人源化基因改造动物模型的制备方法及应用与流程

本申请涉及人源化基因改造动物模型的建立方法及应用，具体而言，涉及基于一种人源化tim-3基因改造动物模型的构建方法及其在生物医药的应用。
背景技术：
：免疫疗法通过激活免疫系统攻击并杀死癌症细胞，是肿瘤研究的一个重要领域，近十年来已经应用在临床治疗中。研究表明，以t细胞的抑制性受体为目标进行治疗效果显著，是当前靶向基因治疗最成功的领域。其中，靶向ctla-4和pd-1/pd-l1的单克隆抗体已经取得确切疗效，更多靶向其它的抑制性受体的新型药物正在或已经进入临床研究。t细胞免疫球蛋白及粘蛋白-3(tcellimmunoglobulinandmucindomain-3，tim-3)主要表达于ifn-γ分泌型cd4+th1和cd8+tc1细胞，其基本结构包括一个信号肽、免疫球蛋白区、黏蛋白区、跨膜区和有磷酸化位点的胞内区，在结构上属于tim家族。通过与其天然配体半乳凝素-9(galectin-9，gal-9)结合，触发胞内信号通路，最终可导致t细胞功能的抑制，对细胞免疫起负性调节作用。大量研究证明tim-3是抗肿瘤免疫中的关键负性调节剂，其表达有助于肿瘤免疫逃逸。研究发现胃癌患者外周血中tim-3(+)t细胞群明显多于健康对照(anincreasednumberofpd-1+andtim-3+cd8+tcellsisinvolvedinimmuneevasioningastriccancer)，且胃癌组织中tim-3的表达显著高于胃炎组织(intjclinexppathol.2015aug1；8(8):9452-7.ecollection2015.expressionoftim-3ingastriccancertissueanditsrelationshipwithprognosis.chengg)，表明tim-3在胃癌的发生和发展中起重要作用。在乳腺癌、食道癌、结肠癌、非小细胞肺癌、肾细胞癌等多种肿瘤中，tim-3的表达上调均提示预后不良。已有研究证实，使用tim-3抗体可增强环磷酰胺在小鼠ct26结肠癌肿瘤模型中的治疗功效，更明显的抑制肿瘤生长(scirep.2015oct23；5:15659.doi:10.1038/srep15659.apoptosisoftumorinfiltratingeffectortim-3+cd8+tcellsincoloncancer.kangcw)。但有时单独阻断tim-3途径效果有限。研究表明，几乎所有tim-3(+)t细胞均共表达pd-1分子(anincreasednumberofpd-1+andtim-3+cd8+tcellsisinvolvedinimmuneevasioningastriccancer；targetingpd-1andtim-3pathwaystoreversecd8t-cellexhaustionandenhanceexvivot-cellresponsestoautologousdendritic/tumorvaccines)，且这种双阳性t细胞表现出更严重的衰竭状态。不少研究显示联合抑制tim-3和pd-1的效果优于单独抑制疗法。尽管对tim-3感兴趣，但直到现在仍不了解有关tim-3作用机制的细节，也没有上市的tim-3抗体。因此，本领域有必要深入研究tim-3与肿瘤免疫机制间相互影响及对肿瘤进展的综合作用，阐明tim-3在肿瘤免疫治疗中的应用价值，加快tim-3抗体药物的开发进程。实验动物疾病模型对于研究人类疾病发生的病因、发病机制、开发防治技术和药物是不可缺少的研究工具。目前已有少数与tim-3相关的实验动物。sanchez-fueyoetal.(2003)等人为了研究tim-3在免疫应答中的负调节功能，成功制备了tim-3缺陷小鼠(balb/c背景)，发现该小鼠胸腺发育正常，未发现自身免疫或淋巴增生性状，且t辅助细胞功能未影响；在自身混合淋巴细胞反应中，tim-3缺陷小鼠表现出轻微的增殖反应。但由于balb/c小鼠免疫应答以th2细胞为优势，tim-3并不表达在th2细胞表面，使用该小鼠进行的研究结果可能不够全面。josalynl.cho(2012)等人在小鼠7号外显子上插入zeo片断破坏胞质区序列，成功制备了tim-3mut小鼠(c57bl/6背景)。该小鼠同样可正常存活并无形态异常，对6-8周龄小鼠的淋巴、脾脏和肺分析发现cd4+比例与野生型并无差异，在初始cd4+或cd8+t细胞中tim-3的表达也未显示差异。但该突变导致小鼠tim-3末端胞质结构域缺失，tcr-cd3z链磷酸化程度降低从而下调了t细胞的活性，细胞因子(ifn-γ)表达降低，在流感病毒感染时降低了发病率和死亡率。以上研究表明现有与tim-3相关的模式动物主要用于研究基因信号通路、功能等方面。随着基因工程技术的不断发展和成熟，用人类细胞或基因替代或置换动物的内源性同类细胞或基因，以建立更接近人类的生物体系或疾病模型，建立人源化实验动物模型(humanizedanimalmodel)，已经为临床上新的治疗方法或手段提供了重要工具。其中基因人源化动物模型，即，利用基因遗传操作技术，用人类正常或突变基因替换动物同类基因，可在动物体内建立更接近人类的正常或突变基因体系的基因人源化动物模型。基因人源化动物不但本身具有重要应用价值，如通过基因人源化可改进和提升细胞人源化动物模型，更重要的是，由于人类基因片段的存在，动物体内可表达或部分表达含有人类功能的蛋白质，从而大大减少人和动物的临床实验差异，为在动物水平进行药物筛选提供了可能。鉴于tim-3基因在肿瘤免疫治疗领域具有巨大应用价值，为了使临床前期的试验更有效并使研发失败最小化，本发明在世界范围内首次提供一种建立人源化tim-3基因改造动物模型的新方法，并得到世界首例tim-3基因人源化动物。具体来说，本发明的目的是制备一种非人动物模型，该动物体内可正常表达tim-3蛋白，且表达的tim-3蛋白能识别并结合人tim-3抗体/抗原，该方法在肿瘤药物筛选等方面有着广阔的应用前景。技术实现要素：为了解决上述问题，本申请发明人惊奇的发现利用创造性劳动筛选设计独特的sgrna序列，使非人动物tim-3基因的特定片段被人tim-3基因特定片段替换，本申请发明人成果得到世界首例人源化tim-3基因非人动物模型，特别是tim-3基因人源化小鼠。成功制备tim-3基因人源化的模式动物，该模型体内可正常表达tim-3蛋白，可用于tim-3基因功能研究、靶向tim-3抗体的筛选和评价。利用本发明制备的动物模型可用于针对人tim-3靶位点的药物筛选、药效研究，免疫相关疾病和肿瘤治疗等应用，加快新药研发过程，节约时间和成本，降低药物开发风险。对于研究tim-3蛋白的功能和肿瘤药物筛选等提供了有力工具。同时还得到基因敲除动物模型。以及利用本模型可以与其它人源化动物模型(包括但不限于，人源化pd-1抗体动物模型)交配得到双人源动物模型，可用于联合用药情况下筛选抗体及联合用药的药效评价等。本发明的第一方面，提供了一种靶向载体，其包含：a)与待改变的转换区5’端同源的dna片段，即5’臂，其选自tim-3基因基因组dna的100-10000个长度的核苷酸；b)插入或替换的供体dna序列，其编码供体转换区；和c)与待改变的转换区3’端同源的第二个dna片段，即3’臂，其选自tim-3基因基因组dna的100-10000个长度的核苷酸。优选的，所述的靶向载体，a)与待改变的转换区5’端同源的dna片段，即5’臂，其选自与ncbi登录号为nc_000077.6至少具有90％同源性的核苷酸，优选的，所述与待改变的转换区5’端同源的dna片段，即5’臂，其选自ncbi登录号为nc_000077.6的第46454902-46456260位核苷酸；c)与待改变的转换区3’端同源的第二个dna片段，即3’臂，其选自ncbi登录号为nc_000077.6至少具有90％同源性的核苷酸，优选的，所述与待改变的转换区3’端同源的第二个dna片段即3’臂，其选自ncbi登录号为nc_000077.6的第46456585-46457884位核苷酸。优选的，所述的靶向载体，a)中选择的基因组核苷酸的长度为1.359kb；c)中选择的基因组核苷酸的长度为1.3kb。优选的，所述的待改变的转换区位于tim-3基因第2号外显子。优选的，所述的靶向载体，其中5’臂序列如seqidno：31所示。优选的，所述的靶向载体，其中3’臂序列如seqidno：37所示。优选的，所述的靶向载体，所述靶向载体还包括可选择的基因标记。优选的，其中插入或替换的供体dna序列来自人。更优选的，所述插入或替换的供体dna序列为人tim-3基因的核苷酸序列部分或全部。进一步优选的，所述人tim-3基因的核苷酸序列包括人tim-3基因dna序列的第1号外显子、第2号外显子、第3号外显子、第4号外显子、第5号外显子、第6号外显子和/或第7号外显子中的一个或多个。优选的，所述的靶向载体，其中所述人源tim-3的核苷酸序列编码如seqidno：26所示的ncbi登录号np_116171.3所示人tim-3蛋白的部分或全部序列。人源dna片段选自ncbi登录号为nc_000005.10的第157106637-157106957位核苷酸。优选的，所述的靶向载体，其中插入或替换的供体dna序列如seqidno：34所示。本发明的第二方面，提供一种用于构建人源化动物模型的sgrna序列，所述sgrna序列靶向非人动物tim-3基因，同时所述sgrna在待改变的非人动物tim-3基因上的靶序列上是唯一的，且按照5’-nnn(20)-ngg3’或5’-ccn-n(20)-3’的序列排列规则。优选的，所述非人动物为啮齿动物。更优选的，所述啮齿动物为小鼠。优选的，所述sgrna在小鼠tim-3基因的靶位点位于小鼠tim-3基因的第2号外显子上。更优选的，sgrna靶向的5’端靶位点的序列如seqidno：1-6任一项所示，sgrna靶向的3’端靶位点的序列如seqidno：7-13任一项所示。进一步优选的，sgrna靶向的5’端靶位点的序列如seqidno：3所示，sgrna靶向的3’端靶位点的序列如seqidno：8所示。优选的，所述的一种用于构建人源化动物模型的sgrna序列，其识别5’端靶位点的sgrna序列选自seqidno：14和seqidno：16、seqidno：15和seqidno：17；其识别3’端靶位点的sgrna序列选自seqidno：18和seqidno：20、seqidno：19、seqidno：21。