一种通过转基因提高玉米抗旱性的方法与流程

本发明属于植物基因工程领域，具体涉及一种通过转基因调高玉米抗旱性的方法。

背景技术：

玉米是重要的粮食作物和饲料作物，也是全世界总产量最高的农作物。随着饲料与工业需求的增加，玉米需求呈强劲地增长态势，当前中国已从玉米净出口转变为玉米净进口。至2011年，玉米的播种面积已超过水稻，成为中国第一大农作物品种(王全忠等，2016)。玉米生长中需水量较大，在整个生长周期内，一般需要至少2500mm的降水量，而且生长期内的需水量变化很大，除苗期可适当干旱(蹲苗)外，从拔节到成熟都应保证良好的水分供应(王士谦，2005)。我国每年种植的玉米面积中，受到干旱影响的面积占了大约60％，造成减产20％-30％(高志勇等，2016)。因此通过玉米抗旱的遗传和生理基础研究，挖掘抗旱相关基因资源，培育高抗旱性玉米品系，对我国玉米生产具有重要意义。

染色质重塑是在维持基因组稳定性、染色质结构和表达调控中起关键作用。kim等通过染色质免疫共沉淀(chip)分析发现，干旱胁迫可诱导rd29a和rd29b基因启动子处核小体密度降低和h3k4me3与h3k9ac修饰的升高，而该区域包含一个关键的胁迫应答因子abre(aba-responsiveelement)的结合位点，促使胁迫应答转录因子如dreb、abre等迅速招募到基因启动子处，激活rd29a和rd29b基因表达；在盐胁迫时，dreb2a、rd29a和rd29b基因的组蛋白h3k9me2水平降低、h3k4me3水平升高，在从而调节了这些基因的表达，以适应胁迫环境(kimetal.，2008；kimetal.，2012)。相反的，在同样的条件下，这些相关位点的核小体定位(nucleosomeoccupancy)急剧下降(kimetal.，2010)，说明染色质重塑和组蛋白修饰需要密切的协调，从而调控基因表达(tightlycoordinatedtoregulategeneexpression)。

技术实现要素：

为解决上述问题，本发明提供了一种通过转基因调高玉米抗旱性的方法。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

一种通过转基因提高玉米抗旱性的方法，其特征在于，通过将chb101基因的编码区转入到玉米基因组中，在玉米叶片中诱导表达chb101基因，即然后利用ubi启动子组成型表达chb101基因，从而促进叶片气孔在干旱条件下快速闭合，有利于玉米植株保持水分，从而提高玉米的抗旱性，同时还不会影响玉米在正常水分条件下的生长发育，提高玉米的抗旱性。具体包括如下步骤：

s1、总rna的提取：

s11、取4叶期玉米叶片剪碎液氮研磨成粉，转入1.5ml离心管内，加入1mltrizol，充分混匀，室温放置5-10分钟后，加入rnaisoplus的1/5体积量的氯仿，盖紧离心管盖，用手剧烈振荡15秒(氯仿沸点低、易挥发，振荡时应小心离心管盖突然弹开)，待溶液充分乳化，无分相现象后，再室温静置5分钟；12,000g4℃离心15分钟；

s12、从离心机中小心取出离心管，此时匀浆液分为三层，即：无色的上清液、中间的白色蛋白层及带有颜色的下层有机相；吸取上清液转移至另一新的离心管中，切忌吸出白色中间层；

s13、向上清中加入等体积的异丙醇，上下颠倒离心管充分混匀后，在15～30℃下静置10分钟后，12,000g4℃离心10分钟，小心弃去上清，缓慢地沿离心管壁加入75％的乙醇1ml(切勿触及沉淀)，轻轻上下颠倒洗涤离心管管壁，12,000g4℃离心5分钟后小心弃去乙醇(为了更好地控制rna中的盐离子含量，应尽量除净乙醇)；

