一种七甲川菁类活性荧光探针及其制备方法与应用与流程

本发明涉及一种七甲川菁类活性荧光探针及其制备方法与应用，具体是一种斯托克斯位移大于100nm的适用于高灵敏蛋白、糖、dna等生物分子和纳米载体的荧光标记的荧光探针，进行细胞或活体水平荧光成像。

背景技术：

生物分子的荧光标记是继同位素标记后出现的快速方便的生物分子分析手段。随着生命科学的发展,迫切需要高灵敏度的分析检测方法。在医学上，以荧光技术为核心的酶促免疫分析法和荧光偏振免疫分析法已成为医学诊断的标准方法。在分子生物学上，利用激光共聚焦显微镜跟踪细胞内成分的位置和移动情况。此外，流式细胞仪以荧光技术为核心进行细胞的辨别和分类。随着纳米科技在医药领域的应用，利用靶向纳米荧光探针进行肿瘤诊断治疗成为研究的热点。荧光染料的开发是发展荧光分析技术的最具关键性的因素。

目前使用较多罗丹明类、荧光素类、bodipy类荧光染料，其最大吸收波长都在紫外可见区，而有些生物样品在这个区域有很强的吸收，荧光检测时造成很强的荧光背景，大大降低检测的灵敏度和准确度。多甲川菁染料的吸收和发射光谱区位于550-1200nm处(近红外荧光λem>600nm)，处于近红外区。相对于常规荧光探针(λem<600nm)而言,在近红外荧光光区,玻璃、聚丙烯酰胺凝胶基质和生物化学杂质的荧光背景很弱,信噪比高,背景干扰大大降低。而且它们有着很高的摩尔吸光系数和良好的荧光特性。并且由于散射光强度与波长的四次方成反比,随波长的增加,拉曼散射迅速减少,使散射干扰也大为降低，因此荧光检测的灵敏度很高。

七甲川菁染料作为非常重要的近红外荧光探针是生物医学应用的焦点，前人针对这类染料的光稳定性和水溶性差等问题进行了很多结构上的优化。主要总结如下：(1)两端以吲哚啉为芳香母核性能最好；(2)gaborpatonay等在甲川链上引入刚性的环己烯结构，解决甲川链延长导致的光稳定性下降的问题，并且增强荧光强度；(3)aswangger等在分子中引入磺酸基，提高稳定性和稳定性；(4)彭孝军等将七甲川染料中位用氮衍生物取代，使其在激发态发生分子内电荷转移效应，产生大斯托克斯位移，解决传统七甲川染料自淬灭问题。

但是，目前近红外长波七甲川吲哚荧光探针在生物荧光分析方面的应用依然纯在一些问题。

首先，能够通过化学反应进行荧光标记的七甲川菁荧光探针，通常带有羧基或琥珀酰亚胺活性酯，并且活性位点位于吲哚啉芳香母核上，整体为不对称结构，大大增加合成复杂性和分离提纯的难度。

其次，目前商业化七甲川荧光染料活性位点种类单一，不能满足蛋白、dna等生物活性分子，聚合物或无机纳米载体的标记需要。

再次，目前商业化的七甲川菁荧光探针价格昂贵，需要优化合成路线和提纯工艺。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种新型七甲川菁类活性荧光探针及其制备方法与应用，可以克服已有技术的缺陷。本发明是基于近红外长波的七甲川菁类荧光染料，选择吲哚啉为芳香母核提高了荧光强度，甲川链中间环己烯刚性桥连增强了稳定性，通过吲哚啉母核上磺酸基调控探针的水溶性。同时利用具有化学反应活性位点的氮衍生物在七甲川菁母体染料中位进行亲核取代，大大增大斯托克斯位移、活性化学基团便于多种类型物质荧光标记等优点，用于生物分子或纳米载体的荧光标记，将荧光光谱性能和细胞水平及活体水平上荧光成像作为研究重点。该荧光探针为对称结构，大大降低了合成的复杂性，简化了制备和提纯工艺，有利于降低成本。本发明可用作高灵敏蛋白、多糖、dna等生物分子和有机无机纳米载体标记的荧光探针，进行细胞水平和活体水平上的检测及成像。

