特异性人源基因片段及检测其的引物、探针和应用的制作方法

本发明属于药代动力学的生物检测技术领域，特别涉及一种特异性人源基因片段及其引物、探针和应用。

背景技术：

pcr技术自1985年正式诞生以来，很快便得到了生命科学界的普遍认同。经过几十年的不断改进，pcr方法从一种定性的分析方法发展到定量检测，从原先只能扩增几个kb的基因到目前已能扩增长达几十个kb的dna片段。到目前为止，pcr技术已有十几种之多，已然成为遗传与分子生物学的根本性基石。在众多技术中，当属1996年问世的实时荧光定量pcr(qpcr)技术应用最为广泛，是当今世界用于临床的最先进核酸分子诊断技术，被美国fda承认并推崇。

qpcr的模板定量有两种策略，即相对定量与绝对定量。相对定量通常采用在pcr反应体系中加入过量sybr荧光染料，从而保证荧光信号的增加与pcr产物的增加完全同步，因此又称为sybrgreeni法；绝对定量通常利用taqman探针，使每扩增一条dna链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与pcr产物的形成完全同步，故又称为taqman探针法；同时，由于绝对定量需要结合标准质粒绘制的标准曲线进行定量，因此是一种采用外标准曲线定量的方法。外标准曲线的定量方法相比sybrgreeni法，是一种准确和值得信赖的科学方法。利用标准曲线的qpcr是迄今为止定量最准确，重现性最好的定量方法，已得到全世界的公认，广泛应用于基因表达研究、转基因研究，药物疗效考核、病原体监测等诸多领域。

近年来，随着生命医学领域的研究逐渐深入，将(干)细胞应用于临床前的研究越来越多，但相应的检测技术并未完全跟上研究的需求。针对将人源(干)细胞移植入实验动物体内进行临床前的治疗研究，对于移植后的细胞在实验动物体内的残留及归巢情况尚无精准可靠的检测手段。现有的检测系统主要存在着下述缺陷：一、标准质粒构建流程繁琐：一般均需要中间质粒进行扩增，或者克隆后需要酶切回收才能连接目的载体；二、标准质粒构建效率不够高：通过靶序列与目的载体连接构建的标准质粒经常有较高的非特异性连接产物；三、对于标准质粒的摩尔分子量计算不够精准：通常利用所构质粒碱基数乘以atcg四种碱基的平均分子量估算而来；四、标准曲线的绘制不够精确：对于标准质粒的稀释倍数不够，绘制标准曲线所用标准品偏少(一般只有5个左右)；五、经常选用的人源特异基因alu为多拷贝，且在不同部位的拷贝数略有不同，不能很好的与细胞量对应；同时，由于alu多拷贝序列较短，不适宜设计相应的引物探针，难以运用qpcr进行绝对定量。

技术实现要素：

本发明的第一个目的在于找到一段人源特异的基因片段，在此基础上设计出特异性的引物与探针，使其能够在混有其他动物细胞的样品中特异性的定量检测出人源细胞。

本发明的第二个目的在于寻求一种更加简便高效的标准质粒构建方法，为绝对定量时精准快捷地绘制标准曲线奠定基础。

本发明的第三个目的是在上述两个主要目的的基础上，通过对多个步骤进行优化，使其灵敏度高，特异性好且可重复，最终形成一种可用于特异性定量检测人源基因组片段的系统性方法，实现2017年12月发布的《细胞治疗产品研究与评价技术指导原则(试行)》文件中对药代动力学的检测技术。

本发明的技术方案如下：

本发明首先在ncbi网站genome下载获取某个基因在基因组上的全长序列，然后利用ncbi网站上blast功能与常用实验动物的基因序列分析比对，获得人源特异性较高的基因片段；其次，利用软件premierprimer5在人源特异的基因片段中设计特异的引物与探针，包含两端引物及其间的碱基序列即为后期检测的靶序列(目的片段)；待设计好的引物探针经合成验证理想后，即可将目的片段克隆出来、跑胶回收并连接到目的载体上构建成标准质粒；再次，利用测序无误的标准质粒绘制标准曲线，初测检测限及灵敏度是否达标；最后，将qpcr仪器检测获得的待测样品的ct值代入标准曲线，即可换算出待测样品中人源细胞(基因片段)的含量。至此，除个别步骤需要优化外，用于特异性定量检测人源细胞基因片段的系统性方法已基本完成。