第一对sgrna序列具体为：其上游序列如seqidno：14所示，下游序列如seqidno：16所示，所述sgrna序列识别5’端靶位点。第二对sgrna序列具体为：其上游序列如seqidno：15所示，其由在seqidno：14的5’端加上tagg得到，下游序列如seqidno：17所示，其由在seqidno：16的5’端加上aaac得到，所述sgrna序列识别5’端靶位点。第三对sgrna序列具体为：其上游序列如seqidno：18所示，下游序列如seqidno：20所示，所述sgrna序列识别3’端靶位点。第四对sgrna序列具体为：其上游序列如seqidno：19所示，其由在seqidno：18的5’端加上tagg得到，下游序列如seqidno：21所示，其由在seqidno：20的5’端加上aaac得到，所述sgrna序列识别3’端靶位点。本发明的第三方面，提供一种包含第二方面所述sgrna序列的构建体。本发明的第四方面，提供了一种制备sgrna载体的方法，包括以下步骤：(1)提供一种sgrna序列，制备获得正向寡核苷酸序列和反向寡核苷酸序列，所述sgrna序列靶向非人动物tim-3基因，同时所述sgrna在待改变的非人动物tim-3基因上的靶序列上是唯一的，且符合5’-nnn(20)-ngg3’或5’-ccn-n(20)-3’的序列排列规则；(2)合成含有t7启动子及sgrnascaffold的片段dna，并将所述片段dna通过ecori和bamhi酶切连接至骨架载体上，经测序验证，获得pt7-sgrna载体；(3)将步骤(1)获得的正向寡核苷酸和反向寡核苷酸变性、退火，形成可以连入步骤(2)所述的pt7-sgrna载体的双链；(4)将步骤(3)中退火的双链sgrna寡聚核苷酸分别与pt7-sgrna载体进行链接，筛选获得sgrna载体。优选的，所述制备sgrna载体的方法，包括以下步骤：(1)将序列如seqidno：1-6所示的任一项sgrna靶序列和/或seqidno：7-13所示的任一项sgrna靶序列，制备获得正向寡核苷酸序列和反向寡核苷酸序列；优选的，所述sgrna靶序列为seqidno：3和seqidno：8，获得的正向寡核苷酸序列如seqidno：15或seqidno：19所示；反向寡核苷酸序列如seqidno：17或seqidno：21所示，其中seqidno：15和seqidno：17为a组，seqidno：19和seqidno：21为b组；(2)合成含有t7启动子及sgrnascaffold的片段dna，其中含有t7启动子及sgrnascaffold的片段dna如seqidno：22所示，将上述片段通过ecori和bamhi酶切连接至骨架载体上，经测序验证，获得pt7-sgrna载体；(3)分别合成步骤(1)中所述的正向寡核苷酸和反向寡核苷酸，优选为a组和b组中的正向寡核苷酸和反向寡核苷酸，将合成的sgrna寡聚核苷酸变性、退火，形成可以连入步骤(2)所述的pt7-sgrna载体的双链；(4)将步骤(3)中退火的双链sgrna寡聚核苷酸分别与pt7-sgrna载体进行链接，筛选获得sgrna载体。本发明的第五方面，提供一种细胞，所述细胞包含上述的靶向载体、一种或多种上述的构建体和/或一种或多种上述构建体的体外转录产物。优选的，所述细胞包含上述的靶向载体和一种或多种上述构建体的体外转录产物。优选的，所述的细胞，还包括cas9mrna或其体外转录产物。优选的，所述的细胞中的基因是杂合的。优选的，所述的细胞中的基因是纯合的。优选的，所述的非人动物为啮齿类动物。进一步优选的，所述啮齿类动物为小鼠。优选的，所述的细胞为受精卵细胞。进一步优选的，所述受精卵来源于任何非人类动物；进一步优选的，所述受精卵细胞来源于啮齿类动物；最优选的，所述受精卵选自c57bl/6受精卵、fvb/n受精卵、129受精卵、balb/c受精卵、dba/1受精卵或dba/2受精卵。本发明的第六方面，提供上述的靶向载体、上述的sgrna序列、上述的构建体或上述的细胞在构建包含tim-3基因人源化的非人动物或其子代中的应用。本发明的第七方面，提供一种构建tim-3基因人源化的非人动物或其子代的方法，所述方法包括导入人tim-3基因、使得该人tim-3基因在非人动物或其子代细胞中表达并且促进该细胞产生人源化的tim-3蛋白，同时降低或消除了非人动物或其子代的体内内源/动物来源的tim-3基因的表达。优选的，所述方法包括：(a)构建含有人tim-3基因的载体，通过基因工程方法将所述人tim-3基因的载体导入非人动物的基因组，使得非人动物基因组中的内源/动物来源的tim-3基因缺失或使得内源/动物来源的tim-3蛋白不表达或不具有功能；并且(b)在所述非人动物或其子代体内表达人源化tim-3蛋白。优选的，所述动物基因组中包括人源化tim-3基因，所述人源化tim-3基因编码的蛋白包括胞外区、跨膜区以及胞内参与信号传导的区域，其中编码胞内参与信号传导的人源化tim-3基因的区域为动物来源，编码胞外区的人源化tim-3基因的区域包含人tim-3基因的全部或部分片段，同时该动物来源部分和人源部分通过序列拼接连接于动物内源的tim-3启动子后。优选的，编码跨膜区的人源化tim-3基因的区域为动物来源。优选的，修饰/改造后的非人动物包含内源/动物来源的tim-3基因的人源化序列或片段，其中所述人源化序列或片段包含内源/动物来源的tim-3基因座，用人tim-3胞外域编码序列取代内源/动物来源的tim-3胞外域编码序列的部分或全部。优选的，所述人源化tim-3基因包括将动物来源的tim-3的第2号外显子全部或部分序列替换为人源tim-3的第2号外显子全部或部分序列，其中，使用sgrna靶向动物的tim-3基因，优选的，所述动物为啮齿类动物。更优选的，所述啮齿类动物为小鼠。所述小鼠tim-3的mrna序列的全部或部分片段如seqidno：23中的全部或部分片段所示，所述小鼠tim-3的蛋白序列的全部或部分片段如seqidno：24中的全部或部分片段所示。进一步优选的，所述sgrna靶向5’端靶位点序列如seqidno：1-6任一项所示，3’端靶位点序列如seqidno：7-13任一项所示。优选的，所述的人tim-3基因的全部或部分片段的人tim-3mrna序列如seqidno：25中的全部或部分片段所示，所述人tim-3蛋白全部或部分片段的序列如seqidno：26中的全部或部分片段所示。优选的，所述的方法，所述动物用作动物模型。更优选的，所述动物模型为荷瘤非人类哺乳动物模型。优选的，所述的方法，包括如下步骤：(a)提供一种上述的细胞，优选的所述细胞为受精卵细胞；(b)将所述细胞在培养液中进行培养；(c)将培养后细胞移植至受体雌性非人类哺乳动物的输卵管内，允许所述细胞在所述雌性非人类哺乳动物的子宫中发育；(d)鉴定步骤(c)的怀孕雌性的后代基因改造人源化非人类哺乳动物中的种系传递。优选的，所述的方法，使用基因编辑技术进行tim-3基因人源化动物模型的建立，所述基因编辑技术包括基于胚胎干细胞的基因同源重组技术、crispr/cas9、锌指核酸酶技术、转录激活子样效应因子核酸酶技术、归巢核酸内切酶或其他分子生物学技术。优选的，使用基于crispr/cas9的基因编辑技术进行tim-3基因人源化动物模型的建立。本发明进一步涉及所述的方法，非人动物是啮齿类动物。本发明进一步涉及所述的方法，所述小鼠为c57bl/6小鼠。本发明进一步涉及所述的方法，所述步骤(c)中的非人类哺乳动物为假孕雌性。本发明还涉及一种tim-3基因敲除动物模型构建的方法，将动物体内的tim-3的第2号外显子全部或部分敲除，使得内源tim-3蛋白失活；其中，使用sgrna靶向动物的tim-3基因，所述sgrna靶向的5’端靶位点如seqidno：1-6任一项所示，3’端靶位点的序列如seqidno：7-13任一项所示。优选的，所述动物用作动物模型。优选的，所述动物模型为荷瘤非人类哺乳动物模型。本发明所述的tim-3基因敲除动物模型的制备方法，包括以下步骤：第一步：按照上述所述的步骤(1)-(4)，获得sgrna载体；第二步：将sgrna载体的体外转录产物和cas9mrna进行混合，获得混合液，将混合液注射至小鼠受精卵细胞质或细胞核中，将注射后的受精卵转移至培养液中进行培养，然后移植至受体母鼠的输卵管中发育，得到f0代小鼠；第三步：将f0代小鼠利用pcr技术进行检验，验证细胞中的tim-3基因被敲除，获得tim-3基因敲除阳性小鼠；第四步：将第三步筛选的阳性小鼠通过杂交和自交的方式，扩大种群数量，建立稳定的tim-3-/-小鼠；优选的，所述第三步中使用的pcr检测引物对序列如seqidno：40-43所示。本发明的第八方面，提供一种由第七方面所述的方法产生的非人动物或其子代。优选的，所述动物为啮齿类动物。进一步优选的，所述啮齿类动物为小鼠。本发明的第九方面，提供一种制备多基因人源化非人动物的方法，(a)利用上述所述的非人动物或其子代；(b)将步骤(a)获得的动物与其他人源化动物交配或进行体外授精或直接进行基因编辑/修饰，并进行筛选，得到多基因人源化非人动物。优选的，所述多基因人源化动物可以是双基因人源化动物、三基因人源化动物、四基因人源化动物、五基因人源化动物、六基因人源化动物、七基因人源化动物、八基因人源化动物或九基因人源化动物。进一步优选的，所述其他人源化动物为pd-1人源化小鼠或ctla-4人源化小鼠。优选的，一种建立双人源化小鼠基因改造非人动物的方法，包括如下步骤：(a)利用前述的一种建立tim-3基因人源化非人动物的方法获得tim-3基因基因改造人源化小鼠；(b)将步骤(a)获得的基因改造人源化小鼠与其他人源化小鼠交配或进行体外授精，并进行筛选，得到双人源化小鼠。本发明进一步涉及一种方法，步骤(b)中，将步骤(a)获得的基因改造人源化小鼠与pd-1人源化小鼠交配得到tim-3和pd-1双人源化小鼠。本发明进一步涉及一种方法，步骤(b)中，将步骤(a)获得的基因改造人源化小鼠与ctla-4人源化小鼠交配得到tim-3和ctla-4双人源化小鼠。本发明的第十方面，提供根据第九方面所述的方法产生的非人动物或其子代。优选的，所述非人动物为啮齿类动物。进一步优选的，所述啮齿类动物为小鼠。优选的，所述非人动物，其基因组中含有人源基因。