s14、室温干燥沉淀2～5分钟，使酒精完全挥发后，用10-15μldepc-h2o溶解rna，视沉淀量而定；

s2、反转录试剂盒购自invitrogen公司，实验操作如下：

s21、用dnasei处理rna，10μl反应体系包含：

dnasei1μl；

dnaseibuffer1μl；

rna10μg；

depc-h2oupto10μl；

轻轻混匀后瞬时离心，室温放置15min后，加入1μl25mm的edta，65℃处理10min，使dnasei失活；

s22、在冰上于pcr管中加入以下试剂：

0.5μg/μl的oligodtnv1μl；

10mm/each的dntps1μl；

去除dna的rna5μg；

depc-h2oupto12μl；

轻轻混匀后，65℃处理5min后，迅速转移到冰上冷却2min；

s23、在上述体系中加入：

5×rtbuffer4μl

0.1mdtt2μl

rnaseinhibitor1μl

37℃预热2min，加入m-mlvrtase1μl，37℃温浴50min，70℃处理15min，使酶失活后，反应产物加入40μl1×te稀释，充分混匀，保存于-30℃备用；

s3、以反转录产物为模板，通过pcr方法扩增获得玉米chb101基因，得克隆的chb101基因；对克隆的chb101基因进行测序，通过与chromdb数据库提供的chb101基因cds序列进行比较，发现我们克隆的chb101基因cds序列缺少33bp(即缺少序列表seqidno：1的1739-1771位置)。本发明中所述克隆的chb101基因cds序列全长为2349bp(序列表seqidno：2)，编码782个氨基酸组成的蛋白(序列表seqidno：3)，编码的蛋白带有swirm和sant保守结构域，以及一个zinc-binding结构域(如图1所示)；

s4、玉米染色质重塑蛋白基因chb101的过表达载体构建

在通用双元载体pcambia3301基础上改造获得的遗传转化载体；首先将玉米泛素基因(ubiquitin)启动子(序列表seqidno：4)通过saci和bamhi酶切位点插入pcambia3301中，得到改造遗传转化载体p3301-ubi(如图2所示)；对p3301-ubi载体用限制性内切酶sali和nhei进行酶切，去掉camv35s启动子和gus基因；将上述克隆所得的玉米chb101基因用sali和nhei消化并回收包含完成chb101阅读框的dna片段，在把该片段连入上一步的酶切后p3301-ubi载体，得到chb101基因的过表达载体p3301-ubi-chb101；

s5、利用pds-1000台式基因枪进行玉米(h99，以下也称为野生型玉米)幼胚转基因操作，具体步骤如下：

1)材料选取：根据授粉时间，取授粉后11天玉米h99种子的幼胚，此时玉米幼胚长约2mm；

2)冲洗玉米穗：加1滴tween20，在清水下浸泡、冲洗30min，然后用75％的乙醇泡30min，再用无菌水冲洗三遍；

3)预培养：将经过2)处理后的幼胚，胚轴向下，盾面向上，放在铺有滤纸(2x2cm)的含有愈伤组织诱导培养基n6e的培养皿中，30个幼胚/培养皿；缠好封口膜，置于培养箱，28℃，暗培养3天；得到预培养后幼胚；

4)高渗预培养：

将预培养后幼胚(即成形并膨大的幼胚，认为开始形成typeii愈伤组织)转入含有n6osm培养基的培养皿(直径3.5cm)中，28℃，暗培养，进行高渗处理8h，得到高渗预培养后幼胚；

5)载体处理

在高渗处理期间，灭菌holder和阻挡网，在金粉子弹中加入5μl已等摩尔比预混好的混合载体dna，混匀，准备好后放在冰上，得到包裹了质粒的金粉悬液；

6)将所得的高渗预培养后幼胚放入基因枪，在载体膜上滴加步骤5)得到的包裹了质粒的金粉悬液，基因枪真空度27～28psi，用650psi和1100psi可裂膜各轰击一次，可裂膜至靶点距离：6cm/9cm；得到轰击后幼胚；

