本发明涉及生物工程领域，更具体地说，涉及一种黑曲霉发酵生产葡萄糖酸钠的方法。
背景技术：
葡萄糖酸钠是一种稳定性好、无毒、无腐蚀性的有机酸盐，广泛应用于医药、食品、化工、轻工业等，如在建筑业中作为水泥掺合剂，在水泥中添加一定数量葡萄糖酸钠，可增加混凝土的可塑性和强度；用于医药方面可以调节人体内酸碱平衡，使神经恢复正常；在食品行业可用作食品添加剂。葡萄糖酸钠是化学纯试剂、无腐蚀性，且质量恒定，这些特点能保证它在应用中有可靠的和重复性的结果。
目前葡萄糖酸钠的生产方法主要有电解法、催化氧化法、双酶法、微生物发酵法等方法。其中电解法在工业生产中能耗大，不易控制；催化氧化法在生产过程中存在着氧化时间长，副反应较多，且催化剂在循环使用一定次数后，催化效率下降等问题；双酶法存在扩散限制，且酶的成本较高；而微生物发酵法条件温和，节能明显逐渐成为生产葡萄糖酸钠的主流方法。
葡萄糖酸及其盐在发酵生产时，主要利用黑曲霉菌进行发酵，在发酵罐中加入大量培养基，接入种子液进行发酵，控制菌体浓度、ph、温度、发酵罐转速、溶解氧浓度(do)、残糖、浓度等指标。但随着优良菌种的选育已经可以耐受较高的底物浓度，大量培养基的加入以及副产物使得到的葡萄糖酸钠的产量不高，纯度偏低，反应时间长，易黄罐臭罐的现象。因每批发酵都要维持一定的菌体浓度，并且是每进行一批发酵都要培养一批菌种，菌体培养和发酵过程中消耗葡萄糖，葡萄糖酸钠的纯度，反应的快慢，次级代谢产物的产生抑制，都与反应中初始营养盐的比例和反应过程中的参数控制密切相关。以目前本领域的反应发酵现状来看，反应时间普遍超过20小时，葡萄糖酸钠含量在原始发酵液中的比例小于32％，并且发酵过程中发酵液易因为控制不当和次级代谢产物过多而发黄、发臭，从而大大影响了葡萄糖酸钠的产量和质量。
有鉴于此，研究出一种黑曲霉发酵生产葡萄糖酸钠的方法，利用合理的营养盐比例和反应过程中对参数的控制，进一步缩短发酵生产葡萄糖酸钠的时间、提高葡萄糖酸钠产率、提升葡萄糖酸钠质量，是本领域的技术人员亟需解决的问题。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种黑曲霉发酵生产葡萄糖酸钠的方法，该方法能够提高葡萄糖酸钠产率、提升葡萄糖酸钠质量，充分解决了现有技术存在的问题。
为解决上述问题，本发明所采用的技术方案是：
一种黑曲霉发酵生产葡萄糖酸钠的方法，其特征在于，包括下列步骤：
1)取一支保存的黑曲霉菌，刮取上层孢子，接入培养基中，在28-32℃的温度下培养至长满孢子，后配制成菌悬液备用；所述培养基为改良马丁琼脂培养基；
2)将葡萄糖液、营养盐一和消泡剂加入种子罐中并灭菌，后接入黑曲霉菌悬液进行种子培养；控制种子液的温度为28-32℃，ph为5-7，溶氧不低于30％；所述黑曲霉菌悬液的接入量为25ml/l；所述葡萄糖液的浓度为180-220g/l；所述营养盐一由0.18～0.22g/l的磷酸二氢钾，0.18～0.22g/l的硫酸镁，0.60～0.65g/l的磷酸氢二铵和0.20～0.24g/l的麸皮组成；
3)将葡萄糖液、营养盐二和消泡剂加入发酵罐中并灭菌，所述葡萄糖液的浓度为180-220g/l；所述营养盐二由0.078～0.080g/l的磷酸二氢钾，0.052～0.054g/l的硫酸镁，0.010～0.015g/l的磷酸氢二铵和0.040～0.042g/l的尿素组成；当测得种子罐中葡萄糖氧化酶活达到280～320u/ml时接入种子液，控制发酵液的温度为28-32℃，ph为5-7，溶氧为20％～30％，控制黑曲霉菌丝长度为10～15pm，当发酵罐中的葡萄糖含量低于3g/l的时候结束发酵；
4)将获得的发酵液进行过滤除杂质、脱色、结晶，将晶体与液体分离，对晶体进行干燥，最后获得葡萄糖酸钠成品。
进一步地，步骤2)中，所述灭菌方法为在115-120℃的条件下灭菌20min，所述消泡剂为聚醚类消泡剂，所述消泡剂的加入量为0.25-0.30ml/l。本发明中的消泡剂亲水性较好，在发泡介质中易铺展，消泡能力强且受高温杀菌后，能自动恢复乳化状态，不会在发酵液体中水油分离、破乳而影响使用。本消泡剂具有能环保、高效、无色斑、吸湿性低等优点。
