本发明属于多肽液相合成技术领域，具体涉及一种环肽药物alaptide的液相合成方法。
背景技术：
alaptide又称cpa，是一种环亮氨酸和丙氨酸的环肽，作为一种化学药物，曾用于治疗皮肤疾病，在消炎和抗菌化学领域有着积极的治疗作用。当前临床三期研究表明，alaptide在上呼吸道疾病的治疗方面有着很大的潜力，同时，对高血压病人的血压也有积极的治疗潜力。cpa可作为脑功能改善促智药物，它的许多衍生物具有明显增强记忆的活性，可延长雌鼠的记忆保留时间。
呼吸窘迫综合征是指肺内、外严重疾病导致以肺毛细血管弥漫性损伤、通透性增强为基础，以肺水肿、透明膜形成和肺不张为主要病理变化，以进行性呼吸窘迫和难治性低氧血症为临床特征的急性呼吸衰竭综合征。属于急性肺损伤的严重阶段或类型，临床试验显示，环肽alaptide对呼吸窘迫综合征有着积极的治疗作用。
阻塞性睡眠呼吸暂停(osa)是高血压患者的一种非常普遍的疾病。肾素-血管紧张素-醛固酮系统(raas)在血压控制中起着核心作用。血管紧张素-离子拮抗剂losartan是一种有效的降压药物。然而，有些病人对这种药物的反应比其他病人更糟，这是一种临床实践，要么增加剂量，要么增加另一种药物。临床试验显示，环肽alaptide的注入，可以有效缓解osa患者的病情，同时，在注入alaptide后，患者的血压持续平稳降低，达到一个理想的检测结果。
gb2127807a公开了一种alaptide的液相合成方法，该方法采用cbz保护的丙氨酸和l-环亮氨酸的甲酯，用n,n′-二环己基碳二亚胺缩合成直线二肽，采用钯/碳氢化，脱去cbz基团，在甲苯体系回流得到alaptide。该方法合成成本较高，且alaptide收率仅为39％。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题在于提供一种低成本、高收率、易规模化的液相合成环肽alaptide的方法。
解决上述技术问题所采用的技术方案由下述步骤组成：
1、将l-环亮氨酸(h-cycloleucine-oh)与二碳酸二叔丁酯进行氨基端保护反应，得到n-叔丁氧羰基-l-环亮氨酸(boc-cycloleucine-oh)。
2、以甲醇为溶剂，将丙氨酸(h-ala-oh)与二氯亚砜或草酰氯反应，生成丙氨酸甲酯的盐酸盐(h-ala-ome·hcl)。
3、采用液相合成法，将boc-cycloleucine-oh与n-羟基丁二酰亚胺(hosu)、n,n′-二环己基碳二亚胺(dcc)反应得到活化酯，再与h-ala-ome·hcl在碳酸钠水溶液或碳酸氢钠水溶液中进行缩合反应，得到n-叔丁氧羰基-环亮氨酰丙氨酸甲酯(boc-cycloleucine-ala-ome)。
4、脱除boc-cycloleucine-ala-ome的boc保护基，然后在碱性条件下使氨基和羧酸酯基进行环合反应，得到环肽alaptide。
上述步骤1中，所述氨基端保护反应的具体方法为：将h-cycloleucine-oh溶于四氢呋喃与水的混合溶液或二氯甲烷与水的混合溶液中，加入碳酸钠或碳酸钾，在5～15℃条件下滴加二碳酸二叔丁酯，滴加完后常温反应5～8小时，过滤掉难溶物，减压脱除四氢呋喃或二氯甲烷，用柠檬酸调节ph为3～4，萃取、盐洗、干燥、脱除溶剂，得到boc-cycloleucine-oh；其中所述h-cycloleucine-oh与碳酸钠或碳酸钾、二碳酸二叔丁酯的摩尔比优选1:1.5～2.5:1.3～2.0。
上述步骤2的具体操作方法为：将h-ala-oh溶于甲醇中，在0～5℃条件下滴加二氯亚砜或草酰氯，滴加完后在0～10℃条件下反应1～2小时，然后自然升至室温反应6～8小时，旋干，得到h-ala-ome·hcl，其中h-ala-oh与二氯亚砜或草酰氯的摩尔比优选1:2～3。
上述步骤3中，所述缩合反应的具体方法为：以四氢呋喃为溶剂，将boc-cycloleucine-oh与n-羟基丁二酰亚胺(hosu)、n,n′-二环己基碳二亚胺(dcc)在-5～10℃条件下反应3～8小时，然后加入h-ala-ome·hcl和碳酸钠水溶液或碳酸氢钠水溶液，常温反应6～10小时，分离纯化，得到boc-cycloleucine-ala-ome；其中所述boc-cycloleucine-oh、hosu、dcc、h-ala-ome·hcl、碳酸钠或碳酸氢钠的摩尔比优选1:1～1.3:1.1～1.5:1～2:3～5。
