利用紫外辐照在TiO2上固定蛋白并调控细胞亲和性的方法及TiO2‑蛋白产品与流程

本发明涉及生物材料领域，且特别涉及一种利用紫外辐照在tio2上固定蛋白并调控细胞亲和性的方法及tio2-蛋白产品。

背景技术：

蛋白质是构成生物体的基本组成物质，在细胞生命活动中的每一个进程都有参与作用。在材料表面固定蛋白可以提供材料独特的生物相容性和多种多样的生物学功能，从而在如生物电子、组织工程、药物释放等多个领域得以应用。

目前在材料表面固定蛋白的方法主要有两类：(1)自组装法：利用少数具有自组装特性的蛋白，如丝素蛋白等，在材料表面进行自组装固定；(2)交联剂法：利用交联剂将蛋白固定在材料表面。第一种方法由于具有自组装特性的蛋白种类较少，因此其应用受到严重的限制；第二种方法则具有未反应完全的交联剂残留在蛋白薄膜中，损害蛋白薄膜生物相容性的缺点。利用离子体处理的方法是近年来一种新颖的蛋白固定的手段，具体是在材料表面产生自由基，并利用自由基固定蛋白，简称自由基固定法，利用该方法可以在材料表面牢固的共价固定蛋白，并维持蛋白的天然构型。相对于自组装法和交联剂法，自由基固定法适用于大多数蛋白，且无交联剂残留，具有显著的优势。

在固定蛋白之后，更进一步的调控材料表面蛋白的细胞亲和性具有十分重要的意义。这是由于不同的生物材料对于其细胞亲和性具有截然不同的要求：如骨整合材料，要求高的骨细胞亲和力，以促进骨整合修复；而血液接触材料，则要求低的血液细胞亲和力，以防止血栓形成。近年来国内外与此相关的报道主要有：alwinm.d.wan等人曾采用电压与电流的方式控制纤粘蛋白的构型变化，eunheejeoung等人则在控制温度与气压同时使用纳米压印技术调控多种蛋白的构型和细胞亲和性。总的来说，到目前为止，国内外仍少有报道通过简单的改变处理条件，实现提升/降低蛋白细胞亲和性双向调节的技术手段。

因此迫切需要一种简单的技术手段去调控操纵材料表面吸附蛋白的细胞亲和性。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种利用紫外辐照在tio2上固定蛋白并调控细胞亲和性的方法，有效的调控tio2表面吸附蛋白的细胞亲和性或者通过掩膜辐照的手段，获取细胞微图形。

本发明的另一目的在于提供一种tio2-蛋白产品，可满足不同生物材料应用领域对材料生物学性能的个性化需求，具有重要的实用价值。

本发明解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。

本发明提出一种利用紫外辐照在tio2上固定蛋白并调控细胞亲和性的方法，其包括以下步骤：

将tio2材料置于蛋白溶液中，使tio2表面吸附蛋白，取出并用水清洗，洗掉未吸附的蛋白，得到tio2-蛋白样品；

将tio2-蛋白样品进行干法或湿法的紫外辐照，获得具有不同细胞亲和力的tio2-蛋白产品。

进一步地，在本发明较佳实施例中，tio2材料为tio2薄膜、tio2颗粒或tio2纳米管。

进一步地，在本发明较佳实施例中，蛋白包括白蛋白、纤维蛋白原、胶原蛋白、过氧化氢酶或超氧阴离子歧化酶。

进一步地，在本发明较佳实施例中，所用水为纯水或者水的盐溶液。

进一步地，在本发明较佳实施例中，紫外辐照为全紫外辐照或掩膜紫外辐照。

进一步地，在本发明较佳实施例中，干法的紫外辐照的具体方法是：先将tio2-蛋白样品干燥，再在干燥环境中进行紫外辐照。

进一步地，在本发明较佳实施例中，干燥的方法是在空气中自然干燥或冷冻干燥。

进一步地，在本发明较佳实施例中，湿法的紫外辐照的具体方法是：将湿润的tio2-蛋白样品在水中进行紫外辐照。

一种tio2-蛋白产品，其是按照上述的利用紫外辐照在tio2上固定蛋白并调控细胞亲和性的方法制得。

进一步地，在本发明较佳实施例中，紫外辐照为全紫外辐照，对应的tio2-蛋白产品为促进或抑制后继蛋白、细胞吸附的蛋白表面；紫外辐照为掩膜紫外辐照，对应的tio2-蛋白产品为促进或抑制细胞粘附蛋白-普通蛋白的微图案化蛋白表面。