本发明提供的七甲川菁类活性荧光探针结构通式如下：

通式中:

x＝ⅱ-ⅸ；

r1、r2＝(ch2)mch3、(ch2)noh、(ch2ch2o)pch3、ch2c6h5；

r3、r4＝h、so3h、so3na、so3k；

a-g＝2-8；

n、m、p＝1-10。

其中，a-g，n，m，p为相互独立的整数。

本发明提供的新型七甲川菁类活性荧光探针的制备方法是经过下述步骤：

1)首先，起始原料吲哚啉与烷基化试剂(碘乙烷或苄基溴)在氩气保护下，以甲苯为溶剂进行回流，发生季铵化反应，生成烷基取代的吲哚季铵盐中间体，其中吲哚啉与烷基化试剂的摩尔比为1:1.5-1:5；其次，以无水醋酸钠为催化剂，与2-氯-1-甲酰基-3-羟甲基环己烯在无水乙酸酐中进行缩合反应，反应温度为25-70℃，得到带有环己烯氯的七甲川3h-吲哚菁母体染料，结构式如下：

2)在氩气保护下，以无水甲醇为溶剂，n,n-二异丙基乙胺为缚酸剂，环己烯氯母体染料与含有不同化学反应活性位点的氮衍生物进行亲核取代反应，母体染料与氮衍生物的摩尔比为1:3，反应温度为40-70℃。反应完成后用无水乙醚沉淀，析出大量固体，以二氯甲烷/甲醇为洗脱液(v二氯甲烷：v甲醇＝20：1)，利用中压快速制备色谱纯化，得到目标染料。

其中，x、r1、r2、r3、r4的取值如上述定义。

本发明提供的新型七甲川菁类活性荧光探针具有大于100nm的斯托克斯位移，荧光量子产率最大值达0.4。吸收光谱与发生光谱没有镜像对称关系。与传统商业化cy7荧光探针相比，最大吸收波长蓝移近130nm。由于中位引入化学活性基团，通过化学反应对蛋白、糖、dna等生物分子或纳米载体进行荧光标记。在细胞水平和活体水平上的荧光成像，稳定性好，背景荧光低。因此，本发明可用作高灵敏蛋白、多糖、dna等生物分子和有机无机纳米载体标记的荧光探针，进行细胞水平和活体水平上的检测及成像。

本发明提供的新型七甲川菁类活性荧光探针具有许多优点：主要体现在三个方面：

首先，中位氮衍生物取代，由于氮原子上孤对电子具有供电子能力，使荧光探针激发态时发生分子内电荷转移，使新染料的斯托克斯位移大于100nm，对于实际应用具有重要意义。目前用于荧光分析技术的七甲川荧光探针斯托克斯位移一般为25nm左右，小斯托克斯位移的荧光染料吸收光谱与发射光谱有很大重叠，导致自淬灭，即部分发射光被自身吸收使荧光强度下降。另外，小斯托克斯位移还会造成荧光分析的测量误差。因为，小斯托克斯位移使激发光波长与荧光检测波长过于接近，激发波长易对荧光检测狭缝造成散射干扰。

其次，本发明的荧光探针引入马来酰亚胺、二硫键、叠氮、丙烯酰胺等化学活性基团，能够适用于多种生物分子或有机无机材料的荧光标记。

再次，本发明的荧光探针为对称结构，大大降低了合成的复杂性，简化了制备和提纯工艺，有利于降低成本。总之，本发明的此类七甲川菁类荧光探针，整合吲哚啉芳香母核提高荧光强度、刚性环己烯桥连提高探针稳定性、中位氮取代大大增大斯托克斯位移、活性化学基团便于多种类型物质荧光标记等优点，可用作高灵敏蛋白、多糖、dna等生物分子和有机无机纳米载体标记的荧光探针，进行细胞水平和活体水平上的检测及成像。

附图说明

图1为2-a-a荧光探针的紫外吸收和荧光发射光谱。

图2为聚合物纳米粒n-1和n-2荧光光谱。

图3为树突细胞(dcs)对n-1纳米粒的胞吞。

图4为n-1纳米粒活体成像。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步详细阐述本发明。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件以及手册中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件；所用的通用设备、材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1含环己烯氯桥连母体染料1-a合成

按照如下图所示的合成路线，合成含环己烯氯桥连母体染料1-a，具体步骤如下：

(1)中间体n-乙基-2,3,3-三甲基-3h-吲哚啉

在250ml的圆底烧瓶中加入2,3,3-三甲基-3h-吲哚啉(25ml,24.8g,156mmol)，分散于50ml无水甲苯中，滴加碘乙烷(30g,192mmol)无水甲苯溶液，在氩气保护下回流反应12h，停止加热后终止反应。过滤得到固体产物，用无水乙醚洗涤三次后真空干燥，得到粉色固体，产率79％。