进一步优选的，所述的人源化tim-3基因的序列如seqidno：28或seqidno：29所示或与上述基因的同一性程度为至少大约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，与上述序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个碱基；或者，与上述基因在严格条件下杂交。优选的，所述非人动物表达人源化tim-3基因编码的蛋白质。本发明还提供了一种第十方面所述的非人动物或其子代在制备荷瘤动物模型中的用途。优选的，所述非人动物是啮齿类动物。进一步优选的，所述啮齿类动物是小鼠。本发明的第十一方面，提供一种嵌合tim-3蛋白，选自下列组中的一种：a)所述氨基酸序列如seqidno：30所示；b)由核酸序列编码的氨基酸序列，所述核酸序列在低严谨条件下，与编码seqidno：30所示的氨基酸的核苷酸序列杂交；c)所述氨基酸序列与seqidno：30所示的氨基酸的同一性程度为至少大约为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；d)所述氨基酸序列与seqidno：30所示的氨基酸的差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；e)所述氨基酸序列具有seqidno：30所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸的氨基酸序列。或f)嵌合tim-3蛋白序列中编码人tim-3蛋白的mrna序列如seqidno：25所示的序列的部分或全部所示；g)嵌合tim-3蛋白序列中编码人tim-3蛋白的mrna序列与seqidno：25所示的序列同一性程度为至少大约为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；h)嵌合tim-3蛋白序列中编码人tim-3蛋白的mrna序列与seqidno：25所示的核苷酸序列杂交；i)嵌合tim-3蛋白序列中编码人tim-3蛋白的mrna序列与seqidno：25所示的序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；j)嵌合tim-3蛋白序列中编码人tim-3蛋白的mrna序列具有与seqidno：25所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列；或k)嵌合tim-3蛋白序列中人tim-3的蛋白序列如seqidno：26部分或全部序列所示；l)嵌合tim-3蛋白序列中人tim-3的蛋白序列与seqidno：26所示氨基酸的序列同一性程度为至少大约为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；m)嵌合tim-3蛋白序列中编码人tim-3的蛋白序列的核酸序列在严格条件下，与seqidno：26所示的蛋白序列的核苷酸序列杂交；n)嵌合tim-3蛋白序列中人tim-3的蛋白序列与seqidno：26所示的氨基酸的序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；o)嵌合tim-3蛋白序列中人tim-3的蛋白序列具有seqidno：26所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列；或p)嵌合tim-3蛋白的核苷酸编码序列为seqidno：28所示的序列的部分或全部；q)嵌合tim-3蛋白的核苷酸编码序列与seqidno：28所示的核苷酸序列同一性程度为至少大约为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；r)嵌合tim-3蛋白的核苷酸编码序列在严格条件下，与seqidno：28所示的核苷酸序列杂交；s)嵌合tim-3蛋白的核苷酸编码序列与seqidno：28所示的序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；t)嵌合tim-3蛋白的核苷酸编码序列具有seqidno：28所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列；或u)嵌合tim-3的mrna序列为seqidno：29所示的序列的部分或全部；v)嵌合tim-3的mrna序列与seqidno：29所示的序列同一性程度为至少大约为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；w)嵌合tim-3的mrna序列与seqidno：29所示的核苷酸序列杂交；x)嵌合tim-3的mrna序列与seqidno：29所示的序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；y)嵌合tim-3的mrna序列具有与seqidno：29所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列；或a1)嵌合tim-3蛋白中编码嵌合tim-3蛋白的核苷酸的部分序列为seqidno：27所示的序列的部分或全部；b1)嵌合tim-3蛋白中编码嵌合tim-3蛋白的核苷酸部分序列与seqidno：27所示的核苷酸序列的部分或全部的同一性程度为至少大约为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；c1)嵌合tim-3蛋白中编码嵌合tim-3蛋白的核苷酸部分序列在严格条件下，与seqidno：27所示的核苷酸序列杂交；d1)嵌合tim-3蛋白中编码嵌合tim-3蛋白的核苷酸部分序列与seqidno：27所示的序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；e1)嵌合tim-3蛋白中编码嵌合tim-3蛋白的核苷酸部分序列具有seqidno：27所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。本发明的第十二方面，提供编码嵌合tim-3蛋白的基因，其中所述基因序列选自：a)所述基因编码第十方面所述的人源化嵌合tim-3蛋白序列；b)所述基因序列转录的mrna序列如seqidno：29所示；c)所述基因的cds编码序列如seqidno：28所示；d)在低严谨条件下，与seqidno：29或seqidno：28所示的核苷酸杂交的基因序列；e)所述基因序列转录的mrna序列与seqidno：29或seqidno：28所示的核苷酸具有至少大约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％同一性程度的基因序列。优选的，seqidno：29所示序列为人源化小鼠tim-3dna的非模板链，又被称为编码链或有义链。本发明进一步涉及一段人源化小鼠tim-3的基因组dna序列，其转录获得的mrna逆转录后得到的dna序列，前述dna序列一致或互补。本发明的第十三方面，提供表达上述人源化小鼠tim-3蛋白的构建体。本发明的第十四方面，提供一种包含第十三方面所述构建体的细胞。本发明的第十五方面，提供一种包含第十四方面所述细胞的组织。本发明的第十六方面，提供一种细胞或细胞系或原代细胞培养物，所述细胞或细胞系或原代细胞培养物来源于上述所述的的非人动物或其子代。本发明的第十七方面，提供一种组织或器官，所述组织或器官来源于上述所述的非人动物或其子代。优选的，所述组织或器官为脾脏、肿瘤或其培养物。本发明进一步涉及一种来源于前述任一项的非人类哺乳动物或其后代或荷瘤非人类哺乳动物荷瘤后的瘤组织。本发明的第十八方面，提供一种上述的动物及子代、上述的嵌合tim-3蛋白、上述的编码嵌合tim-3蛋白的基因、上述的构建体、上述的细胞或细胞系或原代细胞培养物、上述所述的组织或器官在制备动物模型中的用途。本发明的第十九方面，提供一种上述的动物及子代、上述的嵌合tim-3蛋白、上述的编码嵌合tim-3蛋白的基因、上述的构建体、上述的细胞或细胞系或原代细胞培养物、上述的组织或器官在与tim-3基因或者蛋白相关的领域中的应用。优选的，所述的应用包括在需要涉及人类细胞的免疫过程的产品开发，制造人类抗体，或者作为药理学、免疫学、微生物学和医学研究的模型系统中的应用或在需要涉及人类细胞的免疫过程的生产和利用动物实验疾病模型，用于病原学研究和/或用于开发新的诊断策略和/或治疗策略中的应用或在体内研究、人tim-3信号通路调节剂的筛选、药效检测、筛选文库、疗效评估、筛选、验证、评价或研究tim-3基因功能研究、人tim-3抗体、针对人tim-3靶位点的药物、药效研究，免疫相关疾病药物以及抗肿瘤药物方面的用途。优选的，所述tim-3抗体可以是人源或鼠源或嵌合。优选的，所述动物为非人类哺乳动物或其后代或荷瘤非人类哺乳动物、动物模型。优选的用于如上描述的方法的受精卵是c57bl/6受精卵。也可用于本发明方法中的本领域所使用的受精卵包括但不限于fvb/n受精卵、balb/c受精卵、dba/1受精卵和dba/2受精卵。受精卵可以来源于任何非人类动物。优选受精卵细胞来源于啮齿类。可以通过dna的微注射来向受精卵引入遗传构建体。例如，可以通过微注射后培养受精卵、将培养的受精卵转移到假孕的非人类动物中并生育非人类哺乳动物来产生上文所述方法的非人类哺乳动物。这里使用的术语“基因改造”描述人工引入并整合进生物的dna产生的特定基因的蛋白质。这里使用的术语“基因改造动物”描述基因组中含有外源dna的动物。此基因改造dna可能整合在基因组的某处。本发明还提供由以上描述的任何方法所产生的非人类哺乳动物。在本发明的一个实施方案中，提供非人类哺乳动物，所述基因改造动物基因组中含有编码人源tim-3的dna。在一个优选的实施方案中，，提供表达基因改造人源tim-3的非人类哺乳动物。在一个优选的实施方案中，组织特异性表达人源tim-3蛋白。在另一实施方案中，基因改造动物中的人源tim-3的表达是可控的，如通过加入特异的诱导物或阻遏物物质。非人类哺乳动物可以是任何本领域已知的、可以用于本发明方法的非人类动物。优选的非人类哺乳动物是哺乳动物，更优选的非人类哺乳动物是啮齿动物。本发明最优选的动物是小鼠。可以对上文描述的非人类哺乳动物进行遗传、分子和行为分析。本发明也涉及本发明提供的非人类哺乳动物与相同或其它基因型交配后产生的后代。本发明还提供来源于本发明提供的非人类哺乳动物或其后代的细胞系或原代细胞培养物。