7)将轰击后幼胚(在滤纸上)在n6som培养基上28℃再次高渗预培养20h，采用暗培养，得到轰击后高渗处理幼胚；

8)将轰击后高渗处理幼胚转移至无滤纸的n6e培养基上进行筛选培养，筛选培养条件为28℃暗培养14天，得到筛选培养幼胚；

10)将筛选培养幼胚转移至n6s培养基上传代培养，传代培养条件为28℃暗培养3周/次，共传代3次，得到愈伤组织(抗除草剂biolaphos)；

11)将愈伤组织(选择易碎的typeii愈伤组织，直径4mm以内)转移到分化诱导培养基rmi上进行分化培养，分化培养的条件为25℃，暗培养3周，得到生长出幼叶的成熟的体细胞胚；

12)将生长出幼叶的成熟的体细胞胚转移至rmii培养基中生根培养，生根培养条件为25℃18h光6h光照培养15天，光照强度为4000lux，即可长出幼苗；

13)待幼苗长到3cm以上，根系完整时，将幼苗从rmii培养基移栽到盛有土的纸杯中，25℃，光培养，每天观察土表面，待彻底干燥后浇水；当纸杯中幼苗长到25cm高时即可移栽到大盆中，撕掉纸杯，将土和苗一移栽倒花盆或者实验田里，得到250株t0代转基因玉米；将空载体pb7rwg采用同样的方法转入野生型玉米中，得到转空载体玉米。

其中，

所述愈伤组织诱导培养基n6e的按照如下方法制备：向n6基本培养基中添加终浓度为2.76g/l脯氨酸、终浓度为100mg/l肌醇、终浓度为2mg/l2，4-d、终浓度为100mg/l水解酪蛋白、终浓度为25um硝酸银、终浓度为30g/l蔗糖和终浓度为2.5g/l植物凝胶，用水补足体积，调节培养基ph值为5.8。

所述n6基本培养基具体组分及各组分的终浓度如下：硫酸铵463mg/l，硼酸1.6mg/l，无水氯化钙125.33mg/l，二水乙二胺四乙酸二钠37.25mg/l，七水硫酸铁27.85mg/l，无水硫酸镁90.37mg/l，一水硫酸锰3.3mg/l，碘化钾0.8mg/l，硝酸钾2830mg/l，磷酸钾400mg/l，七水硫酸锌1.5mg/l，甘氨酸2mg/l，烟酸0.5mg/l，盐酸吡哆醇0.5mg/l。

所述n6osm培养基配方及终浓度具体如下：n6基本培养基、0.69g/l脯氨酸、100mg/l肌醇、2mg/l2，4-d、100mg/l水解酪蛋白、36.4g/l山梨醇、36.4g/l甘露醇、29mg/l(25um)硝酸银、30g/l蔗糖、终浓度为2.5g/l植物凝胶；用水补足体积，调节培养基ph值为5.8。

所述混合载体dna的浓度为1μg/μl，载体的加入量为5μg；0.5mg金粉包裹5μg。其中，金粉与混合载体的质量比为100∶1；等摩尔比预混好的混合载体dna为按照摩尔比1∶1∶1∶1∶1混合的5种载体ptrauxbar、pgt1-bt2、pisa-sh2、pb1hor-sh1和phmw-gbssiia；

所述n6s培养基配方具体如下：n6基本培养基、100mg/l肌醇、2mg/l2，4-d、2mg/lbialaphos+6mg/l(5um)硝酸银、30g/l蔗糖、2.5g/l植物凝胶；用水补足体积，调节培养基ph值为5.8。

所述分化诱导培养基rmi具体配方如下：ms基本培养基、6-ba1mg/l、100mg/l肌醇、3mg/l双丙胺膦(bialaphos)、60g/l蔗糖、终浓度为3g/l植物凝胶；用水补足体积，调节培养基ph值为5.8。

所述ms基本培养基具体配方为：硝酸钾1900mg/l，硝酸铵1650mg/l，磷酸二氢钾170mg/l，七水硫酸镁370mg/l，二水氯化钙440，碘化钾0.83mg/l，硼酸6.2mg/l，四水硫酸锰22.3mg/l，七水硫酸锌8.6mg/l，二水钼酸钠0.25mg/l，五水硫酸铜0.025mg/l，六水氯化钴0.025mg/l，乙二胺四乙酸二钠37.25mg/l，七水硫酸亚铁27.85mg/l，甘氨酸2mg/l，盐酸硫胺素0.1mg/l，盐酸吡哆醇0.5mg/l，烟酸0.5mg/l；用水补足体积。

