一种大豆组织特异性启动子GmFTL5及其应用的制作方法

本发明涉及分子生物学，具体地说，涉及一种大豆组织特异性启动子gmftl5及其应用。

背景技术：

启动子是rna聚合酶特异性识别和结合的dna序列，它是基因的一个组成部分，调节基因的转录起始时间和表达程度。目前，根据调节基因表达水平，启动子可分为三种类型：组成型启动子、组织特异型启动子和诱导型启动子。组成型启动子在所有组织中表达，它不依赖于环境因素和发育过程。组成型启动子驱动的表达通常不受内源因素的影响，在不同物种中都有较强的活性。组织特异性的启动子在某个特异的组织中表达。就植物而言，组织特异性的启动子可以在植物的特定组织如维管系统、光合组织、根、种子或生殖器官等启动目的基因表达。诱导型启动子不受内源因素影响，但受光、热、冷和创伤等环境条件和外在刺激控制。诱导型启动子还可受一些激素、乙醇或抗生素等诱导启动目的基因表达。

目前为止，已有大量的组织特异性启动子被分离出来，其中包括叶片特异性启动子、韧皮部特异性启动子、块茎特异性启动子、根特异性启动子、花特异性启动子、果实特异性启动子和种子特异性启动子。如花粉发育有关的组织特异性启动子如ta29(marianietal.1990)、lat52(twelletal.1990)、osg6b(yokoietal.1997)和zm13(hamiltonetal.1992)等已有详细研究报道；ubc6启动子主要在花和种子中表达(wattsetal.1994)；苯丙氨酸解氨酶(phenylalanineammonialyase,pal)基因启动子在萼片、花药和心皮中表达(ohletal.1990)、香豆素辅酶a连接酶(4coumarat:coenzymealigase,4cl)基因启动子(hauffeetal.1991)和查尔酮合成酶(chalconesynthase,chs)基因启动子(koesetal.1990)能够有效驱动gus在花瓣中表达。这些启动子都能特异启动目标基因的表达，改变特异组织器官的发育。但在大豆的花萼、花瓣、花药和花粉粒中特异性表达的启动子鲜有报道。

开花是植物从营养生长向生殖生长的关键转变，包括开花诱导、花的发端和花器官发育三个阶段，受众多基因调控。在拟南芥中ft(floweringlocust)基因是成花素重要元件，在诱导植物开花的过程中起着重要的作用，然而大豆中ft有10个同源基因，这些基因功能冗余或是否存在功能分化尚未知晓，因此有必要研究和获得调控大豆ft同源基因的启动子序列，从而为深入研究大豆成花过程及其它发育过程提供有效手段和途径。

技术实现要素：

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种来自大豆的组织或器官特异性启动子gmftl5，从而为在各种作物、林木、蔬菜、花卉、牧草等植物的花萼、花瓣、花药和花粉粒中特异性表达目标基因提供有效途径。

为了实现本发明的目的，本发明的技术方案如下：

本发明首先提供一种大豆组织特异性启动子gmftl5，其核苷酸序列为下列i)～iv)项之一：

i)seqidno.1所示的核苷酸序列；

ii)seqidno.1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且具有相同功能的核苷酸序列；

iii)在严格条件下与seqidno.1所示序列杂交且具有相同功能的核苷酸序列，所述严格条件为在含0.1％sds的0.1×sspe或含0.1％sds的0.1×ssc溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜；

iv)与i)、ii)或iii)的核苷酸序列具有90％以上同源性且具有相同功能的核苷酸序列。

所述启动子在花萼、花瓣、花药和花粉粒中表现出组织特异性。

应当理解的是，本领域技术人员可根据本发明公开的启动子序列，在不影响其活性的前提下，取代、缺失和/或添加一个或几个核苷酸，得到所述启动子gmftl5的突变序列。例如，将第65位的c取代为t、将第2441位的a取代为g、将第3006位的t取代为c、将第9006位的t取代为g。