上述步骤4中，采用hcl-乙酸乙酯或hcl-1,4-二氧六环体系脱除boc保护基。
上述步骤4中，所述的碱性条件是指ph＝9～11，其优选通过碳酸钠、碳酸氢钠、n-甲基吗啉、n,n′-二异丙基乙胺或n-甲基吡咯烷酮调节。
本发明的有益效果如下：
1、本发明采用boc策略，将n端boc保护的l-环亮氨酸和丙氨酸甲酯的盐酸盐经缩合成n端boc保护的环亮氨酰丙氨酸甲酯，再脱除boc保护基，在碱性条件下使氨基和羧酸酯基进行环合反应，得到环肽alaptide，中间体不需要经过柱层析纯化，相对于传统的合成方法，氨基酸用量少，避免了较为昂贵树脂的使用和高毒溶剂哌啶的使用，合成成本较低，易于规模化，对环境压力小。
2、本发明将h-cycloleucine-oh的n端采用boc保护，避免了较为昂贵且危险的钯碳和高毒性溶剂甲苯的使用，保护基便于脱除，反应条件温和，易于操作，且alaptide收率可达到73％以上。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进一步详细说明，但本发明的保护范围不仅限于这些实施例。
实施例1
1、在500ml单口瓶中加入12.9g(0.1mol)h-cycloleucine-oh、100ml四氢呋喃、150ml水，搅拌至固体溶解后加入21.2g(0.2mol)碳酸钠，然后在5～15℃条件下缓慢滴加35ml(0.15mol)二碳酸二叔丁酯，滴加完后常温反应6小时，tlc显示反应完全，过滤掉难溶物，减压脱除四氢呋喃，用柠檬酸调节ph＝3后用乙酸乙酯萃取(100ml×3次)，有机相经饱和食盐水洗涤、无水硫酸钠干燥后，减压脱除溶剂，得到20gboc-cycloleucine-oh。
2、在500ml单口瓶中加入17.8g(0.2mol)h-ala-oh、200ml甲醇，搅拌至固体溶解，在0～5℃条件下滴加29ml(0.4mol)氯化亚砜，滴加完后在0～10℃条件下反应2小时，然后自然升温至室温反应7小时，旋干溶剂，得到24gh-ala-ome·hcl。
3、在1l单口瓶中加入20g(0.087mol)boc-cycloleucine-oh、500ml四氢呋喃、11g(0.095mol)hosu、26.8g(0.130mol)dcc，在-5～5℃条件下反应7小时，tlc显示反应完全，过滤掉不溶物，向滤液中加入20g(0.143mol)h-ala-ome·hcl、30g(0.360mol)碳酸氢钠、80ml蒸馏水，常温搅拌反应8小时，tlc显示反应完全，过滤掉难溶杂质，旋干溶剂，加入200ml蒸馏水和300ml乙酸乙酯，萃取有机相，有机相经饱和食盐水洗涤、无水硫酸钠干燥后旋干溶剂，得到27gboc-cycloleucine-ala-ome。
4、在1l反应瓶中加入27gboc-cycloleucine-ala-ome、500ml乙酸乙酯，在0～10℃下持续通入hcl气体，搅拌反应4小时，旋干得到油状物，加入500ml四氢呋喃、40mln-甲基吗啉，使体系ph为9～10，常温反应8小时，旋干溶剂，加入200ml乙酸乙酯和200ml0.5mol/l的hcl水溶液，萃取分液，有机相经饱和食盐水洗涤、无水硫酸钠干燥后减压脱溶，加入甲基叔丁基醚于-4℃冷冻6小时以上，有固体析出，过滤，用300ml甲基叔丁基醚打浆洗涤，过滤，真空干燥，得到14.2g环肽alaptide，收率为78％。
实施例2
1、在500ml单口瓶中加入19.3g(0.15mol)h-cycloleucine-oh、100ml二氯甲烷、200ml水，搅拌至固体溶解后加入41g(0.3mol)碳酸钾，在5～10℃条件下缓慢滴加51ml(0.22mol)二碳酸二叔丁酯，滴加完后常温反应6小时，tlc显示反应完全，过滤掉难溶物，减压脱除二氯甲烷，用柠檬酸调节ph＝3后用乙酸乙酯萃取(100ml×3次)，有机相经饱和食盐水洗涤、无水硫酸钠干燥后，减压脱除溶剂，得到31gboc-cycloleucine-oh。