本发明实施例的利用紫外辐照在tio2上固定蛋白并调控细胞亲和性的方法及tio2-蛋白产品的有益效果是：本发明实施例的利用紫外辐照在tio2上固定蛋白并调控细胞亲和性的方法是将tio2材料置于蛋白溶液中，使tio2表面吸附蛋白，取出并用水清洗，洗掉未吸附的蛋白，得到tio2-蛋白样品；将tio2-蛋白样品进行干法或湿法的紫外辐照，获得具有不同细胞亲和力的tio2-蛋白产品，该利用紫外辐照在tio2上固定蛋白并调控细胞亲和性的方法可以有效调控tio2表面吸附蛋白的细胞亲和性或者通过掩膜辐照的手段，获取细胞微图形；得到的tio2-蛋白产品可满足不同生物材料应用领域对材料生物学性能的个性化需求，具有重要的实用价值。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为实施例1-4利用湿法/干法紫外辐照调控tio2表面蛋白细胞亲和性示意图；

图2表示实施例1利用湿法全紫外辐照调控tio2表面蛋白细胞亲和性结果；

图3表示实施例2利用干法全紫外辐照调控tio2表面蛋白细胞亲和性结果；

图4为实施例5利用湿法/干法掩膜紫外辐照调控tio2表面蛋白细胞亲和性示意图；

图5表示实施例5利用干法/湿法掩膜紫外辐照调控tio2表面蛋白细胞亲和性结果。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

下面对本发明实施例的利用紫外辐照在tio2上固定蛋白并调控细胞亲和性的方法及tio2-蛋白产品进行具体说明。

本发明实施例提供一种利用紫外辐照在tio2上固定蛋白并调控细胞亲和性的方法，其包括以下步骤：

s1、将tio2材料置于蛋白溶液中，tio2材料可以为tio2薄膜、tio2颗粒或tio2纳米管等，蛋白可以为任意蛋白，具体包括白蛋白、纤维蛋白原或胶原蛋白等多种蛋白，或者过氧化氢酶、超氧阴离子歧化酶等多种酶，使tio2表面吸附蛋白，取出吸附蛋白后的tio2并用水清洗，所用水可以为纯水，如ro水、up水等，或者水的盐溶液，如磷酸盐缓冲液生理盐水等，洗掉未吸附的蛋白，得到tio2-蛋白样品。

s2、将tio2-蛋白样品进行干法或湿法的紫外辐照，紫外辐照为全紫外辐照或掩膜紫外辐照，获得具有不同细胞亲和力的tio2-蛋白产品。具体的，全紫外辐照对应得到促进或抑制后继蛋白、细胞吸附的蛋白表面，即tio2-蛋白复合表面；掩膜紫外辐照是利用掩膜板进行掩膜紫外辐照，从而获得具有不同细胞亲和力的蛋白图形，并进一步制得促进或抑制细胞粘附蛋白-普通蛋白的微图案化蛋白表面，即tio2-蛋白细胞微图形表面。

若是将tio2-蛋白样品进行干法的紫外辐照，步骤s2具体包括以下过程：

s2a、将tio2-蛋白样品干燥，干燥的具体方法是在空气中自然干燥或冷冻干燥。

s2b、将干燥后的tio2-蛋白样品在干燥环境中进行干法全紫外辐照或干法掩膜紫外辐照，获得具有良好细胞亲和力的tio2-蛋白复合表面或tio2-蛋白细胞微图形表面。

若是将tio2-蛋白样品进行湿法的紫外辐照，步骤s2具体包括以下过程：

s2a、将湿润的tio2-蛋白样品在水中进行湿法全紫外辐照或湿法掩膜紫外辐照，获得具有抵抗细胞粘附能力(即细胞亲和力较低)的tio2-蛋白复合表面或tio2-蛋白细胞微图形表面。