可以通过两种方法制备基于细胞培养的模型。可以从非人类哺乳动物中分离细胞培养物，或从使用同样的构建体、经标准的细胞转染技术建立的细胞培养物中制备细胞培养物。可以通过多种方法检测含有编码人源tim-3蛋白的dna序列的遗传构建体的整合。对于本领域技术人员而言，显然存在许多可以用来检测外源dna表达的分析方法，包括在rna水平的方法(包括通过逆转录酶聚合酶链式反应(rt-pcr)或通过southern印迹、原位杂交的mrna定量)和在蛋白质水平的方法(包括组织化学、免疫印迹分析和体外结合研究)。此外，可以通过本领域技术人员众所周知的elisa技术来定量目的基因的表达水平。可以使用许多标准分析来完成定量测量。例如，可使用rt-pcr和包括rna酶保护、southern印迹分析、rna斑点(rnadot)分析在内的杂交方法测量转录水平。也可以使用免疫组织化学染色、细胞流式检测和western印迹分析来评估是否存在人源tim-3蛋白质。除非特别说明，本发明的实践将采取细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组dna和免疫学的传统技术。这些技术在以下文献中进行了详细的解释。例如：molecularcloningalaboratorymanual，2nded.，ed.bysambrook，fritschandmaniatis(coldspringharborlaboratorypress：1989)；dnacloning，volumesiandii(d.n.glovered.，1985)；oligonucleotidesynthesis(m.j.gaited.，1984)；mullisetal.u.s.pat.no.4，683，195；nucleicacidhybridization(b.d.hames&s.j.higginseds.1984)；transcriptionandtranslation(b.d.hames&s.j.higginseds.1984)；cultureofanimalcells(r.i.freshney，alanr.liss，inc.，1987)；immobilizedcellsandenzymes(irlpress，1986)；b.perbal，apracticalguidetomolecularcloning(1984)；theseries，methodsinenzymology(j.abelsonandm.simon，eds.-in-chief，academicpress，inc.，newyork)，specifically，vols.154and155(wuetal.eds.)andvol.185，″geneexpressiontechnology″(d.goeddel，ed.)；genetransfervectorsformammaliancells(j.h.millerandm.p.caloseds.，1987，coldspringharborlaboratory)；immunochemicalmethodsincellandmolecularbiology(mayerandwalker，eds.，academicpress，london，1987)；handbookofexperimentalimmunology，volumesv(d.m.weirandc.c.blackwell，eds.，1986)；andmanipulatingthemouseembryo，(coldspringharborlaboratorypress，coldspringharbor，n.y.，1986)。以上只是概括了本发明的一些方面，不是也不应该认为是在任何方面限制本发明。本说明书提到的所有专利和出版物都是通过参考文献作为整体而引入本发明的。本领域的技术人员应认识到，对本发明可作某些改变并不偏离本发明的构思或范围。下面的实施例进一步详细说明本发明，不能认为是限制本发明或本发明所说明的具体方法的范围。附图说明以下，结合附图来详细说明本发明的实施例，其中：图1：sgrna的活性检测结果，其中，a为sgrna1-sgrna6活性检测结果，其中con为阴性对照，pc为阳性对照，blank为空白对照；b为sgrna7-sgrna13活性检测结果，其中con为阴性对照，pc为阳性对照，blank为空白对照；图2：pt7-sgrna质粒图谱示意图；图3：人tim-3基因与鼠tim-3基因对比示意图；图4：人源化小鼠tim-3基因示意图；图5：打靶策略示意图；图6：pclon-4g-tim质粒酶切结果图，其中，m为marker，ck为未经酶切的质粒对照；图7：鼠尾pcr鉴定结果(f0)，其中，m为marker，wt为野生型，结果表明：编号1、2的小鼠为阳性小鼠；图8：鼠尾pcr鉴定结果(f1)，其中，图a为5’端引物pcr结果，图b为3’端引物pcr结果，wt为野生型，+为阳性对照，结果表明：编号f1-1、f1-2、f1-3、f1-4的小鼠均为阳性小鼠；图9：f1代小鼠southernblot结果，其中wt为野生型，综合p1、p2探针的结果表明，编号f1-1、f1-2、f1-4的tim-3阳性f1代小鼠无随机插入；图10：流式分析结果，其中，取c57bl/6小鼠和tim-3人源化小鼠，分别用抗鼠cd3抗体刺激脾脏内t细胞激活(图b、图c、图e、图f)，再用抗鼠(图a、b、c)和抗人(图d、e、f)tim-3荧光抗体进行细胞标记，经流式细胞仪检测分析可见：与未经抗鼠cd3抗体刺激脾脏的(图a、d)相比，可在tim-3人源化f1杂合鼠脾脏内，检测到表达人源化tim-3蛋白的细胞；而在c57bl/6小鼠的脾脏内，未检测到表达人或人源化tim-3蛋白的细胞；图11：rt-pcr检测结果，其中，+/+为野生型c57bl/6小鼠，h/+为tim-3人源化f1代杂合子小鼠；图12：流式分析结果，其中，取野生型c57bl/6小鼠和b-htim-3纯合小鼠，分别用鼠cd3抗体刺激脾脏内t细胞(图b、图c、图e、图f)，再用鼠tim-3抗体mtim3apc(图a、图b、图c)或人tim-3抗体htim-3pe(图d、图e、图f)进行细胞标记，图a与图d为未经鼠cd3刺激的野生型c57bl/6小鼠，在c57bl/6对照小鼠脾脏内的非t非b细胞可检测到表达鼠tim-3蛋白的细胞(图a、b)，未检测到表达人或人源化tim-3蛋白的细胞(图d、e)；在b-htim-3纯合小鼠脾脏内的非t非b细胞可检测到表达人源化tim-3蛋白的细胞(图f)；而未检测到表达鼠tim-3蛋白的细胞(图c)；图13：流式分析结果，其中，取野生型c57bl/6小鼠和b-htim-3纯合小鼠，分别用鼠cd3抗体刺激脾脏内t细胞(图b、图c、图e、图f)，再用鼠tim-3抗体mtim3apc和鼠t细胞表面抗体mtcrβ(图a、图b、图c)或人tim-3抗体htim-3pe和鼠t细胞表面抗体mtcrβ(图d、图e、图f)对t细胞胞外蛋白同时进行细胞标记，图a与图d为未经抗鼠cd3刺激的野生型c57bl/6小鼠，在经过cd3刺激的c57bl/6对照鼠的脾脏内可检测到表达鼠tim-3蛋白的细胞(图b)，未检测到表达人或人源化tim-3蛋白的细胞(图e)；在b-htim-3纯合小鼠脾脏内可检测到表达人源化tim-3蛋白的细胞(图f)，而未检测到表达鼠tim-3蛋白的细胞(图c)；图14：rt-pcr检测结果，其中，+/+为野生型c57bl/6小鼠，h/h为b-htim-3纯合子小鼠，gapdh为内参对照；图15：鼠尾pcr鉴定结果(tim-3基因敲除小鼠)，其中，wt为野生型，+为阳性杂合子对照，编号为1、3、4的小鼠为阳性小鼠；图16：鼠尾pcr鉴定结果，其中，+为ctla-4基因纯合子对照，-为野生型对照(图a、b)，wt为野生型，+为tim-3基因人源化小鼠杂合子，-为野生型对照(图c、d)；综合结果表明，编号为301的小鼠为双基因纯合子，编号为300、302、308的小鼠为tim-3h/+/ctla-4h/h，编号为306的小鼠为tim-3h/h/ctla-4h/+，编号为294、295、304的小鼠为tim-3h/+/ctla-4h/+；图17：鼠尾pcr鉴定结果，其中，+为tim-3基因杂合子对照，-为野生型对照(图a、b)，wt为野生型，-/-为pd-1基因人源化小鼠纯合子，+/-为pd-1基因人源化小鼠杂合子(图c、d)；图a、b的结果表明编号为6901～6916的小鼠为tim-3基因纯合子、图c、d的结果表明编号为6901～6916的小鼠为pd-1纯合子，综合两组结果表明，16只小鼠均为双基因纯合子；图18：流式分析结果，其中，取c57bl/6小鼠和双重人源化tim-3/pd-1纯合子小鼠，分别用鼠cd3抗体刺激脾脏内t细胞激活(图b、图c、图e、图f)，再用鼠tim-3抗体mtim3apc和鼠t细胞表面抗体mtcrβ(图a、图b、图c)或人tim-3抗体htim-3pe和鼠t细胞表面抗体mtcrβ(图d、图e、图f)对t细胞胞外蛋白同时进行细胞标记，图a与图d为未经抗鼠cd3刺激的野生型c57bl/6小鼠，可在双重人源化tim-3/pd-1纯合子的鼠脾脏内检测到表达人源化tim-3蛋白的细胞，而在c57bl/6对照鼠的脾脏内未检测到表达人或人源化tim-3蛋白的细胞；图19：流式分析结果，其中，取c57bl/6小鼠和双重人源化tim-3/pd-1纯合子小鼠，分别用鼠cd3抗体刺激脾脏内t细胞激活(图b、图c、图e、图f)，再用鼠pd-1抗体mpd-1pe(图a、b、c)和鼠t细胞表面抗体mtcrβ，或人pd-1抗体hpd-1fitc(图d、e、f)和鼠t细胞表面抗体mtcrβ对t细胞胞外蛋白同时进行细胞标记，图a与图d为未经抗鼠cd3刺激的野生型c57bl/6小鼠，可在双重人源化tim-3/pd-1纯合子的鼠脾脏内检测到表达人源化pd-1蛋白的细胞，而在c57bl/6对照鼠的脾脏内未检测到表达人或人源化pd-1蛋白的细胞；图20：rt-pcr检测结果，其中，+/+为野生型c57bl/6小鼠，h/h为双重人源化tim-3/pd-1纯合子小鼠；gapdh为内参对照。