一种特异性人源基因片段，所述的基因片段包括seqidno.1所示的碱基序列。

本发明还公开了一种特异性检测上述的人源基因片段的引物、探针。

优选为，所述的引物包括seqidno.2所示的primer-f的碱基序列和seqidno.3所示的primer-r的碱基序列，所述的探针包含seqidno.4所示的probe的碱基序列。因此，针对含有其他动物细胞的混合样品，seqidno.1&2所示引物既可对其进行是否含有人源细胞的定性分析，也可借助如seqidno.3所示特异性探针对其含有的人源细胞进行定量检测。

本发明还公开了一种利用上述的人源基因片段或上述引物构建的标准质粒。

优选为，所述的标准质粒为将上述的人源基因片段直接连接到全式金公司e-bluntzero载体上。

优选为，所述的标准质粒为利用上述引物克隆得到包括seqidno.1所示的碱基序列，再直接连接到全式金公司e-bluntzero载体上。

其中，e-bluntzero(t5)载体作为已知具体碱基序列的无须酶切的目的载体。

本发明还公开了一种定量检测待测样品所含人源基因片段含量的方法，包括以下步骤：

(1)获得上述标准质粒的精确相对分子质量，将标准质粒按照拷贝数从10^10逐级10倍稀释至10^0，获得11个标准样，然后利用该标准样绘制标准曲线；

(2)用qpcr定量检测待测样品，将检测得到的数据代入标准曲线中，即得到待测样品所含人源基因片段的含量。

与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

通过实验验证，本发明的一种用于特异性定量检测人源基因组片段的系统性方法，具有高特异性，强灵敏度，重复性好，精确度高等优点，最大的特点在于极特异的引物探针既可定性也可以定量检测人源细胞的含量，且是第一个已知的将商品化e-bluntzero(t5)载体应用于简单高效的标准质粒构建中，既能节省时间也可降低成本，该方法在多步骤进行了优化，使得检测更加精确且灵敏；同时，通过精确计算标准质粒的相对分子质量与标准样的拷贝数，最终达到了最低检测限在10^1时，标准曲线的r^2＝0.9994的极佳检测效果。

当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有优点。

附图说明

图1为实施例1候选基因在基因组上的全长序列检索示意图；

图2为实施例1候选基因在不同物种中的序列差异比对示意图；

图3为实施例1选取人源特异性较高的基因片段示意图；

图4为实施例2理论分析引物与探针特异性时输入示意图；

图5为实施例2理论分析引物与探针特异性时勾选不同属性示意图；

图6为实施例2理论分析引物特异性所得检索结果示意图；

图7为实施例2理论分析探针特异性所得检索结果示意图；

图8为实施例2检测引物、探针的溶解曲线示意图；

图9为实施例2检测引物、探针特异性的验证结果示意图；

图10为实施例3精准计算标准质粒相对分子质量的示意图；

图11为实施例3特异性定量检测人源基因组片段时的标准曲线示意图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应该理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不用于限定本发明的保护范围。在实际应用中本领域技术人员根据本发明做出的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。

实施例1特异性人源基因片段的获取

1.1目的基因全长序列的获取

在ncbi网站的子网站genome中搜索人源可能较为特异的基因名称，如图1所示，点击genbank即可获取目的基因在不同物种的基因组上的全长序列。

1.2目的基因在不同物种间的比对

同样在ncbi网站上利用其子网站blast中的核酸比较功能，分别输入不同物种同一目的基因在基因组上的序列，如图2所示，比对分析后即可获取目的基因在不同物种间的序列差异信息。

1.3特异性人源基因片段的选取

在1.2的比对分析基础上，找寻人源基因与其他动物基因序列差异最大的区域，如图3所示，若该区域的gc碱基含量适于设计合适的引物及匹配的探针，则这段基因序列可被选为最终的目的片段，即靶序列seqidno.1所示的碱基序列。