本实施例一般是先将湿润的tio2-蛋白样品干燥，以便于样品保存，再根据需求进行干法的紫外辐照，或是将干燥后的tio2-蛋白样品重新润湿，进行湿法的紫外辐照。

由于蛋白的细胞亲和性与其构型有着密切的关系，而水是蛋白折叠的驱动力。蛋白表面吸附的水合水会直接与蛋白质表面的氨基残基通过氢键作用，这是影响蛋白构型的关键因素。研究表明，干燥的蛋白与润湿的蛋白具有截然不同的结构。另外，tio2是一种重要的功能材料，具有在紫外辐照时，产生光生自由基的重要特性。另一方面，由于其良好的耐腐蚀性与力学性能，tio2在生物材料领域，如骨植入材料、血液接触材料、生物传感器等领域有着广泛的应用。

因此，本发明实施例的方法是在tio2表面吸附蛋白后，分别在干燥环境与水(湿润环境)中进行紫外辐照，利用tio2紫外辐照所产生的光生自由基对干燥或润湿的蛋白进行共价固定，另外，通过调节紫外辐照时的环境条件(干燥或润湿)，以调控固定蛋白的细胞亲和性，即一种利用干法/湿法紫外辐照在tio2上固定蛋白并调控细胞亲和性的方法。

本发明实施例的方法适用于多种蛋白(包括白蛋白，纤维蛋白原，胶原蛋白等)在各种形态tio2材料(包括薄膜、纳米管、纳米颗粒等)表面的固定与细胞亲和性的调控，以及表面或细胞微图形的制备。紫外辐照过程与环境条件均简单可控，相对于现有方法，具有适用范围广、可控性好、工艺简单、经济方便的优点。

本发明实施例还提供一种tio2-蛋白产品，其是按照如上述的利用紫外辐照在tio2上固定蛋白并调控细胞亲和性的方法制得。若紫外辐照为全紫外辐照，对应的tio2-蛋白产品为促进或抑制后继蛋白、细胞吸附的蛋白表面，即tio2-蛋白复合表面；若紫外辐照为掩膜紫外辐照，对应的tio2-蛋白产品为促进或抑制细胞粘附蛋白-普通蛋白的微图案化蛋白表面，即tio2-蛋白细胞微图形表面。tio2-蛋白产品具体是在tio2表面有效的固定多种蛋白，并自由调控多种蛋白的细胞亲和性而得到的，获得的tio2-蛋白复合表面和tio2-蛋白细胞微图形表面可满足不同生物材料应用领域(如骨整合材料、血液接触材料等)对材料生物学性能的个性化需求，具有重要的实用价值。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