结果可见，在c57bl/6小鼠活化的t细胞里，可检测到鼠tim-3的mrna表达；在双重人源化tim-3/pd-1纯合子小鼠活化的t细胞里，可以检测到人源化tim-3的mrna表达；图21：rt-pcr检测结果，其中，+/+为野生型c57bl/6小鼠，h/h为双重人源化tim-3/pd-1纯合子小鼠；gapdh为内参对照；结果可见，在c57bl/6小鼠活化的t细胞里，可检测到鼠pd-1的mrna表达；在双重人源化tim-3/pd-1纯合子小鼠活化的t细胞里，可以检测到人源化pd-1的mrna表达图22：将小鼠结肠癌细胞mc38植入b-htim-3小鼠体内，并利用3种tim-3抗体(ab1、ab2、ab3，10mg/kg)进行抗肿瘤药效试验，各组实验动物平均体重无显著差异；图23：将小鼠结肠癌细胞mc38植入b-htim-3小鼠体内，并利用3种tim-3抗体(ab1、ab2、ab3，10mg/kg)进行抗肿瘤药效试验，各组实验动物平均体重变化无显著差异；图24：将小鼠结肠癌细胞mc38植入b-htim-3小鼠体内，并利用3种tim-3抗体(ab1、ab2、ab3，10mg/kg)进行抗肿瘤药效试验，其中，所有治疗组(g2-g4)实验动物肿瘤平均体积呈现明显差异，且治疗组实验动物肿瘤平均体积明显小于g1对照组；图25：基于胚胎干细胞的打靶策略示意图。具体实施方式下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。在下述每一实施例中，设备和材料是从以下所指出的几家公司获得：ambion体外转录试剂盒购自ambion，货号am1354；大肠杆菌top10感受态细胞购自tiangen公司，货号为cb104-02；ecori，bamhi，bbsi，ndei，xbai酶购自neb，货号分别为；r3101m，r3136m，r0539l，r0111l，r0145m；卡那霉素购自amresco，货号为0408；cas9mrna来源sigma，货号cas9mrna-1ea；aio试剂盒来源北京百奥赛图基因生物技术有限公司，货号bcg-dx-004；uca试剂盒来源北京百奥赛图基因生物技术有限公司，货号bcg-dx-001；逆转录试剂盒购自takara，货号为6110a；c57bl/6小鼠购自中国食品药品检定研究院国家啮齿类实验动物种子中心；b-hpd-1小鼠来源北京百奥赛图基因生物技术有限公司；小鼠结肠癌细胞mc38购自上海酶研生物技术有限公司；鼠cd3抗体来源bd，货号563123；mtim-3apc来源biolegend，货号为119706，htim-3pe来源biolegend，货号为345006，mtcrβpercp来源biolegend，货号109228；mpd-1pe来源biolegend，货号109104；hpd-1fitc来源biolegend，货号329904；流式细胞仪生产厂家bd，型号为calibur。实施例1pt7-tim-3、pt7-tim-8的构建靶序列决定了sgrna的靶向特异性和诱导cas9切割目的基因的效率。因此，高效特异的靶序列选择和设计是构建sgrna表达载体的前提。设计并合成识别5’端靶位点(sgrna1-sgrna6)、3’端靶位点(sgrna7-sgrna13)的sgrna序列。5’端靶位点和3’端靶位点均位于tim-3基因第2号外显子上，各sgrna在tim-3的靶位点序列如下：sgrna-1靶位点序列(seqidno：1)：5’-tccttactttatagggtcattgg-3’sgrna-2靶位点序列(seqidno：2)：5’-agtgtaactgcagggcagatagg-3’sgrna-3靶位点序列(seqidno：3)：5’-ggaaaatgcttatgtgtttgagg-3’sgrna-4靶位点序列(seqidno：4)：5’-tgtagatagagtgtaactgcagg-3’sgrna-5靶位点序列(seqidno：5)：5’-gttacactctatctacacctggg-3’sgrna-6靶位点序列(seqidno：6)：5’-cacataggcacaagtgccccagg-3’sgrna-7靶位点序列(seqidno：7)：5’-ctgaaattagacatcaaagcagg-3’sgrna-8靶位点序列(seqidno：8)：5’-atgtgactctggatgaccatggg-3’sgrna-9靶位点序列(seqidno：9)：5’-gatcataaagaatgtgactctgg-3’sgrna-10靶位点序列(seqidno：10)：5’-tccagcagataccagctaaaggg-3’sgrna-11靶位点序列(seqidno：11)：5’-ctaaagggcgatctcaacaaagg-3’sgrna-12靶位点序列(seqidno：12)：5’-tgttgagatcgccctttagctgg-3’sgrna-13靶位点序列(seqidno：13)：5’-gccctttagctggtatctgctgg-3’利用uca试剂盒检测多个sgrna的活性，从结果可见sgrna具有不同活性，检测结果参见图1。从中优先选择2个(分别是sgrna3和sgrna8)进行后续实验。在其5’端加上tagg得到正向寡核苷酸，其互补链加上aaac得到反向寡核苷酸，退火后将退火产物连接分别连接至pt7-sgrna质粒(质粒先用bbsi线性化)，获得表达载体pt7-tim-3和pt7-tim-8。表1sgrna-3和sgrna-8序列列表表2连接反应体系(10μl)sgrna退火产物1μl(0.5μm)pt7-sgrna载体1μl(10ng)t4dnaligase1μl(5u)10×t4dnaligasebuffer1μl50％peg40001μlh2o补至10μl反应条件：室温连接10-30min，转化至30μltop10感受态细胞中，然后取200μl涂布于kan抗性的平板，37℃培养至少12小时后挑选2个克隆接种含有kan抗性的lb培养基(5ml)中，37℃，250rpm摇培至少12小时。随机挑选克隆送测序公司进行测序验证，选择连接正确的表达载体pt7-tim-3和pt7-tim-8进行后续实验。pt7-sgrna质粒来源：pt7-sgrna载体图谱，参见图2。该质粒骨架来源takara，货号3299。由质粒合成公司合成含有t7启动子及sgrnascaffold的片段dna并依次通过酶切(ecori及bamhi)连接至骨架载体上，经专业测序公司测序验证，结果表明获得了目的质粒。含有t7启动子及sgrnascaffold的片段dna(seqidno：22)：gaattctaatacgactcactatagggggtcttcgagaagacctgttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgcttttaaaggatcc实施例2载体pclon-4g-tim的构建将小鼠tim-3基因(geneid：171285)第2号外显子的部分编码序列(基于ncbi登录号为nm_134250.2→np_599011.2的转录本，其mrna序列如seqidno：23所示，对应的蛋白序列如seqidno：24所示)用人tim-3基因(geneid：84868)相应编码序列替换(基于ncbi登录号为nm_032782.4→np_116171.3的转录本，其mrna序列如seqidno：25所示，对应的蛋白序列如seqidno：26所示)，鼠tim-3与人tim-3基因结构对比示意图见图3，最终得到的改造后的人源化小鼠tim-3基因示意图见图4。人源化小鼠tim-3基因dna序列(嵌合tim-3基因dna)如seqidno：27所示：seqidno：27仅列出涉及改造部分的dna序列，其中斜体下划线区域为人源tim-3基因序列片段。改造后的人源化小鼠tim-3的cds区、mrna序列及其编码的蛋白序列分别如seqidno：28、seqidno：29和seqidno：30所示。鉴于人tim-3或小鼠tim-3具有多种基因亚型或转录本，本文所述的方法可应用于其它亚型或转录本的改造。发明人进一步设计了图5所示的打靶策略和包含5’同源臂、人tim-3基因片段、3’同源臂的载体。载体的构建过程如下：1、设计5’端同源重组片段的上游引物和与其匹配的下游引物以及相关序列。具体为：5’端同源臂序列如seqidno：31所示，为nc_000077.6的第46454902-46456260位核苷酸；上游引物(seqidno：32)：f：5’-tttaagaaggagatatacatggagctcattctggggactcaggagttagagg-3’下游引物(seqidno：33)：r：5’-gtattccacttctgatgaccctataaagtaaggaaaggaggtcag-3’2、设计插入或替换的供体dna序列的引物及相关序列，具体为：人dna片段(321bp)序列如seqidno：34所示，为nc_000005.10的第157106637-157106957位核苷酸位核苷酸；上游引物(seqidno：35)：f：5’-cttactttatagggtcatcagaagtggaatacagagcggagg-3’下游引物(seqidno：36)：r：5’-ctcacctgctttgatgaccaacttcaggttaaatttttcatcattc-3’3、设计3’端同源重组片段的上游引物和与其匹配的下游引物以及相关序列。具体为：3’同源臂序列如seqidno：37所示，为nc_000077.6的第46456585-46457884位核苷酸上游引物(seqidno：38)：f：5’-aacctgaagttggtcatcaaagcaggtgagtagacctttcc-3’下游引物(seqidno：39)：r：5’-ttgttagcagccggatctcagaagcttatctactgcggaggaaggtcaaatg-3’以c57bl/6小鼠基因组dna为模板pcr扩增获得5’端同源臂片段和3’端同源臂片段，以人基因组dna为模板pcr扩增获得人dna片段，通过aio试剂盒将片段连接至试剂盒配备的pclon-4g质粒上，最终获得载体pclon-4g-tim。实施例3载体pclon-4g-tim的验证随机挑选2个pclon-4g-tim克隆，使用3组酶进行酶切验证，其中，bamhi+ndei应出现5447bp+1048bp，ecori应出现5677bp+818bp，xbai应出现4207bp+2288bp。酶切结果均符合预期，参见图6，表明所有质粒酶切验证正确结果。编号1、2的质粒经测序公司测序验证正确，选择质粒2进行后续实验。