所述rmii培养基配方为：ms基本培养基、100mg/l肌醇、60g/l蔗糖、终浓度为3g/l植物凝胶；用水补足体积，调节培养基ph值为5.8。

本发明具有以下有益效果：

通过将chb101基因的编码区转入到玉米基因组中，可以在玉米叶片中诱导表达chb101基因，从而促进叶片气孔在干旱条件下快速闭合，有利于玉米植株保持水分，从而提高玉米的抗旱性，同时还不会影响玉米在正常水分条件下的生长发育。

附图说明

图1为本发明实施例中chb101结构域。

图2为本发明实施例中p3301-ubi图谱。

图3为本发明实施例中chb101相对表达量。

图4为本发明实施例中干旱胁迫生存率。

图5为本发明实施例中叶片失水率。

具体实施方式

为了使本发明的目的及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

玉米染色质重塑蛋白基因chb101的克隆

本实验室前期研究发现：玉米chb101基因的表达在干旱环境下显著上升，因此，我们利用已公布的chb101基因序列(chromdb数据库，http：//www.chromdb.org/)对现有玉米基因组公共数据库(https：//www.maizegdb.org/；

http：//ensembl.gramene.org/zea_mays/info/index？db＝core)进行同源性搜索比对分析，未发现在这两个公共数据库中注释有chb101基因。在chb101基因开放阅读框(orf)核苷酸长度为2382bp(序列表seqidno：1)，编码由793个氨基酸组成的swi3类染色质重塑蛋白。

根据chb101在chromdb数据库中的cds序列设计可以扩增全长orf的一对引物chb101-full-f(5’atgttcgaggccgtccga3’)和chb101-full-r(5’tcagctggtgggccgag3’)。为了用于chb101基因的过表达载体构建，在上述引物两端分别加入限制性内切酶酶切位点(sali和nhei)和保护性碱基，以获得载体构建用克隆引物chb101-clone-f和chb101-clone-r。

提取总rna所用的试剂trizol购自上海生工生物工程技术有限公司，具体操作如下：(1)取4叶期玉米叶片剪碎液氮研磨成粉，转入1.5ml离心管内，加入1mltrizol，充分混匀，室温放置5-10分钟。(2)向上述步骤1的匀浆裂解液中加入氯仿(rnaisoplus的1/5体积量)，盖紧离心管盖，用手剧烈振荡15秒(氯仿沸点低、易挥发，振荡时应小心离心管盖突然弹开)。待溶液充分乳化(无分相现象)后，再室温静置5分钟。(3)12,000g4℃离心15分钟。(4)从离心机中小心取出离心管，此时匀浆液分为三层，即：无色的上清液、中间的白色蛋白层及带有颜色的下层有机相。吸取上清液转移至另一新的离心管中(切忌吸出白色中间层)。(5)向上清中加入等体积的异丙醇，上下颠倒离心管充分混匀后，在15～30℃下静置10分钟。(6)12,000g4℃离心10分钟。一般在离心后，试管底部会出现沉淀。(7)小心弃去上清，缓慢地沿离心管壁加入75％的乙醇1ml(切勿触及沉淀)，轻轻上下颠倒洗涤离心管管壁，12,000g4℃离心5分钟后小心弃去乙醇(为了更好地控制rna中的盐离子含量，应尽量除净乙醇)。(8)室温干燥沉淀2～5分钟，使酒精完全挥发。用10-15μldepc-h2o溶解rna，视沉淀量而定。