本实施例提供一种tio2-牛白蛋白复合表面，其具体是按照以下方法制得：

将tio2材料置于牛白蛋白溶液中，使tio2表面吸附牛白蛋白，取出并用ro水清洗，洗掉未吸附的牛白蛋白，得到tio2-牛白蛋白样品。

将湿润的tio2-牛白蛋白样品在水中进行湿法全紫外辐照，获得具有抵抗细胞粘附能力的tio2-牛白蛋白复合表面。

实施例2

本实施例提供一种tio2-牛白蛋白复合表面，其具体是按照以下方法制得：

将tio2材料置于牛白蛋白溶液中，使tio2表面吸附牛白蛋白，取出牛白并用ro水清洗，洗掉未吸附的牛白蛋白，得到tio2-牛白蛋白样品。

将tio2-牛白蛋白样品在空气中自然干燥。

将干燥后的tio2-牛白蛋白样品在干燥环境中进行干法全紫外辐照，获得具有良好细胞亲和力的tio2-牛白蛋白复合表面。

实施例3

本实施例提供一种tio2-牛白蛋白细胞微图形，其具体是按照以下方法制得：

将tio2材料置于牛白蛋白溶液中，使tio2表面吸附牛白蛋白，取出牛白并用ro水清洗，洗掉未吸附的牛白蛋白，得到tio2-牛白蛋白样品。

将湿润的tio2-牛白蛋白样品在水中进行湿法掩膜紫外辐照，获得具有抵抗细胞粘附能力的tio2-蛋白细胞微图形表面。

实施例4

本实施例提供一种tio2-牛白蛋白细胞微图形，其具体是按照以下方法制得：

将tio2材料置于牛白蛋白溶液中，使tio2表面吸附牛白蛋白，取出牛白并用ro水清洗，洗掉未吸附的牛白蛋白，得到tio2-牛白蛋白样品。

将tio2-牛白蛋白样品在空气中自然干燥。

将干燥后的tio2-牛白蛋白样品在干燥环境中进行干法掩膜紫外辐照，获得具有良好细胞亲和力的tio2-蛋白细胞微图形表面。

实施例5

本实施例提供两种tio2-纤维蛋白原细胞微图形，其具体是按照以下方法制得：

将tio2材料置于纤维蛋白原溶液中，使tio2表面吸附纤维蛋白原，取出纤维并用ro水清洗，洗掉未吸附的纤维蛋白原，得到tio2-纤维蛋白原样品。

将tio2-纤维蛋白原样品在空气中自然干燥。

将干燥后的tio2-纤维蛋白原样品在干燥环境中进行干法掩膜紫外辐照，获得具有良好细胞亲和力的一种tio2-纤维蛋白原细胞微图形。

另外，将干燥后的tio2-纤维蛋白原样品重新润湿，在水中进行湿法掩膜紫外辐照，获得具有抵抗细胞粘附能力的tio2-纤维蛋白原细胞微图形。

以下对实施例1-5中的tio2-蛋白产品的细胞亲和性结果进行检测。

一、图1为实施例1-4利用湿法/干法紫外辐照调控tio2表面蛋白细胞亲和性示意图，图1①为实施例1利用湿法全紫外辐照调控tio2表面蛋白细胞亲和性示意图，图1②为实施例2利用干法全紫外辐照调控tio2表面蛋白细胞亲和性示意图，图1③为实施例3利用湿法掩膜紫外辐照调控tio2表面蛋白细胞亲和性示意图，图1④为实施例4利用干法掩膜紫外辐照调控tio2表面蛋白细胞亲和性示意图，其中，bsa＝牛白蛋白，uv(w)＝湿法全紫外辐照，uv(d)＝干法全紫外辐照，puv(w)＝湿法掩膜紫外辐照，puv(d)＝干法掩膜紫外辐照，mask＝掩膜，transparentsection＝透明部分。

分别在实施例1、实施例2的tio2-牛白蛋白复合表面种植细胞，种植细胞为内皮细胞ecs，培养时间为1天，图2表示实施例1利用湿法全紫外辐照调控tio2表面蛋白细胞亲和性结果，图3表示实施例2利用干法全紫外辐照调控tio2表面蛋白细胞亲和性结果。

由图2、图3可以看出：利用湿法紫外辐照调控tio2表面蛋白具有抵抗细胞粘附能力，细胞亲和性较低，利用干法紫外辐照调控tio2表面蛋白具有较佳细胞亲和性。

二、图4为实施例5利用湿法/干法掩膜紫外辐照调控tio2表面蛋白细胞亲和性示意图。

分别将实施例5中的两种tio2-纤维蛋白原细胞微图形的表面种植细胞，种植细胞为内皮细胞ecs，培养时间为1天，图5表示实施例5利用干法/湿法掩膜紫外辐照调控tio2表面蛋白细胞亲和性结果，fgn-puv(w)＝纤维蛋白原经过湿法掩膜紫外辐照，fgn-puv(d)＝纤维蛋白原经过干法掩膜紫外辐照。

由图5可以看出：利用湿法紫外辐照调控tio2表面蛋白具有抵抗细胞粘附能力，利用干法紫外辐照调控tio2表面蛋白具有较佳细胞亲和性。

综上所述，本发明实施例的利用紫外辐照在tio2上固定蛋白并调控细胞亲和性的方法可以有效调控tio2表面吸附蛋白的细胞亲和性或者通过掩膜辐照的手段，获取细胞微图形；得到的tio2-蛋白产品可满足不同生物材料应用领域对材料生物学性能的个性化需求，具有重要的实用价值。

以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。