实施例4显微注射及胚胎移植取小鼠的受精卵，例如，c57bl/6小鼠的原核期受精卵，利用显微注射仪将预混好的pt7-tim-3、pt7-tim-8质粒的体外转录产物(使用ambion体外转录试剂盒，按照说明书方法进行转录)和cas9mrna，pclon-4g-tim质粒注射至小鼠受精卵细胞质或细胞核中。按照《小鼠胚胎操作实验手册(第三版)》中的方法进行胚胎的显微注射，注射后的受精卵转移至培养液中短暂培养，然后移植至受体母鼠的输卵管，生产基因改造人源化小鼠，得到首建鼠(即founder鼠，为f0代)。将获得的f0小鼠通过杂交和自交，扩大种群数量，建立稳定的小鼠品系。将该免疫节点人源化小鼠命名为b-htim-3小鼠。实施例5基因改造人源化小鼠的鉴定1、f0代基因型鉴定分别使用两对引物对得到的f0代小鼠的鼠尾基因组dna进行pcr分析，引物针对tim-3基因的第2号外显子，引物位置pcr-1位于5’同源臂左侧，pcr-4位于3’同源臂右侧，pcr-2和pcr-3均位于人源化片段上，序列如下：5’端引物：上游引物：pcr-1(seqidno：40)：5’-ctcagagtgccttgcagggtgtatc-3’；下游引物：pcr-2(seqidno：41)：5’-ttgcggaaatccccatttagccagt-3’3’端引物：上游引物：pcr-3(seqidno：42)：5’-gcaaaggagcctgtcctgtgtttgaatg-3’；下游引物：pcr-4(seqidno：43)：5’-cgcaagcaccaagaggagatggaaa-3’如果重组载体插入正确，则应在5’和3’端分别有一条pcr条带，5’端引物产物长度应为1719bp，3’端引物产物长度应为1883bp。pcr反应体系和条件见表3、表4。表3pcr反应体系(20μl)10×缓冲液2μldntp(2mm)2μlmgso4(25mm)0.8μl上游引物(10μm)0.6μl下游引物(10μm)0.6μl鼠尾基因组dna200ngkod-plus-(1u/μl)0.6μl表4pcr扩增反应条件阳性f0小鼠的pcr鉴定结果见图7，结果表明：编号1、2的小鼠为阳性小鼠。2、f1代基因型鉴定将f0鉴定为阳性的小鼠与野生型c57bl/6小鼠交配得到f1代小鼠。对f1代鼠尾基因组dna进行pcr分析。pcr条件及引物同f0代基因型鉴定。pcr(图8)实验结果与预期相符，显示4只f1代小鼠(编号分别为f1-1、f1-2、f1-3、f1-4)均为阳性小鼠，表明使用本方法能构建出可稳定传代的tim-3人源化基因工程小鼠。应用southernblot对上述4只f1代阳性小鼠进行检测，确认是否存在随机插入。剪取鼠尾提取基因组dna，选用bamhi酶消化基因组，转膜，杂交。探针p1、p2分别位于3’同源臂外侧及5’同源臂片段上。探针合成引物如下：p1-f(seqidno：44)：5’-atgttcactccctgtcaactggttg-3’p1-r(seqidno：45)：5’-tctgctccacatgaccacaaagatg-3’p2-f(seqidno：46)：5’-cagagctgtccttggatttcccctg-3’p2-r(seqidno：47)：5’-gactgcaagcatgactcctctccca-3’野生型的c57bl/6小鼠基因组经p1、p2探针杂交均产生8.2kb的条带，制备成功的基因工程纯合子小鼠则分别产生4.0kb和4.3kb大小的条带，杂合子小鼠分别产生8.2kb+4.0kb和8.2kb+4.3kb大小的条带，不会有其它杂交条带产生。southernblot检测结果见图9。实验结果(图9)显示4只小鼠中，除编号为f1-3的小鼠外，其余3只小鼠均无随机插入，证实这3只小鼠(f1-1、f1-2、f1-4)为阳性杂合小鼠且不存在随机插入。这表明使用本方法能构建出可稳定传代，且无随机插入的b-htim-3人源化基因工程小鼠。3、人源化小鼠的表达情况分析选取1只阳性f1代杂合子小鼠，另选1只野生型c57bl/6小鼠作为对照，给小鼠腹腔注射7.5μg鼠cd3抗体，24h后取脾脏，用注射器尾部对脾脏进行研磨，过70μm细胞筛网，将过滤好的细胞悬液离心弃上清，加入红细胞裂解液，裂解5min后加入pbs溶液中和裂解反应，离心弃上清后用pbs清洗细胞1次，分别进行facs检测和rt-pcr检测。facs检测：用鼠(图10b、c)和人(图10e、f)tim-3荧光抗体进行细胞标记，即用鼠tim-3抗体(mtim3apc)和anti-mtcrβ及人tim-3抗体(htim3pe)和anti-mtcrβ对胞外蛋白同时进行染色，pbs清洗细胞1次，进行流式检测蛋白表达。流式分析结果(见图10)显示，与未经刺激对照组(10a，d)和经过鼠cd3抗体刺激脾脏中t细胞激活后的c57bl/6小鼠相比(10b，e)，人tim-3抗体检测到人源化小鼠脾脏内表达人源化tim-3蛋白的细胞(10c，f)；而在c57bl/6对照鼠的脾脏内未检测到表达人或人源化tim-3蛋白的细胞。rt-pcr检测：提取小鼠脾脏细胞rna，利用逆转录试剂盒逆转录成cdna，利用引物mtim-3rt-pcrf1(seqidno：48)：cctatctgccctgcagttac和mtim-3rt-pcrr1(seqidno：49)：ttcataagaccagggaactg扩增大小为259bp的鼠tim-3片段；利用引物htim-3rt-pcrf1(seqidno：50)：atctgccctgcttctacacc和htim-3rt-pcrr1(seqidno：51)：gcggaaatccccatttagcc扩增大小为164bp的人tim-3片段。pcr反应体系20μl，反应条件：95℃，5min；(95℃，30sec；60℃，30sec；72℃，30sec，35个循环)；72℃，10min；4℃保温。gapdh作为内参。实验结果显示(见图11)，野生型c57bl/6小鼠和f1代杂合子小鼠活化细胞中均可检测到鼠tim-3的mrna表达，f1代杂合子小鼠活化细胞中可检测到人源化tim-3的mrna表达。进一步的，将鉴定为阳性的f1代小鼠互相交配，可得到b-htim-3人源化基因工程小鼠纯合子。选取1只纯合的b-htim-3小鼠(6周龄)，另选2只野生型c57bl/6小鼠作为对照，给小鼠腹腔注射7.5μg鼠cd3抗体，24h后取脾脏，研磨后过70μm细胞筛网，将过滤好的细胞悬液离心弃上清，加入红细胞裂解液，裂解5min后加入pbs溶液中和裂解反应，离心弃上清后用pbs清洗细胞1次，分别进行facs检测和rt-pcr检测。facs检测：试验一：用鼠tim-3抗体mtim-3apc或人tim-3抗体htim-3pe对细胞直接进行染色，用pbs清洗细胞后，进行流式检测。流式分析结果(见图12)显示，用荧光标记的抗鼠tim-3抗体可检测到未经刺激和经过鼠cd3抗体刺激的小鼠c57bl/6脾脏内的非t非b细胞表达鼠源tim-3蛋白的细胞(见图12a、b)，纯合人源化小鼠脾脏内未检测到表达鼠tim-3蛋白的细胞(见图12c)；用荧光标记的人tim-3抗体检测到纯合人源化小鼠脾脏内的非t非b细胞表达人源化tim-3蛋白的细胞(见图12f)；而在c57bl/6对照鼠的脾脏内未检测到表达人或人源化tim-3蛋白的细胞(见图12d、e)。试验二：用鼠tim-3抗体mtim-3apc和鼠t细胞表面抗体mtcrβ或人tim-3抗体htim-3pe和鼠t细胞表面抗体mtcrβ对t细胞胞外蛋白同时进行染色，用pbs清洗细胞后，进行流式检测。流式分析结果(见图13)显示，用荧光标记的鼠tim-3抗体可检测到经过鼠cd3抗体刺激的c57bl/6小鼠脾脏内表达鼠tim-3蛋白的细胞(见图13b)，纯合人源化小鼠脾脏内未检测到表达鼠tim-3蛋白的细胞(见图13c)；用荧光标记的人tim-3抗体检测到纯合人源化小鼠脾脏内表达人源化tim-3蛋白的细胞(见图13f)；而在c57bl/6对照鼠的脾脏内未检测到表达人或人源化tim-3蛋白的细胞(见图13d、e)。rt-pcr检测：提取野生型c57bl/6小鼠和b-htim-3纯合子小鼠脾脏细胞的总rna，利用逆转录试剂盒逆转录成cdna后进行pcr分析；利用引物mtim-3rt-pcrf1(seqidno：48)和mtim-3rt-pcrr1(seqidno：49)扩增大小为259bp的鼠tim-3片段；利用引物htim-3rt-pcrf1(seqidno：50)和htim-3rt-pcrr1(seqidno：51)扩增大小为164bp的人tim-3片段。pcr反应体系20μl，反应条件：95℃，5min；(95℃，30sec；60℃，30sec；72℃，30sec，35个循环)；72℃，10min；4℃保温。gapdh作为内参。实验结果显示(见图14)，野生型c57bl/6小鼠活化细胞中可检测到鼠tim-3的mrna表达，纯合子小鼠活化细胞中可检测到人源化tim-3的mrna表达。以上检测表明本方法制备得到的tim-3基因改造人源化小鼠可以表达人源化tim-3蛋白，并被抗人抗体识别。该模型小鼠可用于抗人tim-3抗体的筛选和检测。实施例6基因敲除小鼠的鉴定由于cas9的切割造成双链断裂，同源重组的修复方式会随机产生插入/缺失突变，得到tim-3蛋白功能丧失的基因敲除小鼠。为此设计一对引物，分别位于5’端靶位点左侧和3’端靶位点右侧，序列如下：f：5’-caacagggcagccatagtttcctca-3’(seqidno：52)r：5’-cacatgtggaagctataccactgca-3’(seqidno：53)野生型小鼠应只有1条pcr条带，产物长度应为608bp，杂合子应还有1条pcr条带，产物长度应为约375bp。pcr反应体系及条件同实施例5，pcr结果参见图15，结果显示，编号为1、3、4的小鼠为阳性小鼠。实施例7双重人源化或多重人源化小鼠的制备及鉴定包含人源tim-3基因的小鼠(如利用本方法或制得的b-htim-3动物模型)还可以用于制备双重人源化或多重人源化动物模型。如，前述实施例4中，显微注射及胚胎移植过程使用的受精卵细胞选择来源于其它基因修饰小鼠的受精卵细胞进行注射，或对b-htim-3小鼠的受精卵细胞进行基因编辑，可以进一步得到tim-3人源化与其它基因修饰的双基因或多基因修饰的小鼠模型。