(2)缩合剂2-氯-1-甲酰基-3-羟甲基环己烯的合成

冰浴条件下，在10ml无水二甲基甲酰胺中逐滴滴加10ml三氯氧磷，混合溶液在室温下搅拌30min后，逐滴滴加环己酮的10ml无水二甲基甲酰胺溶液(5.39g,20mmol)，滴加开始后溶液由无色立刻变为黄色。反应体系缓慢加热到60℃后反应3h，降至室温后倒入200g冰中，在4℃冰箱中静置24h，析出黄色固体，过滤后真空干燥，得到4.5g固体产物，产率75％。

(3)含环己烯氯桥连母体染料1-a合成及表征

将n-乙基-2,3,3-三甲基-3h-吲哚啉季胺盐(1.6g,5mmol)，2-氯-1-甲酰基-3-羟甲基环己烯(0.43g,2mmol)和无水乙酸钠(0.41g,5mmol)溶解于15ml乙酸酐中，反应体系在100℃条件下反应1h，停止加热降至室温。将反应溶液滴入200ml乙醚后析出大量固体，过滤后真空干燥得到粗产品。以二氯甲烷和甲醇为洗脱液，利用中压快速制备色谱分离(v二氯甲烷：v甲醇＝10:1)，得到0.87g固体产物，产率65％。¹hnmr(400mhz,dmso-d6):δ＝8.36(d,2h,ch)；7.40(d,2h,arh)；7.37(t,arh,2h)；7.37(t,2h,arh)；7.16(d,2h,arh)；6.25(d,2h,ch)；4.24(q,ch2,4h)；3.09(dd,2h,ch2)；2.85(dd,2h,ch2)；2.45(t,1h,ch,)；1.70(s,12h,ch3)；1.56(m,2h,ch2)；1.44(t,ch3,6h).ms(esi):m/zcalculated:512.26；found:512.35。

实施例2目标荧光探针2-a-a的合成及表征

在50ml圆底烧瓶中加入200mg母体染料1-a和1.5倍摩尔量的亲核试剂n-(3-氨基丙基)甲基丙烯酰胺盐酸盐和3.0倍摩尔量的dipea，用20ml无水甲醇分散，在50℃条件下避光反应12h，反应液降至室温后滴入200ml无水乙醚中，析出大量固体沉淀，过滤后真空干燥。以二氯甲烷/甲醇为洗脱液，利用中压快速制备色谱分离，得到2-a-a染料，产率75％。

荧光探针2-a-a,¹hnmr(400mhz,dmso-d6):δ＝8.73(s,1h,nh)；8.45(s,1h,nh)；8.36(d,2h,ch)；7.40(d,2h,arh)；7.37(t,arh,2h)；7.37(t,2h,arh)；7.16(d,2h,arh)；6.25(d,2h,ch)；5.72(s,1h,ch)；5.79(s,1h,ch)；4.24(q,ch2,4h)；3.85(t,2h,ch2)；3.18(t,2h,ch2)；3.09(dd,2h,ch2)；2.85(dd,2h,ch2)；2.45(t,1h,ch,)；1.98(s,3h,ch3)；1.88(q,2h,ch2)；1.70(s,12h,ch3)；1.56(m,2h,ch2)；1.44(t,ch3,6h).ms(esi):m/zcalculated:617.42；found:617.45。

实施例3目标荧光探针2-a-b的合成及表征

合成方法同实施例2，亲核试剂使用2-(2-吡啶基二硫基)乙胺盐酸盐。

荧光探针2-a-b,¹hnmr(400mhz,dmso-d6):δ＝8.73(s,1h,nh)；8.36(d,2h,ch)；8.25(s,1h,ch)；7.00-8.00(m,11h,arh)；6.25(d,2h,ch)；4.24(q,ch2,4h)；3.49(d,2h,ch2)；3.09(dd,2h,ch2)；2.85(dd,4h,ch2)；2.45(t,1h,ch,)；1.70(s,12h,ch3)；1.56(m,2h,ch2)；1.44(t,ch3,6h).ms(esi):m/zcalculated:661.34；found:661.42。