2、在500ml单口瓶中加入17.8g(0.2mol)h-ala-oh、200ml甲醇，搅拌至固体溶解，在0～5℃条件下滴加34ml(0.4mol)草酰氯，滴加完后在0～10℃条件下反应2小时，然后自然升温至室温反应7小时，旋干溶剂，得到28gh-ala-ome·hcl。
3、在1l单口瓶中加入31g(0.135mol)boc-cycloleucine-oh、500ml四氢呋喃、17g(0.148mol)hosu、41.2g(0.2mol)dcc，在0～10℃条件下反应4小时，tlc显示反应完全，过滤，向滤液中加入25g(0.18mol)h-ala-ome·hcl、38g(0.45mol)碳酸氢钠、100ml蒸馏水，常温搅拌反应8小时，tlc显示反应完全，过滤掉难溶杂质，旋干溶剂，加入200ml蒸馏水和300ml乙酸乙酯，萃取有机相，有机相依次经0.5mol/l的盐酸水溶液洗涤、饱和食盐水洗涤、无水硫酸钠干燥后脱除溶剂，得到40gboc-cycloleucine-ala-ome。
4、在1l反应瓶中加入40gboc-cycloleucine-ala-ome、500ml1,4-二氧六环，在0～10℃条件下持续通入hcl气体，在0～5℃条件下搅拌5小时后脱除溶剂，旋干得到油状物，加入500ml四氢呋喃、50mln-甲基吗啉，使体系ph为9～10，常温反应8小时，旋干溶剂，加入200ml乙酸乙酯和200ml0.5mol/l的hcl水溶液，萃取分液，有机相经无水硫酸钠干燥后减压脱溶，用二氯甲烷溶解浓缩产物，用100～200目硅胶进行柱层析(以石油醚与乙酸乙酯体积比为3:1混合液为洗脱剂)，得到20g环肽alaptide，收率为73％。
实施例3
1、在1000ml单口瓶中加入50g(0.38mol)h-cycloleucine-oh、150ml四氢呋喃、500ml水，搅拌至固体溶解后加入80g(0.76mol)碳酸钠，在5～15℃条件下缓慢滴加130ml(0.57mol)二碳酸二叔丁酯，滴加完后常温反应6小时，tlc显示反应完全，过滤掉难溶物，减压脱除四氢呋喃，用柠檬酸调节ph＝3后用乙酸乙酯萃取(200ml×3次)，有机相经饱和食盐水洗涤、无水硫酸钠干燥后，减压脱除溶剂，得到80gboc-cycloleucine-oh。
2、在1000ml单口瓶中加入38.2g(0.43mol)h-ala-oh、500ml甲醇，搅拌至固体溶解，在0～5℃条件下滴加62ml(0.86mol)氯化亚砜，滴加完后在0～10℃条件下反应2小时，然后自然升温至室温反应7小时，旋干溶剂，得到60gh-ala-ome·hcl。
3、在2l单口瓶中加入80g(0.350mol)boc-cycloleucine-oh、800ml四氢呋喃、44.2g(0.385mol)hosu、108g(0.520mol)dcc，在0～10℃条件下反应8小时，tlc显示反应完全，过滤掉难溶物，向滤液中加入53.5g(0.383mol)h-ala-ome·hcl、117g(1.390mol)碳酸氢钠、200ml蒸馏水，常温搅拌反应8小时，tlc显示反应完全，过滤掉难溶杂质，旋干溶剂，加入400ml蒸馏水和400ml乙酸乙酯，萃取有机相，水相用乙酸乙酯萃取两次(每次150ml)，合并有机相，加入300ml0.5mol/l的盐酸水溶液洗涤有机相，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，得到108g油状物boc-cycloleucine-ala-ome。
4、在1l反应瓶中加入108gboc-cycloleucine-ala-ome、600ml乙酸乙酯，在0～5℃条件下持续通入hcl气体，搅拌6小时后脱除溶剂，旋干得到油状物，加入500ml四氢呋喃、80mln-甲基吗啉，使体系ph为9～10，常温反应10小时，旋干溶剂，加入500ml乙酸乙酯和600ml0.5mol/l的hcl水溶液洗涤萃取，有机相经无水硫酸钠干燥后减压脱除溶剂，用二氯甲烷溶解浓缩产物，用100～200目硅胶进行柱层析(以石油醚与乙酸乙酯体积比为3:1混合液为洗脱剂)，得到51g环肽alaptide，收率为73.6％。