另外，也可将本方法得到的b-htim-3动物模型纯合或杂合子与其它基因修饰纯合或杂合动物模型交配，对其后代进行筛选，根据孟德尔遗传规律，可有一定几率得到tim-3人源化与其它基因修饰的双基因或多基因修饰的杂合动物模型，再将杂合子相互交配可以得到双基因或多基因修饰的纯合子动物模型。以双重人源化tim-3/ctla-4小鼠的生成为例，由于小鼠tim-3与ctla-4基因不在同一条染色体上，可通过将b-htim-3小鼠与包含人源ctla-4基因的小鼠(如b-hctla-4小鼠)以自然交配或体外受精的方式进行繁殖，通过阳性子代小鼠的筛选和交配扩繁，最终得到双重tim-3/ctla-4小鼠。分别使用4对引物对双重人源化tim-3/ctla-4小鼠的鼠尾基因组dna进行pcr分析，具体序列及产物长度见表5，反应体系和条件见表6、7。多只双重人源化tim-3/ctla-4小鼠的鉴定结果见图16，其中图16a、b中编号为293、297、300、301、302、303、308的小鼠为ctla-4纯合子小鼠、编号为294、295、299、304、305、306的小鼠为ctla-4杂合子小鼠；图16c、d中编号为298、301、306的小鼠为tim-3纯合子小鼠、编号为294、295、296、300、302、304、308的小鼠为tim-3杂合子小鼠。综合两组结果表明，编号为301的小鼠为双基因纯合子，编号为300、302、308的小鼠为tim-3h/+/ctla-4h/h，编号为306的小鼠为tim-3h/h/ctla-4h/+，编号为294、295、304的小鼠为tim-3h/+/ctla-4h/+。表5序列及产物长度表6pcr反应体系2×mastermix10μl上游引物(10μm)0.5μl下游引物(10μm)0.5μl鼠尾基因组dna(100-200ng/20ml)2μlddh2o补至20μl表7pcr反应条件再以双重人源化tim-3/pd-1小鼠的生成为例，由于小鼠tim-3与pd-1基因不在同一条染色体上，可通过将b-htim-3小鼠与包含人源pd-1基因的小鼠(如b-hpd-1小鼠)以自然交配或体外受精的方式进行繁殖，通过阳性子代小鼠的筛选和交配扩繁，最终得到双重人源化tim-3/pd-1小鼠。分别使用4对引物对双重人源化tim-3/pd-1小鼠的鼠尾基因组dna进行pcr分析，具体序列及产物长度见表8，反应体系和条件见表6、7。多只双重人源化tim-3/pd-1小鼠的鉴定结果见图17，其中图17a、b中编号为6901～6916的小鼠为tim-3纯合子小鼠、图17c、d中编号为6901～6916的小鼠为pd-1纯合子小鼠，综合两组结果表明，编号为6901～6916的16只小鼠均为双基因纯合子。表8序列及长度进一步的对双重人源化tim-3/pd-1小鼠的表达情况进行检测。选取1只双重人源化tim-3/pd-1小鼠纯合子(7周龄)，另选2只野生型c57bl/6小鼠作为对照，小鼠腹腔注射7.5μg鼠cd3抗体，24h后取脾脏，研磨后过70μm细胞筛网，将过滤好的细胞悬液离心弃上清，加入红细胞裂解液，裂解5min后加入pbs溶液中和裂解反应，离心弃上清后用pbs清洗细胞1次，分别进行facs检测和rt-pcr检测。facs检测：按照实施例5中的方法检测双重人源化tim-3/pd-1小鼠体内的tim-3蛋白表达。用鼠源pd-1抗体mpd-1pe和鼠源t细胞表面抗体mtcrβ或人源pd-1抗体hpd-1fitc和鼠源t细胞表面抗体mtcrβ对t细胞胞外蛋白同时进行染色，用pbs清洗细胞后，进行流式检测pd-1蛋白表达。流式分析结果如图18、19显示，与未经刺激和经过鼠cd3抗体刺激脾脏中t细胞激活后的c57bl/6小鼠相比，人源tim-3抗体和人源pd-1抗体可以检测到人源化tim-3/pd-1纯合子小鼠脾脏内表达人源化tim-3和人源化pd-1蛋白的细胞；而在c57bl/6对照鼠的脾脏内未检测到表达人或人源化tim-3及人或人源化pd-1蛋白的细胞。rt-pcr检测：提取野生型c57bl/6小鼠和双人源化tim-3/pd-1纯合子小鼠脾脏细胞总rna，利用逆转录试剂盒逆转录成cdna，利用引物mtim-3rt-pcrf1(seqidno：48)和mtim-3rt-pcrr1(seqidno：49)扩增大小为259bp的鼠tim-3片段；利用引物htim-3rt-pcrf1(seqidno：50)和htim-3rt-pcrr1(seqidno：51)扩增大小为164bp的人tim-3片段；利用引物mpd-1rt-pcrf3：5’-cctggctcacagtgtcagag-3’(seqidno：64)，和mpd-1rt-pcrr3：5’-cagggctctcctcgattttt-3’(seqidno：65)扩增大小为297bp的鼠pd-1片段；利用引物hpd-1rt-pcrf3：5’-ccctgctcgtggtgaccgaa-3’(seqidno：66)，和hpd-1rt-pcrr3：5’-gcaggctctctttgatctgc-3’(seqidno：67)扩增大小为297bp的人pd-1片段。pcr反应体系20μl，反应条件：95℃，5min；(95℃，30sec；60℃，30sec；72℃，30sec，35个循环)；72℃，10min；4℃保温。使用gapdh作为内参。实验结果显示(见图20、21)，野生型c57bl/6小鼠活化细胞中可检测到鼠tim-3和pd-1的mrna表达，tim-3/pd-1纯合子小鼠活化细胞中可检测到人源化tim-3和人源化pd-1的mrna表达。实施例8b-htim-3基因人源化动物模型体内药效验证取b-htim-3纯合小鼠(4-8周)，皮下接种小鼠结肠癌细胞mc38(5×105/100μlpbs)，待肿瘤体积生长到约100mm3后根据肿瘤体积分为对照组或治疗组(n＝5/组)。治疗组随机选择3种抗人tim-3抗体(ab1、ab2、ab3)进行注射治疗，剂量为10mg/kg，对照组注射等体积的生理盐水。给药频率为每周给药2次，共给药6次。每周测量肿瘤体积2次并称量小鼠的体重，接种后单只小鼠肿瘤体积达到3000mm3时应执行安乐死结束试验。整体来看，实验过程中各组动物健康状态良好，在实验终点时(分组后第25天)，所有治疗组和对照组小鼠体重均出现增长，且在整个实验周期内小鼠体重和体重变化均无明显区别(图22、23)；但从肿瘤体积测量结果上看(图24)，对照组小鼠肿瘤在实验周期内均持续生长，而所有治疗组小鼠，与对照组相比肿瘤体积增长呈现不同程度的抑制和/或缩小。表明这3种抗人tim-3抗体未对动物产生明显毒性作用，安全性较好，且具有不同的体内抑制肿瘤效果。表9中列出了各个实验的主要数据和分析结果，具体包括分组时和分组后18天时的肿瘤体积、实验结束时(分组后第25天)的肿瘤体积、小鼠存活情况、无肿瘤小鼠(tumorfree)的情况、肿瘤(体积)抑制率(tumorgrowthinhibitionvalue，tgitv)以及治疗组与对照组的小鼠体重、肿瘤体积之间的统计学差异(p值)。表9肿瘤体积、存货存活情况及体积抑制率从表9可见，结合图22可知在实验终点时(分组后第25天)，各组动物体重均出现增长且无显著性差异(p＞0.05)，表明动物对3种抗人tim-3抗体耐受良好。从肿瘤体积测量结果来看，对照组(g1)平均肿瘤体积为2096±396mm3，治疗组平均肿瘤体积分别为563±168mm3(g2)、1326±420mm3(g3)、1540±376mm3(g4)，g2～g4治疗组小鼠肿瘤体积均明显小于对照组(g1)，tgitv分别为77.5％、38.9％、28.1％，表明抗人tim-3抗体ab1、ab2、ab3具有不同的抑制肿瘤生长效果，在相同的给药剂量和频次下，抗体ab1(g2)对肿瘤具有明显的抑制作用(tgitv＞60％)，抑瘤效果优于ab2、ab3抗体。由此证明不同的抗人tim-3抗体在b-htim-3小鼠体内表现出不同的抑制肿瘤生长能力，且抗体ab1抑制肿瘤的效果明显优于其它抗体，表现出较好的疗效，且均未对动物产生明显毒副作用，安全性较好。上述研究结果证明人源化tim-3动物模型可作为体内药效研究的活体模型，用于tim-3信号通路调节剂的筛选、评估和治疗实验，并可用于在动物体内评估靶向人tim-3抗体的有效性，以及评估靶向tim-3的治疗效果等。实施例9基于胚胎干细胞的制备方法采用其它基因编辑系统和制备方法也可以得到本发明的非人哺乳动物，包括但不限于基于胚胎干细胞(embryonicstemcell，es)的基因同源重组技术、锌指核酸酶(zfn)技术、转录激活子样效应因子核酸酶(talen)技术、归巢核酸内切酶(兆碱基大范围核酶)或其他分子生物学技术。本实施例以传统的es细胞基因同源重组技术为例，阐述如何采用其它方法制备获得tim-3基因人源化小鼠。根据本发明的基因编辑策略和人源化小鼠tim-3基因示意图(图4)，发明人设计了图25所示的打靶策略，图25中还显示了重组载体的设计。鉴于本发明的目的之一是将小鼠tim-3基因的第2号外显子全部或部分用人tim-3基因片段替换，为此，发明人设计了包含5’同源臂(3122bp)、3’同源臂(5000bp)和人源化基因片段(321bp)的重组载体，在重组载体上构建了用于阳性克隆筛选的抗性基因，如新霉素磷酸转移酶编码序列neo，并在抗性基因的两侧装上两个同向排列的位点特异性重组系统，如frt或loxp重组位点。进一步的，还在重组载体3’同源臂下游构建了具有负筛选标记的编码基因，如白喉毒素a亚基的编码基因(dta)。载体构建可采用常规方法进行，如酶切连接等。将构建正确的重组载体转染小鼠胚胎干细胞，如c57bl/6小鼠的胚胎干细胞，利用阳性克隆筛选标记基因对得到的重组载体转染细胞进行筛选，并利用southernblot技术进行dna重组鉴定。将筛选出的正确阳性克隆按照《小鼠胚胎操作实验手册(第三版)》中的方法将阳性克隆细胞(黑色鼠)通过显微注射进入已分离好的囊胚中(白色鼠)，注射后的嵌合囊胚转移至培养液中短暂培养，然后移植至受体母鼠(白色鼠)的输卵管，可生产f0代嵌合体鼠(黑白相间)。通过提取鼠尾基因组和pcr检测，挑选基因正确重组的f0代嵌合鼠用于后续繁殖和鉴定。将f0代嵌合鼠与野生型鼠交配获得f1代鼠，通过提取鼠尾基因组和pcr检测，挑选可以稳定遗传的基因重组阳性f1代杂合子小鼠。再将f1代杂合小鼠互相交配即可获得基因重组阳性f2代纯合子鼠。此外，可将f1代杂合鼠与flp或cre工具鼠交配去除阳性克隆筛选标记基因(neo等)后，再通过互相交配即可得到基因人源化纯合子小鼠。