本发明涉及医药技术领域，具体地说，是一种从隋氏蒂壳海绵theonellaswinhoei中经提取、分离纯化得到的新型甾体类化合物及其在制备抗肿瘤药物中的应用。
背景技术：
海绵是一种低等的多细胞动物，其分布广泛，并且常含有很多结构罕见的具有抗肿瘤活性的次生代谢产物，因此，海绵一直是海洋药物研究的热点方向。
隋氏蒂壳海绵theonellaswinhoei在分类学上属于寻常海绵纲(demospongiae)石海绵目(lithistida)蒂壳海绵科(theonellidae)海绵。1981年斯坦福大学ernestkho等首次从两种theonella属海绵(theonellaconica和theonellaswinhoei)中分离得到两种具有新颖的4-methylene结构的甾体类化合物conicasterol和theonellasterol，从此拉开了研究该属海绵的序幕(khoe,imagawadk,rohmerm,etal.sterolsinmarineinvertebrates.22.isolationandstructureelucidationofconicasterolandtheonellasterol,twonew4-methylenesterolsfromtheredseaspongestheonellaconicaandtheonellaswinhoei[j].thejournaloforganicchemistry,1981,46(9):1836-9.)。此后，国内外很多课题组开始关注以隋氏蒂壳海绵为代表的该属海绵，并对其化学成分及其药理活性进行了研究。目前国外对海绵theonellaswinhoei的研究很多，尤其是michaelc.roy、motomasakobayashi和angelazampella课题组在该种海绵的研究方面表现突出，国内的张文教授课题组对隋氏蒂壳海绵的次级代谢产物及其生物活性作用也进行过研究(gongj,sunp,inhibitorsfromthespongetheonellaswinhoei[j].orglett,2014,16(8):2224-2227.)。conicasterolsa-l为一系列四位被环外双键亚甲基所取代的甾体类化合物，该类化合物曾报道有核受体亲和活性，但是没有直接杀伤肿瘤细胞的研究报道(jmedchem,2011,54(8):3065-75；jorgchem,2012,77(3):1489-96)。至今未见从该属海绵中分离得到具有抗肿瘤活性的4-亚甲基甾体类化合物c29h44o3的报道。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种从隋氏蒂壳海绵theonellaswinhoei中经提取、分离纯化得到的新的4-亚甲基(4-methylene)甾体类化合物，本发明的另一目的是提供该新化合物的提取方法和医药用途。
本发明的第一方面，提供一种4-亚甲基(4-methylene)甾体类化合物，或其药用盐，所述的4-亚甲基(4-methylene)甾体类化合物的化学结构如式(i)所示：
其中，式(i)所示的化合物，化学名为conicasterolm，分子式为c29h44o3。
优选的，所述的药用盐为有机酸盐、无机酸盐以及碱盐。
优选的，所述的无机酸是指盐酸、硫酸、磷酸、二磷酸、氢溴酸或硝酸等；
优选的，所述的有机酸是指乙酸、马来酸、富马酸、酒石酸、琥珀酸、乳酸、对甲苯磺酸、水杨酸或草酸等；
优选的，所述的碱是指氢氧化锂、氢氧化钠、氢氧化钙、氢氧化钾、氨水、碳酸钠、碳酸氢钠等。
本发明的第二方面，提供一种上述的4-亚甲基(4-methylene)甾体类化合物的制备方法，包括以下步骤：
a、制备总提物：
将冰冻(4℃冷藏)的隋氏蒂壳海绵(t.swinhoei，湿重)切碎后用95％乙醇室温渗漉，合并提取液，45℃减压浓缩得到总浸膏；
b、分离纯化：
①制备粗提物：将总浸膏混悬分散于水中，用乙酸乙酯萃取4次，浓缩萃取液得到脂溶性部位；将脂溶性部位混悬于90％的甲醇水溶液中，用等体积的石油醚萃取3次，合并萃取液后减压浓缩得到石油醚层粗提物；
②分离纯化：将石油醚层粗提物经减压液相柱色谱(vlc)，以石油醚:丙酮＝50:1，25:1，10:1，0:1为溶剂进行梯度洗脱，根据薄层色谱特性(显色剂：10％硫酸-香兰素溶液)及lc-ms数据合并相似流分，得到9个组分fr.1-9；
③对组分fr.8反复进行正、反相硅胶柱色谱、凝胶柱色谱分离，最后通过高效液相制备得到所述的4-亚甲基(4-methylene)甾体类化合物conicasterolm。
其中，所述的隋氏蒂壳海绵(theonellaswinhoei)，可选产自中国南海的隋氏蒂壳海绵，例如西沙群岛永兴岛附近海域的隋氏蒂壳海绵(样本保存于上海交通大学医学院癌基因与相关基因国家重点实验室海洋药物研究中心，样品编号为13-2)。该种海绵也可以为采自印度尼西亚、红海海域的隋氏蒂壳海绵。
本发明的上述4-亚甲基(4-methylene)甾体类化合物也可以通过化学合成的方式制备得到。
本发明的第三方面，提供一种上述的4-亚甲基(4-methylene)甾体类化合物或其药用盐，在制备抗肿瘤药物中的应用。
优选的，所述的肿瘤为淋巴瘤、肺癌或乳腺癌。