本发明进一步提供了含有所述启动子gmftl5的表达盒、载体、转基因细胞系和工程菌。

其中，所述转基因细胞系包括不具备分生能力的细胞系。

携带有所述启动子和目的基因的表达载体可通过使用ti质粒、植物病毒载体、直接dna转化、微注射、电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞中(weissbach，1998，methodforplantmolecularbiologyviii，academypress，newyork，第411-463页；geiserson和corey，1998，plantmolecularbiology，2^ndedition)。

本发明进一步提供了所述启动子gmftl5在调控下游基因表达中的应用。在本发明的具体实施方式中，采用gus基因作为目的基因作示例性说明。具体为：将启动子gmftl5与gus基因重组至表达载体中，并将启动子gmftl5构建到gus基因的上游；将获得的植物表达载体gmftl5pro::gus转化至大肠杆菌dh5α中扩繁。通过农杆菌介导转化方法，将gmftl5pro::gus转入模式植物拟南芥，获得转化gmftl5pro::gus的拟南芥2株；通过gus活性分析表明，gmftl5启动子在植物的花萼、花瓣、花药和花粉粒特异性表达，可用于包括各种作物、林木、蔬菜、花卉、牧草等在内的各种植物的花萼、花瓣、花药和花粉粒中特异性表达目标基因。

基于本发明所述启动子gmftl5可在花萼、花瓣、花药和花粉粒中中特异性表达，并调控下游目标基因进行表达。本发明还提供了所述启动子gmftl5在制备转基因植物中的应用，以及所述启动子gmftl5在植物花及根发育调节中的应用。

本发明所述植物包括但不限于拟南芥和大豆。

本发明所述特异性启动子gmftl5是采用分段克隆的方法从大豆中克隆得到的，共使用4对特异性引物进行pcr扩增，包括(seqidno.2-9)：

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本发明的有益效果至少包括：

本发明首次公开了大豆花萼、花瓣、花药和花粉粒特异性启动子gmftl5，利用启动子gmftl5在拟南芥中过表达gus基因，结果表明启动子gmftl5可明显提高植物花萼、花瓣、花药和花粉粒中gus基因的表达量，因而，gmftl5启动子在植物花萼、花瓣、花药和花粉粒中具有特异性，适合在各种作物、林木、蔬菜、花卉、牧草等植物的花萼、花瓣、花药和花粉粒中特异性表达目标基因。

附图说明

图1为本发明实施例1中大豆特异启动子gmftl5的pcr扩增结果；其中，a为4对引物的扩增区段示意图，b为4对引物pcr扩增的琼脂糖凝胶电泳结果；a和b中，①、②、③和④(或1、2、3和4)分别对应于引物gmftl5-1-f/r、gmftl5-2-f/r、gmftl5-3-f/r和gmftl5-4-f/r。

图2为本发明实施例1中入门载体pec的结构示意图。

图3为本发明实施例2中入门载体gec的结构示意图。

图4为本发明实施例2中表达载体bdv2的结构示意图。

图5为本发明实施例2中gmftl5pro::gus转化拟南芥在花萼(e-1)、花瓣(e-2)、花药(e-3)、柱头(e-4)和花粉粒(e-5)中的表达结果。a-e，不同时期的花。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。实施例均按照常规实验条件，如sambrook等分子克隆实验手册(sambrookj&russelldw,molecularcloning:alaboratorymanual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

本实施例用于说明大豆花萼、花瓣、花药和花粉粒特异性启动子gmftl5的获得过程。

利用如下4对引物从大豆基因组中分段pcr扩增并酶切连接至入门载体pec(图2)(见wangetal.,bmcplantbiology:biovector,aflexiblesystemforgenespecific-expressioninplants)，测序获得总长度为9939bp的gmftl5启动子，如图1所示，其核苷酸序列如seqidno.1所示。