反转录试剂盒购自invitrogen公司，实验操作如下：

(1)用dnasei处理rna，10μl反应体系包含：

dnasei1μl

dnaseibuffer1μl

rna10μg

depc-h2oupto10μl

轻轻混匀后瞬时离心，室温放置15min.，之后加1μl25mmedta，65℃处理10min.，使dnasei失活。

(2)在冰上于pcr管中加入以下试剂：

oligodtnv(0.5μg/μl)1μl

dntps(10mm/each)1μl

去除dna的rna5μg

depc-h2oupto12μl

轻轻混匀后，65℃处理5min.，之后迅速转移到冰上冷却2min。

(3)在上述体系中加入：

5×rtbuffer4μl

0.1mdtt2μl

rnaseinhibitor1μl

37℃预热2min，加入m-mlvrtase1μl，37℃温浴50min.后，70℃处理15min.使酶失活。

(4)反应产物加入40μl1×te稀释，充分混匀，保存于-30℃备用。

以反转录产物为模板，通过pcr方法扩增获得玉米chb101基因，扩增条件：

对克隆的chb101基因进行测序。通过与chromdb数据库提供的chb101基因cds序列进行比较，发现我们克隆的chb101基因cds序列缺少33bp(即缺少序列表seqidno：1的1739-1771位置)。本发明中克隆的chb101基因cds序列全长为2349bp(序列表seqidno：2)，编码782个氨基酸组成的蛋白(序列表seqidno：3)，编码的蛋白带有swirm和sant保守结构域，以及一个zinc-binding结构域(如图1所示)。

实施例2

玉米染色质重塑蛋白基因chb101的过表达载体构建

本发明所用载体是在通用双元载体pcambia3301基础上改造获得的遗传转化载体。首先将玉米泛素基因(ubiquitin)启动子(序列表seqidno：4)通过saci和bamhi酶切位点插入pcambia3301中，得到改造遗传转化载体p3301-ubi(如图2所示)。对p3301-ubi载体用限制性内切酶sali和nhei进行酶切，去掉camv35s启动子和gus基因。将实施例1中克隆的玉米chb101基因用sali和nhei消化并回收包含完成chb101阅读框的dna片段，在把该片段连入上一步的酶切后p3301-ubi载体，得到chb101基因的过表达载体p3301-ubi-chb101。

实施例3

基因枪法介导的玉米遗传转化与鉴定

利用pds-1000台式基因枪进行玉米(h99，以下也称为野生型玉米)幼胚转基因操作，具体步骤如下：

1)材料选取：根据授粉时间，取授粉后12天玉米h99种子的幼胚，此时玉米幼胚长约1.8mm；

2)冲洗玉米穗：加1滴tween20，在清水下浸泡、冲洗30min，然后用75％的乙醇泡30min，再用无菌水冲洗三遍；

3)预培养：将经过2)处理后的幼胚，胚轴向下，盾面向上，放在铺有滤纸(2x2cm)的含有愈伤组织诱导培养基n6e的培养皿中，30个幼胚/培养皿；缠好封口膜，置于培养箱，28℃，暗培养3天；得到预培养后幼胚；

愈伤组织诱导培养基n6e的按照如下方法制备：向n6基本培养基中添加终浓度为2.76g/l脯氨酸、终浓度为100mg/l肌醇、终浓度为2mg/l2，4-d、终浓度为100mg/l水解酪蛋白、终浓度为25um硝酸银、终浓度为30g/l蔗糖和终浓度为2.5g/l植物凝胶，用水补足体积，调节培养基ph值为5.8。

n6基本培养基具体组分及各组分的终浓度如下：硫酸铵463mg/l，硼酸1.6mg/l，无水氯化钙125.33mg/l，二水乙二胺四乙酸二钠37.25mg/l，七水硫酸铁27.85mg/l，无水硫酸镁90.37mg/l，一水硫酸锰3.3mg/l，碘化钾0.8mg/l，硝酸钾2830mg/l，磷酸钾400mg/l，七水硫酸锌1.5mg/l，甘氨酸2mg/l，烟酸0.5mg/l，盐酸吡哆醇0.5mg/l。

4)高渗预培养：

将预培养后幼胚(即成形并膨大的幼胚，认为开始形成typeii愈伤组织)转入含有n6osm培养基的培养皿(直径3.5cm)中，28℃，暗培养，进行高渗处理8h；得到高渗预培养后幼胚；

n6osm培养基配方及终浓度具体如下：n6基本培养基、0.69g/l脯氨酸、100mg/l肌醇、2mg/l2，4-d、100mg/l水解酪蛋白、36.4g/l山梨醇、36.4g/l甘露醇、29mg/l(25um)硝酸银、30g/l蔗糖、终浓度为2.5g/l植物凝胶；用水补足体积，调节培养基ph值为5.8。

