthrsergly225230235240serserglyargcyshiscysserlyslysarglysleuargserlys245250255argvalvalargvalproalaileserleulysmetalaaspilepro260265270proaspasptyrsertrparglystyrglyglnlysproilelysgly275280285serprohisproargglytyrtyrlyscysserservalargglycys290295300proalaarglyshisvalgluargalaleuaspaspprosermetleu305310315320valvalthrtyrgluglygluhisasnhisserleuservalalaglu325330335thrthrasnleuileleugluserser340345<210>2<211>1038<212>dna<213>gossypiumhirsutumlinn.<400>2atggccgttgaactcatgatgagttgcaggaacggtgacagcttcgcagccaaaatggaa60gaaaacgccgtcaaagaagccgcttccgggctcgaaagtgttgagaaactcatcagatta120ctttctcaaactcaacagcagcagcaaactaacagtaataatcaagagaaataccaagct180tcctctatctcaacaacatctaattccctggatttggaaatggactgcaaagctgaggct240gatgccgccgtttcaaggttcaagagagttatctctcttctgggtcgaaccaggaccgga300catgctcgtttcagacgagcccctgttcaacccgatcaagagcaagaaaccaaggtttat360tacgcaacaccgatccagcagattccgccaccagtgactactgcttatcctcttcctcct420cctcctcctcctcctcctcatcatcatcatcgtgattttatgacggtgaaaacagggggt480ttag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