实施例4目标荧光探针2-a-c的合成

合成方法同实施例2，亲核试剂使用n-(2-氨乙基)马来酰亚胺盐酸盐。

荧光探针2-a-c,¹hnmr(400mhz,cdcl3):δ＝8.36(d,2h,ch)；7.86(s,2h,ch)；7.40(d,2h,arh)；7.37(t,arh,2h)；7.37(t,2h,arh)；7.16(d,2h,arh)；6.25(d,2h,ch)；4.24(q,ch2,4h)；3.58(t,4h,ch2)；3.09(dd,2h,ch2)；2.85(dd,2h,ch2)；2.45(t,1h,ch,)；1.70(s,12h,ch3)；1.56(m,2h,ch2)；1.44(t,ch3,6h).ms(esi):m/zcalculated:615.37；found:615.42。

实施例5荧光光谱测定

配制浓度为1×10^-6m的2-a-a溶液(溶剂为10mm磷酸缓冲溶液，ph＝7.4)，取染料溶液3ml置于石英比色皿中。利用紫外可见分光光度计测定吸收光谱并确定最大吸收波长。利用荧光分光光度计测定荧光发射光谱。如图1所示，2-a-a新荧光探针的吸收光谱相对于传统cy7染料发生明显蓝移和变宽；第二，新探针2-a-a吸收光谱与发射光谱失去镜像对称关系；第三，新探针2-a-a的斯托克斯位移达140nm，远大于普通商业化的cy7系列荧光染料。

实施例6荧光标记聚合物的合成

以端基为三硫酯的聚乙二醇为大分子链转移剂，利用可逆加成链转移自由基聚合(raft),引发甲基丙烯酸二异丙氨基乙酯(dpa)聚合和荧光探针2-a-a聚合，得到荧光标记的聚合物。其中，聚合物p-1中的荧光探针为2-a-a，聚合物p-2中的荧光探针为商业化的cy7。以thf为溶剂，利用紫外可见分光光度计和荧光分光光度计测定聚合物p-1的光谱性能。如图2所示，对比p-1和2-a-a的荧光光谱可以看出，通过直接自由基聚合的方法对聚合物进行荧光标记，不影响荧光探针的光谱性能，证明了2-a-a探针通过直接聚合方式标记聚合物的可行性。

实施例7所制备纳米粒的荧光性质

分别称取10mg聚合物p-1和p-2溶解于1ml四氢呋喃(thf)中，在磁力搅拌下逐滴滴加到10ml磷酸缓冲溶液中(ph＝7.4,10mm)，在避光条件下于通风厨中挥发thf，得到p-1和p-2相应的纳米粒n-1和n-2。纳米粒溶液浓度固定为1mg/ml，利用荧光分光光度计测定纳米粒溶液的荧光发射光谱。测定结果如图2所示。从图中可以看出，商业化的cy7荧光探针标记的纳米粒，由于斯托克斯位移小，包埋在n-2纳米粒的疏水内核中时发生严重自淬灭。相反的，本发明中制备的2-a-a荧光探针带有甲基丙烯酰胺基团，可以通过自由基聚合反应与单体共聚，直接一步得到荧光标记的聚合物；此外，所制备的2-a-a荧光探针的斯托克斯位移大于120nm，解决了自淬灭题，从而更有利于进行荧光检测分析。

实施例8n-1纳米粒的树突细胞胞吞

以含l0％胎牛血清(fbs；biochromag,germany)的dmem(sigma-aldrich,usa)为基础培养液，将细胞树突细胞(dc2.4)以1×10⁵个/ml细胞浓度接种于24孔板中，置于37℃、5％co2、饱和湿度条件下培养。细胞完全贴壁生长后，置换含有n-1纳米粒溶液的培养基。赋予4h后，用激光共聚焦显微镜观察纳米粒在细胞内的分布。从图3中可以看出，在细胞内可以观察到明亮的2-a-a探针的荧光信号，证明2-a-a荧光标记可以用于细胞水平上的荧光示踪。

实施例9n-1纳米粒活体成像

为了考察2-a-a荧光标记的纳米粒n-1在体内的分布，以皮下接种hepg2肿瘤的雌性balb/c裸鼠为动物模型进行实验。实验裸鼠来自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物实验严格按照中华人民共和国国家标准(gb/t16886.6-1997)实施。具体的，选取肿瘤体积约150mm³的裸鼠尾静脉注射n-1纳米粒pbs分散液后，在特定的时间点，利用活体成像仪检测纳米粒荧光信号的体内分布。如图4所示，

尾静脉注射后，在活体水平上可以明显观察到显著的荧光信号，随时间延长，在肿瘤组织的富集量明显增加，表明本发明制备的可聚合2-a-a荧光探针能够用于聚合物纳米粒的荧光标记及肿瘤的诊断。