实施例2引物探针的设计合成与验证

2.1人源特异的引物探针的设计

利用软件premierprimer5，在选取的目的片段上设计出高质量的引物探针。一般性原则为，引物序列在18-25bp，tm值在50-60℃，gc含量在40-60％；相应的探针在靠近引物的一端，tm值较引物高10℃左右。

2.2人源特异的引物探针的理论分析

首先，将设计好的一对引物输入ncbi网站子网站blast下属的primerblast中，如图4所示，然后，选取待检测引物的属性，如在基因组上，哪些物种等等，如图5所示；点击getprimer即可获得检测结果，可见在众多动物种属中，设计好的引物只能特异性识别人源基因组序列，并克隆出121bp的片段，如图6所示；同理，输入一条引物与设计好的探针检测发现，探针也只能特异性识别人源基因组序列，如图7所示，且探针的tm值比引物的高出十多度(61.84>49.40℃)。

2.3人源特异的引物探针的合成与验证

在2.2中理论分析证明设计的引物探针足够特异后，即可进行引物探针的合成。合成的引物探针溶解曲线良好，如图8所示，进而开展实验验证引物探针的特异性。实验结果表明，合成的引物探针可以特异检测到含有人源基因组片段的阳性对照样品h和含有人源细胞的待检样品n，如图9所示，且在空白对照h2o和阴性对照大鼠(r)和食蟹猴(m)样品中未检测到人源基因组片段。

实施例3标准质粒的构建及标准曲线的绘制

3.1构建含有靶序列的标准质粒：

实施例2中理论分析及实验检测结果证实，靶序列可用于特异性检测人源细胞(基因组片段)，因此，可将靶序列连接到目的载体上构建成标准质粒。

3.1.1合成引物：

sense：gtaggtcgtatattggattg，即seqidno.2所示的primer-f的碱基序列。

anti-sense：aggtgtgtttaatgtagc，即seqidno.3所示的primer-r的碱基序列。

3.1.2克隆靶序列(bio-radpcr仪器)：

反应体系：primestarmax(25ul)/5umolprimers(f+r)2ul/humangenomedna(200ng)/h2oupto50ul

反应条件：98℃5min，98℃15s，49℃30s，72℃20s，12℃forever，36cycles

3.1.3跑胶切胶与胶回收:

跑胶切胶：120v跑胶30min，紫外下切取含目的片段的凝胶

胶回收：利用天根凝胶回收试剂盒回收目的条带：gtaggtcgtatattggattgaatactttgtcagggttaggaggccccacctctgcaaagatgacttggagacaggtcctcttgtcctgcttcttggccatgatgctacattaaacacacct，即seqidno.1所示的碱基序列。

目的条带的反向互补序列为：

aggtgtgtttaatgtagcatcatggccaagaagcaggacaagaggacctgtctccaagtcatctttgcagaggtggggcctcctaaccctgacaaagtattcaatccaatatacgacctac

3.1.4连接转化涂板扩增菌落：具体的载体信息及操作步骤详见：

http://www.basic.northwestern.edu/biotools/oligocalc.html

peasy-bluntzerocompletesequence(完整序列)

3.1.5测序检测构建的标准质粒是否包含靶序列：

m13f：5'-gtaaaacgacggccagt-3'目录号：gj101-01

m13r：5'-caggaaacagctatgac-3'目录号：gj101-11

测序结果：l60105_l236155a_t-sp-1_m13f.seq

由测序结果可见，构建的标准质粒含有完整无误的靶序列(划线部分)

ccatatagtggggcggattgaatttagcggccgcgaattgcccttaggtgtgtttaatgtagcatcatggccaagaagcaggacaagaggacctgtctccaagtcatctttgcagaggtggggcctcctaaccctgacaaagtattcaatccaatatacgacctacaagggcaattcgtttaaacctgcaggactagtccctttagtgagggttaattctgagcttggcgtaatcatggtcatagctgtttcctgtgtgaaattgttatccgctcacaattccacacaacatacgagccggaagcataaagtgtaaagcctggggtgcctaatgagtgagctaactcacattaattgcgttgcgctcactgcccgctttccagtcgggaaacctgtcgtgccagctgcattaatgaatcggccaacgcgcggggagaggcggtttgcgtattgggcgctcttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcatagctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgt

3.2计算标准质粒摩尔质量并绘制标准曲线

利用oligonucleotidepropertiescalculator精确计算标准质粒的分子量，即将peasy-bluntzero载体序列与靶序列组成的标准质粒完整序列输入网址：http://biotools.nubic.northwestern.edu/oligocalc.html，如图10所示。

可自动计算获取标准质粒如下信息：

分子量＝2519122.5(g/mol)

若标准质粒初始浓度为100ng/ul＝1*10^-7g/ul

则每微升拷贝数为：1*10^-7g/ul÷2519122.5g/mol*6.02*10^23copies/mol*1ul≈2.4*10^10(copies/ul)

将初始标准质粒sp0以10倍逐级稀释方式获得系列标准品。如取5ulsp0加入45ulddh2o中充分混匀得标准品sp1，取5ulsp1加入45ulddh2o中充分混匀得标准品sp2，如此逐级稀释直至获得标准品sp10；则各级标准品的拷贝数量级分别为10^10,10^9,10^8,…,10^1,10^0，标准品的稀释及绘制标准曲线选用的标准品数量可调整。

实施例4一种用于特异性定量检测人源细胞基因片段的系统性方法在检测中的实际应用

4.1各样品基因组的抽提

首先，利用takaradna抽提试剂盒bloodgenomedna9750和takaraminibestuniversal9765，分别从人源细胞(作为阳性对照)，大鼠细胞(作为阴性对照)，食蟹猴血液(作为阴性对照)以及注射过人源细胞的食蟹猴样品(各组织器官与血液)中抽提基因组dna。

4.2进行qpcr实验：

反应体系：premixextaq(probeqpcr)10ul/10umolprimerf0.4ul/10umolprimerr0.4ul/5umolprobe0.8ul/roxreferencedye(50*)0.4ul/dnas5ul/ddh2o6ul

反应条件：95℃3min，95℃10s，55℃10s，72℃20s，40cycles

样品：以大鼠，食蟹猴基因组为阴性对照；以h2o为空白对照；293t，羊膜干细胞为阳性对照；残留有人源细胞的食蟹猴血液及各组织器官基因组为待检测样品

实验检测表明，最低检测限在10^1数量级时，如图11所示，标准曲线仍可达到r^2＝0.9994的水平，待检测样品在可检测限之内且可保证灵敏度与特异性。

综上，本发明以ncbi网站为前期特异基因序列检索及比对的基础，并利用premierprimer5软件设计获取人源特异性引物及探针；将包含经过验证后的taqman探针与引物序列的目的片段连接到e-bluntzero(t5)载体上，成功构建为标准质粒；利用与探针配套的qpcr试剂盒结合标准质粒，可以特异性的定量检测出待检样品中的人源细胞含量。本发明方法的最大特点在于探针与引物以其极强的特异性，可对混有其他动物来源的样品进行人源细胞的定性乃至定量检测；也是已知的首次将t5载体用于标准质粒的构建，既能节省时间也可降低成本；同时，该方法在多步骤进行了优化，使得检测更加精确且灵敏。

以上公开的本发明优选实施例只是用于帮助阐述本发明。优选实施例并没有详尽叙述所有的细节，也不限制该发明仅为所述的具体实施方式。显然，根据本说明书的内容，可作很多的修改和变化。本说明书选取并具体描述这些实施例，是为了更好地解释本发明的原理和实际应用，从而使所属技术领域技术人员能很好地理解和利用本发明。本发明仅受权利要求书及其全部范围和等效物的限制。

sequencelisting

<110>上海丽坤生物科技股份有限公司

<120>特异性人源基因片段及检测其的引物、探针和应用

<130>2017

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<170>patentinversion3.5

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<212>dna

<213>humanspecies

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tgacttggagacaggtcctcttgtcctgcttcttggccatgatgctacattaaacacacc120

t121

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