5)载体处理

在高渗处理期间，灭菌holder和阻挡网，在金粉子弹中加入5μl已等摩尔比预混好的混合载体dna，混匀，准备好后放在冰上，得到包裹了质粒的金粉悬液。

混合载体dna的浓度为1μg/μl，载体的加入量为5μg；0.5mg金粉包裹5μg(金粉与混合载体的质量比为100∶1)。等摩尔比预混好的混合载体dna为按照摩尔比1∶1∶1∶1∶1混合的5种载体ptrauxbar、pgt1-bt2、pisa-sh2、pb1hor-sh1和phmw-gbssiia。

6)将4)得到的高渗预培养后幼胚放入基因枪，在载体膜上滴加5)得到的包裹了质粒的金粉悬液，基因枪真空度27～28psi，用650psi和1100psi可裂膜各轰击一次，可裂膜至靶点距离：6cm/9cm；得到轰击后幼胚；

7)将轰击后幼胚(在滤纸上)在n6som培养基上28℃再次高渗预培养20h，采用暗培养，得到轰击后高渗处理幼胚；

8)将轰击后高渗处理幼胚转移至无滤纸的n6e培养基上进行筛选培养，筛选培养条件为28℃暗培养14天，得到筛选培养幼胚；

10)将筛选培养幼胚转移至n6s培养基上传代培养，传代培养条件为28℃暗培养3周/次，共传代3次，得到愈伤组织(抗除草剂biolaphos)。

n6s培养基配方具体如下：n6基本培养基、100mg/l肌醇、2mg/l2，4-d、2mg/lbialaphos+6mg/l(5um)硝酸银、30g/l蔗糖、2.5g/l植物凝胶；用水补足体积，调节培养基ph值为5.8。

11)将愈伤组织(选择易碎的typeii愈伤组织，直径4mm以内)转移到分化诱导培养基rmi上进行分化培养，分化培养的条件为25℃，暗培养3周，得到生长出幼叶的成熟的体细胞胚；

分化诱导培养基rmi具体配方如下：ms基本培养基、6-ba1mg/l、100mg/l肌醇、3mg/l双丙胺膦(bialaphos)、60g/l蔗糖、终浓度为3g/l植物凝胶；用水补足体积，调节培养基ph值为5.8。

ms基本培养基具体配方为：硝酸钾1900mg/l，硝酸铵1650mg/l，磷酸二氢钾170mg/l，七水硫酸镁370mg/l，二水氯化钙440，碘化钾0.83mg/l，硼酸6.2mg/l，四水硫酸锰

22.3mg/l，七水硫酸锌8.6mg/l，二水钼酸钠0.25mg/l，五水硫酸铜0.025mg/l，六水氯化钴0.025mg/l，乙二胺四乙酸二钠37.25mg/l，七水硫酸亚铁27.85mg/l，甘氨酸

2mg/l，盐酸硫胺素0.1mg/l，盐酸吡哆醇0.5mg/l，烟酸0.5mg/l；用水补足体积。

12)将生长出幼叶的成熟的体细胞胚转移至rmii培养基中生根培养，生根培养条件为25℃18h光6h光照培养15天，光照强度为4000lux，即可长出幼苗；

rmii培养基配方为：ms基本培养基、100mg/l肌醇、60g/l蔗糖、终浓度为3g/l植物凝胶；用水补足体积，调节培养基ph值为5.8。

13)待幼苗长到3cm以上，根系完整时，将幼苗从rmii培养基移栽到盛有土的纸杯中，25℃，光培养，每天观察土表面，待彻底干燥后浇水；当纸杯中幼苗长到25cm高时即可移栽到大盆中，撕掉纸杯，将土和苗一移栽倒花盆或者实验田里，得到250株t0代转基因玉米。