对获得的f1代杂合或f2代纯合鼠进行基因型和表型检测的方法与前述实施例5一致。以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。序列表<110>北京百奥赛图基因生物技术有限公司<120>人源化基因改造动物模型的制备方法及应用<130>1<160>67<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>23<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1tccttactttatagggtcattgg23<210>2<211>23<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2agtgtaactgcagggcagatagg23<210>3<211>23<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3ggaaaatgcttatgtgtttgagg23<210>4<211>23<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4tgtagatagagtgtaactgcagg23<210>5<211>23<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>5gttacactctatctacacctggg23<210>6<211>23<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>6cacataggcacaagtgccccagg23<210>7<211>23<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>7ctgaaattagacatcaaagcagg23<210>8<211>23<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>8atgtgactctggatgaccatggg23<210>9<211>23<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>9gatcataaagaatgtgactctgg23<210>10<211>23<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>10tccagcagataccagctaaaggg23<210>11<211>23<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>11ctaaagggcgatctcaacaaagg23<210>12<211>23<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>12tgttgagatcgccctttagctgg23<210>13<211>23<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>13gccctttagctggtatctgctgg23<210>14<211>18<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>14aaaatgcttatgtgtttg18<210>15<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>15taggaaaatgcttatgtgtttg22<210>16<211>18<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>16caaacacataagcatttt18<210>17<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>17aaaccaaacacataagcatttt22<210>18<211>17<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>18tgactctggatgaccat17<210>19<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>19taggtgactctggatgaccat21<210>20<211>17<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>20atggtcatccagagtca17<210>21<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>21aaacatggtcatccagagtca21<210>22<211>132<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>22gaattctaatacgactcactatagggggtcttcgagaagacctgttttagagctagaaat60agcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgct120tttaaaggatcc132<210>23<211>2725<212>dna/rna<213>小鼠(mouse)<400>23accattttaaccgaggagctaaagctatccctacacagagctgtccttggatttcccctg60ccaagtactcatgttttcaggtcttaccctcaactgtgtcctgctgctgctgcaactact120acttgcaaggtcattggaaaatgcttatgtgtttgaggttggtaagaatgcctatctgcc180ctgcagttacactctatctacacctggggcacttgtgcctatgtgctggggcaagggatt240ctgtccttggtcacagtgtaccaacgagttgctcagaactgatgaaagaaatgtgacata300tcagaaatccagcagataccagctaaagggcgatctcaacaaaggagacgtgtctctgat360cataaagaatgtgactctggatgaccatgggacctactgctgcaggatacagttccctgg420tcttatgaatgataaaaaattagaactgaaattagacatcaaagcagccaaggtcactcc480agctcagactgcccatggggactctactacagcttctccaagaaccctaaccacggagag540aaatggttcagagacacagacactggtgaccctccataataacaatggaacaaaaatttc600cacatgggctgatgaaattaaggactctggagaaacgatcagaactgctatccacattgg660agtgggagtctctgctgggttgaccctggcacttatcattggtgtcttaatccttaaatg720gtattcctgtaagaaaaagaagttatcgagtttgagccttattacactggccaacttgcc780tccaggagggttggcaaatgcaggagcagtcaggattcgctctgaggaaaatatctacac840catcgaggagaacgtatatgaagtggagaattcaaatgagtactactgctacgtcaacag900ccagcagccatcctgaccgcctctggactgccacttttaaaggctcgccttcatttctga960ctttggtatttccctttttgaaaactatgtgatatgtcacttggcaacctcattggaggt1020tctgaccacagccactgagaaaagagttccagttttctggggataattaactcacaaggg1080gattcgactgtaactcatgctacattgaaatgctccattttatccctgagtttcagggat1140cggatctcccactccagagacttcaatcatgcgtgttgaagctcactcgtgctttcatac1200attaggaatggttagtgtgatgtctttgagacatagaggtttgtggtatatctgcaaagc1260tcctgaacaggtagggggaataaagggctaagataggaaggtgaggttctttgttgatgt1320tgaaaatctaaagaagttggtagcttttctagagatttctgaccttgaaagattaagaaa1380aagccaggtggcatatgcttaacactatataacttgggaaccttaggcaggagggtgata1440agttcaaggtcagccagggctatgctggtaagactgtctcaaaatccaaagacgaaaata1500aacatagagacagcaggaggctggagatgaggctcggacagtgaggtgcattttgtacaa1560gcacgaggaatctatatttgatcgtagaccccacatgaaaaagctaggcctggtagagca1620tgcttgtagactcaagagatggagaggtaaaggcacaacagatccccggggcttgcgtgc1680agtcagcttagcctaggtgctgagttccaagtccacaagagtccctgtctcaaagtaaga1740tggactgagtatctggcgaatgtccatgggggttgtcctctgctctcagaagagacatgc1800acatgaacctgcacacacacacacacacacacacacacacacacacacacacacacacac1860acacacatgaaatgaaggttctctctgt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