进一步地，步骤3)中，所述种子液的接入量为10-15％。黑曲霉种子液接入的质量和数量会直接影响到发酵结果，本发明中当测得种子罐中葡萄糖氧化酶活达到一定程度280～320u/ml时，接入10-15％的种子液进行发酵生产，接入的菌体总量及浓度能够满足发酵罐的发酵生产要求，可为黑曲霉发酵生产提供充足的代谢旺盛、生命力强的种子，移种至发酵罐后能迅速生长，迟缓期短，缩短了发酵罐中的发酵周期。当种子培养时间相对较短时，菌体数量较少，且在接种后生长缓慢，产物开始形成时间推迟，延长发酵周期；当种子培养时间相对较长时，虽然菌量多，但接种后菌体过早衰退，导致生产能力下降。当种子液的接入量较小时，发酵结束时，发酵液中还有很高的残糖量，造成资源的浪费；当种子液的接入量较大时，营养物质迅速消耗，造成菌体早衰进一步影响生产性能。
进一步地，步骤3)中，所述灭菌方法为在115-120℃的条件下灭菌20min，所述消泡剂为聚醚类消泡剂，所述消泡剂的加入量为0.25-0.30ml/l。所述消泡剂为聚醚类消泡剂，消泡剂亲水性较好，在发泡介质中易铺展，消泡能力强且受高温杀菌后，能自动恢复乳化状态，不会在发酵液体中水油分离、破乳而影响使用。本消泡剂具有环保、高效、无色斑、吸湿性低等优点，它的抑泡能力比消泡能力优越，以抑制整个发酵过程的泡沫产生。
进一步地，步骤3)中，所述控制黑曲霉菌丝长度的方法为，通过奥林巴斯高倍视频显微镜每两小时对取得样品的菌丝长度进行测定，通过增加转速和降低通氧量能够减小菌丝长度。通过增加转速，在一定程度上对黑曲霉菌丝进行剪切，打磨能够减小菌丝长度；黑曲霉菌的发酵过程是极其耗氧的过程，通过降低通氧量能够在一定程度上减小菌丝长度，通过减小黑曲霉菌丝长度进一步提高发酵罐中的透光率。
进一步地，步骤3)中所述发酵罐中保持发酵液的颜色始终呈现为白色或乳白色；保持发酵液中过滤菌丝后的样品透光在75％以上。保持发酵液的颜色为白色或乳白色防止发酵过程中产生黄罐和臭罐现象，保持样品透光率即保持了葡萄糖酸钠的收率。
进一步地，步骤4)中所述葡萄糖酸钠的脱色方法为活性炭脱色，其步骤为将发酵液离心，取上清液，后将上清液通过由颗粒活性炭组成的碳柱中进行脱色。采用颗粒活性炭脱色工艺，提高葡萄糖酸钠发酵液的脱色质量，进而提高产品的脱色颜色和质量，一次结晶达到食品级标准。
进一步地，步骤4)中，所述过滤的方法为板框过滤除杂质法；所述结晶的方法为105-115℃浓缩至70％以上含量，冷却结晶；所述分离的方法为利用分离机将晶体与液体分离；所述干燥的方法为流化床干燥。其中板框过滤除杂质能达到无菌过滤的目的，以实现固液分离；上述结晶方法能够实现形成的晶体颗粒均匀，晶形良好，晶体纯度高；其中分离机工作面积大，处理能力强，能够实现晶体与液体迅速分离，且分离效果好；其中使用流化床干燥晶体，其干燥速率高，热效率高，不易产生返混、沟流、粘壁等现象，实现葡萄糖酸钠晶体的快速干燥。
本发明黑曲霉发酵生产葡萄糖酸钠的方法，至少有以下优点：
1)本发明的方法可以完全抑制发酵过程中产生的黄罐和臭罐现象；
2)本发明的方法可以控制发酵时间在18h左右，相比目前发酵现状来看，可以至少缩短10％的发酵时间；
3)本发明的方法相对于酶法和其他方法而言具有成本低，简便易行的优点；
4)本发明的方法能够提高葡萄糖酸钠产率、提升葡萄糖酸钠质量。
具体实施方案
为了使本发明实现的技术手段，改进特征，达到的目的更容易明白，以下结合实施例对本发明作进行清楚、完整的描述。
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：
取一支黑曲霉，刮取上层孢子，接入培养基中，在30℃培养至长满孢子后配制成菌悬液备用；所述培养基为改良马丁琼脂培养基；
在15l培养罐中加入纯葡萄糖2.0kg、麸皮2.2g、磷酸二氢钾2.0g、硫酸镁2.0g、磷酸氢二铵6.2g、消泡剂2.6ml，定容至10l，115℃灭菌20分钟，然后降至36℃，加入250ml菌悬液，控制种子液的温度为30℃；保持种子液的ph为5.2；控制溶解氧(do)≥30％，培养20小时。