将空载体pb7rwg采用同样的方法转入野生型玉米中，得到转空载体玉米。

2、转基因玉米的鉴定

(1)bar检测试剂盒检测

为了初步检测转基因是否成功，采用美国envirologix公司试剂盒quickstix^tmkitfor(bar)cottonleaf&seed对basta筛选的250株t0代转基因玉米进行检测：

a.用试剂盒中disposabletissueextractortube的管盖和管帽夹住t0代转基因玉米的叶片，取下一个或两个圆形的叶片组织，用试剂盒中自带的研杵将叶片组织推入锥形管底部，装有样品的管用防水记号笔标记好；

b.将研杵插入盛有组织的管内，通过旋转研杵研磨叶片组织，持续20至30秒，直至叶片组织磨的足够碎；

c.向管内加入0.5mlextractionbuffer；

d.继续用研杵棒捣碎叶片，使捣碎的叶片组织与extractionbuffer充分混匀；

e.拿出研杵棒，将试纸条插入混匀的extractionbuffer和叶片组织中检测，等待一分钟左右，观察反应结果。

应用试剂盒对经过basta筛选的112株t0代转基因植株进行检测，两条带为阳性，只有一条说明是阴性；得到12株bar基因阳性t0代转基因玉米。

(2)转基因植株的bar基因pcr分析

为了进一步检测转基因是否成功，根据除草剂筛选标记bar基因设计了特异引物。引物序列为：上游引物p1：5’-gcaccatcgtcaaccactacatc-3’

下游引物p2：5’-agctgccagaaacccacgt-3’

以12株bar基因阳性t0代转基因玉米基因组dna为模板，用p1和p2为引物进行pcr扩增，得到433bp扩增产物为阳性，进一步证明得到12株bar基因阳性t0代转基因玉米。

3)实时荧光定量rt-pcr

将上述12个经鉴定bar检测试剂盒和pcr检测后阳性的t0代转基因玉米的胚乳分别提取rna，反转录得到cdna作为模板，用如下引物对分别进行real-timepcr，检测chb101基因表达情况。以转空载体玉米和野生型玉(h99)为对照。

chb101基因的实时荧光定量rt-pcr的检测引物为5’-ggcacgcaacgcctacgact和

5’-agcccgatgacagcgaccac；

内参基因使用玉米actin1基因，引物为

5’-cctgaagatcaccctgtgct和5’-gcagtctccagctcctgttc。

结果如图3所示，说明12株转基因阳性t0代玉米中(oe-1至oe-12)，有6个chb101基因表达超过野生型玉米(wt)的2倍以上，而转空载体玉米和野生型玉米无显著差异。

通过上述方法初步证明玉米chb101基因表达盒已转入玉米基因组中，并超量表达。

实施例4

过表达chb101基因玉米的抗旱性分析

发明人依据chb101基因表达水平，对于过表达chb101成功的转基因玉米，选择chb101基因表达最高的两个转基因系，即oe-2和oe-3进行自交繁殖，获得纯合株系(t2代除草剂筛选不再分离)。然后对t3代oe-2和oe-3转基因系进行抗旱能力检测。玉米种子用1％浓度的次氯酸钠浸泡消毒5min，用去离子水洗3次，每次1分钟。将种子放在湿润滤纸上28℃下促进发芽。3天后将发芽的种子种到土(泥炭土∶蛭石＝1∶1)中，温室内培养，16小时光照26℃，8小时黑暗20℃，相对湿度为70％。对于测量干旱胁迫下的生存率，生长至15天的玉米幼苗停止浇水15天，然后重新浇水，2天后测量生存率。结果发现相对于wt，oe-2和oe-3的生存率提高(如图4)。

为了检测过表达chb101对玉米叶片失水的影响，我们取四叶期玉米的第4片叶放入洁净平皿中，将平皿置于干燥的人工气候箱中(25℃，相对湿度30％)进行脱水，在0h，1h，2h，3h和8h时分别测量叶片鲜重，计算相对失水率。结果发现相对于wt，oe-2和oe-3的失水率明显下降(如图5)。

上述结果表明，过表达玉米chb101基因可以减少干旱条件下玉米叶片失水率，从而提高玉米的抗旱性。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。