所用引物序列如下：

gmftl5-1-f：5’-ctgacagtcgacgaatgatgttggttt-3’

gmftl5-1-r：5’-agttgaatccaagagtcg-3’；

gmftl5-2-f：5’-ctcatgtttggacactag-3’

gmftl5-2-r：5’-gttcctaatagactgacgag-3’；

gmftl5-3-f：5’-cctaaagagtggaagacc-3’

gmftl5-3-r：5’-tagaccaccgtgacaat-3’；

gmftl5-4-f：5’-cacatatagtagaccat-3’

gmftl5-4-r：5’-acatcttgcgcagaaggagacagtggaaact-3’。

pcr扩增体系为20μl：

pcr反应程序：94℃5min；98℃10sec，55℃15sec，72℃2min30sec，共25个循环；72℃10min。

实施例2

本实施例以gus基因作为目的基因，用于说明本发明所述的大豆特异性启动子gmftl5在调控下游目的基因表达中的应用。

pcr克隆得到gmftl5启动子后，通过酶切连接至入门载体pec，同时将gus基因酶切连接至另一入门载体gec，采用gateway重组克隆的方法(invitrogen)，通过lr反应将启动子及gus基因重组至表达载体bdv2上。入门载体gec、表达载体bdv2见xuwetal.,bmcplantbiology:biovector,aflexiblesystemforgenespecific-expressioninplants。质粒gec、bdv2的结构分别如图3、图4所示。获得双元表达载体gmftl5pro::gus；将植物表达载体gmftl5pro::gus转化至大肠杆菌dh5α中扩繁。大肠杆菌感受态细胞的转化方法包括：(1)制备含氨苄青霉素的lb固体培养基；(2)取出贮存于-80℃的感受态细胞，冰浴中融化后，加入2μl质粒轻轻混匀，冰浴中放置30min；(3)42℃热激30s，然后立即置于冰浴中3min；加入800μl不含抗生素的lb液体培养基，37℃摇床振荡培养1h(160rpm)；(4)取适量培养液均匀涂于选择性培养基上，37℃倒置培养16h，用灭菌牙签挑取5-10个(或更多)菌落，置于200μl选择性液体lb培养基中摇菌培养；(5)pcr检测筛选到的阳性克隆。通过农杆菌介导转化方法，将gmftl5pro::gus转入拟南芥，获得转化gmftl5pro::gus的拟南芥2株；通过gus活性分析表明，gmftl5启动子在植物的花萼、花瓣、花药和花粉粒特异性表达(图5)，可用于包括各种作物、林木、蔬菜、花卉、牧草等在内的各种植物的花萼、花瓣、花药和花粉粒中中特异性表达目标基因。

拟南芥gus染色方法如下：

(1)将组织样品加入90％丙酮中，置于冰上20～30分钟；

(2)经丙酮处理后，用50mm磷酸缓冲液(ph7.2)、2mmk4fe[cn]6及2mmk3fe[cn]6溶液润洗组织；

(3)将样品放在x-gluc染色液(50mm磷酸缓冲液(ph7.0),1mmx-gluc,2mmk4fe[cn]6,2mmk3fe[cn]6)中，抽气10分钟，然后37℃染色过夜；

(4)次日用70％乙醇脱色；

(5)在载玻片上加几滴hcg溶液，将脱色后的样品置于其中；

(6)压片，透明15分钟或者过夜透明(根据组织的发育时期而定)。

x-gluc染色液的配制如下：

①20mmx-gluc母液的配制：

可用dmso或n,n-二甲基甲酰胺溶解。100mgx-gluc(mw＝521.8)用9.58mldmso溶解,得到的母液浓度为20mm。

②50mm磷酸缓冲液(ph7.0)的配制如下：

a液：nah2po4·2h2o3.12g溶于无菌蒸馏水，定容至100ml；

b液：na2hpo4·12h2o7.17g溶于无菌蒸馏水，定容至100ml；

取39mla液与61mlb液混合，即得50mm磷酸缓冲液。

③染色液的配制：5mm铁氰化钾；5mm亚铁氰化钾；10mmedta；50mm磷酸缓冲液；1mmx-gluc。

应当理解的是，对上述实施例所用试剂或原料的用量进行等比例扩大或者缩小后的技术方案，与上述实施例的实质相同。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110>中国农业科学院作物科学研究所

<120>一种大豆组织特异性启动子gmftl5及其应用

<141>2017-12-18

<160>9

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>9939

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

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