在50l发酵罐中(一级发酵罐)加入纯葡萄糖5.4kg、磷酸二氢钾2.13g、硫酸镁1.43g、尿素1.11g、磷酸氢二铵0.032g、消泡剂7.02ml，定容至27l，115℃灭菌20分钟，然后降至37℃，接入种子液，接种量为12％，用350g/l的naoh调节控制ph5.2，开始发酵，控制发酵液的温度为30℃，使黑曲霉菌丝长度控制在10～15pm的范围内，保持溶氧在20％～30％，每2小时对菌型、透光率、进行测定，当发酵罐中的葡萄糖含量低于3g/l的时候结束发酵。部分数据和控制操作如表1：
表1实施例1部分数据和控制操作
第三步、过滤：板框过滤除菌丝体。
第四步、脱色：使用活性炭对发酵液脱色。
第五步、结晶：105-115℃浓缩至质量含量75％以上，冷却结晶。
第六步、分离、干燥：分离机将晶体与液体分离，然后流化床干燥，得葡萄糖酸钠成品。葡萄糖酸钠纯度为98.6％，收率为95.4％，发酵时长为17.5h，无黄罐，臭罐现象，与背景技术中提到的发酵时间(20h)相比，缩短了12.5％。
实施例2：
取一支黑曲霉，刮取上层孢子，接入培养基中，在30℃培养至长满孢子后配制成菌悬液备用；所述培养基为改良马丁琼脂培养基；
在15l培养罐中加入纯葡萄糖1.85kg、麸皮2.1g、磷酸二氢钾1.9g、硫酸镁1.9g、磷酸氢二铵6g、消泡剂2.6ml，定容至10l，115℃灭菌20分钟，然后降至36℃，加入250ml菌悬液，控制种子液的温度为30℃；保持种子液的ph为5.2，控制溶解氧(do)≥30％，培养20小时。
第二步、发酵：50l发酵罐中(一级发酵罐)加入纯葡萄糖5kg、磷酸二氢钾2.11g、硫酸镁1.40g、尿素1.08g、磷酸氢二铵0.28g、消泡剂7.02ml，定容至27l，115℃灭菌20分钟，然后降至37℃，接入种子液，接种量为10％，用350g/l的naoh调节控制ph5.2，开始发酵，控制发酵液的温度为30℃，使黑曲霉菌丝长度控制在10～15pm的范围内，保持溶氧在20％～30％，每2小时对菌型、折光率、进行测定，当发酵罐中的葡萄糖含量低于3g/l的时候结束发酵。部分数据和控制操作如表2：
表2实施例2部分数据和控制操作
第三步、过滤：板框过滤除菌丝体。
第四步、脱色：使用活性炭对发酵液脱色。
第五步、结晶：105-115℃浓缩至质量含量75％以上，冷却结晶。
第六步、分离、干燥：分离机将晶体与液体分离，然后流化床干燥，得葡萄糖酸钠成品。葡萄糖酸钠纯度为98.4％，收率为94.8％，发酵时长为18h，无黄罐，臭罐现象。与背景技术中提到的发酵时间(20h)相比，缩短了10％。
实施例3：
取一支黑曲霉，刮取上层孢子，接入培养基中，在30℃培养至长满孢子后配制成菌悬液备用；所述培养基为改良马丁琼脂培养基；
在15l培养罐中加入纯葡萄糖2.15kg、麸皮2.4g、磷酸二氢钾2.2g、硫酸镁2.2g、磷酸氢二铵6.4g、消泡剂2.6ml，定容至10l，115℃灭菌20分钟，然后降至36℃，加入250ml菌悬液，控制种子液的温度为30℃；保持种子液的ph为5.2，控制溶解氧(do)≥30％，培养20小时。
第二步、发酵：50l发酵罐中(一级发酵罐)加入纯葡萄糖5.8kg、磷酸二氢钾2.06g、硫酸镁1.46g、尿素1.13g、磷酸氢二铵0.38g、消泡剂7.02ml，定容至27l，115℃灭菌20分钟，然后降至37℃，接入种子液，接种量为14％，用350g/l的naoh调节控制ph5.2，开始发酵，控制发酵液的温度为30℃，使黑曲霉菌丝长度控制在10～15pm的范围内，保持溶氧在20％～30％，每2小时对菌型、折光率、进行测定，当发酵罐中的葡萄糖含量低于3g/l的时候结束发酵。
部分数据和控制操作如表3：
表3实施例3部分数据和控制操作
第三步、过滤：板框过滤除菌丝体。
第四步、脱色：使用活性炭对发酵液脱色。
第五步、结晶：105-115℃浓缩至质量含量75％以上，冷却结晶。
第六步、分离、干燥：分离机将晶体与液体分离，然后流化床干燥，得葡萄糖酸钠成品。葡萄糖酸钠纯度为98.5％，收率为95.1％，发酵时长为18h，无黄罐，臭罐现象。与背景技术中提到的发酵时间(20h)相比，缩短了10％。
本实施例中的其他部分与实施例1中的相同就不一一的进行赘述了。
本发明不局限于上述的优选实施方式，任何人应该得知在本发明的启示下做出的结构变化，凡是与本发明具有相同或者相近似的技术方案，均属于本发明的保护范围。