体外活性试验证明，本发明化合物对人组织细胞淋巴瘤u937细胞，人肺癌pc9细胞，人乳腺癌细胞mcf-7等多种不同的肿瘤细胞均有一定的抑制活性。其中对人组织细胞淋巴瘤u937细胞，人肺癌pc9细胞，人乳腺癌细胞mcf-7的ic50值分别为8.8，6.9以及5.4μm。因此本发明化合物可用于制备抗肿瘤药物。
本发明的第四方面，提供一种抗肿瘤药物，其包含有效量的上述的4-亚甲基(4-methylene)甾体类化合物conicasterolm或其药用盐作为活性成分。
本发明的第五方面，提供隋氏蒂壳海绵(theonellaswinhoei)在制备如权利要求1所述的4-亚甲基(4-methylene)甾体类化合物conicasterolm或其药用盐中的应用。
本发明的有益效果在于：
本发明化合物制备方法简单，抗肿瘤活性显著。本发明为研究和开发新的抗肿瘤药物提供了新的先导化合物，为合理开发利用我国海洋药用资源提供了科学依据。
具体实施方式
下面结合本发明的实施例对本发明的实施作详细说明，以下实施例是在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1.制备本发明化合物
1、制备石油醚层粗提物
将冰冻(4℃冷藏)的隋氏蒂壳海绵(t.swinhoei，湿重30kg)切碎后用95％乙醇室温渗漉，合并提取液，45℃减压浓缩得到总浸膏。将总浸膏混悬分散于水中，用乙酸乙酯萃取4次，浓缩萃取液得到脂溶性部位(171g)。将脂溶性部位混悬于90％的甲醇水溶液中，用等体积的石油醚萃取3次，合并萃取液后减压浓缩得到石油醚层粗提物共147g。
2、分离纯化
1)分离纯化：将石油醚层粗提物经减压液相柱色谱(vlc)，以石油醚:丙酮＝50:1，25:1，10:1，0:1为溶剂进行梯度洗脱，根据薄层色谱特性(显色剂：10％硫酸-香兰素溶液)及lc-ms数据合并相似流分，得到9个组分fr.1–9；
2)对组分fr.8反复进行正、反相硅胶柱色谱、凝胶柱色谱分离，最后通过高效液相制备得到本发明化合物c29h44o3。
3、结构鉴定
本发明化合物c29h44o3经1d/2dnmr、hresims、ir、uv等多种现代光谱技术，确定了本发明化合物c29h44o3的化学结构如式(i)所示。
本发明化合物c29h44o3：白色细针状晶体，hresimsm/z441.3368[m+h]+(calcdforc29h45o3,441.3369)；
表1本发明化合物c29h44o3的核磁共振谱数据
a采用150mhz核磁在cdcl3中采集；b采用600mhz核磁在cdcl3中采集。
实施例2本发明化合物的体外抗肿瘤活性实验：
对本发明化合物c29h44o3进行了体外抗肿瘤实验，所用肿瘤细胞株如下：
人组织细胞淋巴瘤u937细胞，购自atcc，atcc号为crl-1593.2；
人肺癌pc9细胞，购自atcc，atcc号为32727；
人乳腺癌细胞mcf-7(mcf-7)，购自atcc，atcc号为htb-22；
利用cck-8法进行化合物的细胞增殖-毒性分析：
样品用dmso溶解，低温保存，dmso在最终体系中的浓度控制在不影响检测活性的范围之内。
1.实验步骤：(1)取对数生长期的细胞，弃掉原液培养，加入3mlpbs洗涤2次，加入500μl0.25％胰蛋白酶37℃消化3min，加入3ml完全培养基终止消化。(2)用移液器轻轻吹打细胞，制成单细胞悬液，转移至15ml离心管中，800rpm离心4min，弃上清，加入6ml完全培养液，吹打混匀，计数制成3×105个/ml的单细胞悬液，每孔90μl加入到96孔板中(外圈不加)，最终3000个/孔。(3)将96孔板放入37℃，5％co2恒温培养箱内培养24h。(4)化合物分别用dmso配制成10mm的储备液，存放于4℃冰箱内。(5)将储配液分别用培养基稀释成100μm供试品溶液，在96孔板上的终浓度为10μm，并且设置40,20,10,5,2.5,1.25μm共6个浓度梯度。6)将已加好化合物的96孔板放入37℃，5％co2培养箱内培养(48h)。(7)48h后每孔加入10μl的cck-8溶液，40min～60min，后用酶标仪检测450nm下的吸光度，od值。
2.实验数据处理：在单一浓度条件下初筛中表现出活性的待测样品，例如抑制率大于50％，继续测试活性剂量依赖关系，将活性对浓度进行非线性拟合，即可得到待测样品的ic50值。计算所用软件为graphpadprism5，拟合所使用的模型为sigmoidaldose-response(ariableslope)，对于大多数抑制剂筛选模型，将拟合曲线底和顶部设定为0和100。一般情况下，每个样品在测试中均设置复孔(n≥2)，在结果中以标准偏差(standarddeviation,sd)表示。
3.实验结果：利用cck-8法进行细胞毒活性测试，化合物c29h44o3对人组织细胞淋巴瘤u937细胞，人肺癌pc9细胞，人乳腺癌细胞mcf-7等多种不同的肿瘤细胞均有一定的抑制活性，具体活性数据见表2。
表2化合物c29h44o3对肿瘤细胞的半数有效抑制浓度ic50(μm)
由表2可见，化合物c29h44o3对多种不同的肿瘤细胞株均表明有一定的抑制作用，其中人组织细胞淋巴瘤u937细胞，人肺癌pc9细胞，人乳腺癌细胞mcf-7的ic50值分别为8.8，6.9以及5.4μm。因此可用于制备抗肿瘤药物。
本发明为研制新的抗肿瘤药提供了新的先导化合物。
以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。