一种纯化醋酸西曲瑞克的方法与流程

本发明属于多肽纯化的技术领域，特别是涉及一种可规模化纯化醋酸西曲瑞克的方法。

背景技术：

醋酸西曲瑞克是一种合成的十肽，主要应用于辅助生育技术，对控制性卵巢刺激的患者，防止提前排卵，醋酸西曲瑞克又常称为西曲瑞克，西曲瑞克是促性腺激素释放激素(gnrh)拮抗剂，能与内源性lhrh竞争性地结合垂体细胞膜上的受体，从而抑制垂体分泌黄体生成素(lh)和卵泡刺激素(fsh)呈剂量依赖性。西曲瑞克无起始刺激效应，用药后即产生抑制，持续治疗可持续此抑制作用。西曲瑞克用于女性，可延迟lh峰从而推迟排卵。对于卵巢刺激的妇女，本品的作用时间呈剂量依赖性，单剂量给予西曲瑞克3mg，对其抑制作用进行了为期至少4天的评估，在第4天，抑制作用约为70％，每24小时重复给予0.25mg西曲瑞克，也可维持其作用。动物试验及人体试验均显示，停止注射后，内源性的lh及fsh的分泌可迅速恢复。

fmoc法固相合成是目前多肽合成的常用手段，合成后的全保护多肽需采用三氟乙酸(tfa)进行切割并脱侧链保护，以获得多肽粗品，如此粗品中会含有游离的tfa和tfa盐，游离的tfa和tfa盐会影响多肽的理化性质，通常tfa盐转成其他盐，如醋酸盐，虽然游离的tfa通过冻干容易除去，但与肽形成的tfa盐，因存在强的离子键，难以通过冻干除去。

专利cn101863960b采用固相boc法合成西曲瑞克，氨水进行切割，h2/钯除去侧链保护基以获得粗肽。该粗肽通过反相c18色谱柱纯化，得到西曲瑞克，此法由于需使用大量的三氟醋酸除去boc保护基以及氨水用于氨解切割，对环境污染大。另外，使用h2/钯进行侧链脱保护，可能会导致最终产品的重金属污染。因此，boc固相合成法在西曲瑞克合成上并不常用。

专利cn104892732a公开了在获得西曲瑞克粗肽的基础上，对粗肽进行分离纯化，采用c18或c8色谱柱分离、醋酸转盐以及冻干方式得到醋酸西曲瑞克，其纯度高达99％，收率高达40％，专利cn104861042a中公开了用反相高效液相色谱法纯化后的西曲瑞克，采用氯型强阴离子交换树脂在室温下搅拌吸附1h，以替代多肽产品中的三氟醋酸盐，得到醋酸西曲瑞克纯品，纯度高达99.613％，收率达40％以上。先纯化再树脂转盐有以下缺点：采用色谱柱纯化或用反相色谱纯化后所获得的溶液体积大，增加树脂的投入量，进而增加了生产成本。若纯化后液体经浓缩工序，则增加操作步骤，也可能导致多肽的高温不稳定和多肽析出等问题。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是：提供一种简单、节约成本、纯化效率高的纯化醋酸西曲瑞克的方法。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：一种纯化醋酸西曲瑞克的方法，包括如下步骤：

步骤1、树脂处理：阴离子树脂处理成醋酸根型的阴离子树脂；

步骤2、转盐：西曲瑞克粗品加水溶解，加入步骤1所得的醋酸根型的阴离子树脂，在温度为25～30℃的条件下搅拌，控制溶液的ph为2.5～3.5，过滤收集滤液；

步骤3、纯化：反相色谱柱用流动相平衡，所述流动相由流动相a和流动相b组成，所述流动相a为水溶液，所述流动相b为乙腈溶液，所述流动相a和所述流动相b均加入质量百分数为0.1％～1％的醋酸溶液，将步骤2所得的滤液上样、洗脱，并分段收集洗脱液，洗脱液浓缩后冻干或直接冻干，获得粉末状醋酸西曲瑞克纯品。

本发明的有益效果在于：本发明先采用醋酸根型的阴离子交换树脂将西曲瑞克粗品转醋酸盐，再进行反相高效液相色谱纯化，相比于现有技术先纯化再转盐，能减少醋酸根型的阴离子交换树脂的使用量，减少生产成本；本发明结合醋酸根型的阴离子交换树脂和反相高效液相色谱纯化可获得纯化高达99％以上，收率40％以上的醋酸西曲瑞克，本发明不仅操作更简单，制备时间缩短、原材料便宜易得、价格成本更低，而且不存在大量使用流动相的问题，减少对环境污染，更适合规模化纯化醋酸西曲瑞克的工艺方法，达到产业化要求。

附图说明

图1为本发明具体实施方式中实施例1的醋酸西曲瑞克粗品纯度的hplc图；

图2为本发明具体实施方式中实施例1的醋酸西曲瑞克粗品阴离子检测的hplc图；

图3为本发明具体实施方式中实施例1的醋酸西曲瑞克纯品纯度的hplc图；

图4为本发明具体实施方式中实施例1的醋酸西曲瑞克纯品阴离子检测的hplc图；

图5为本发明具体实施方式中实施例2的醋酸西曲瑞克纯品纯度的hplc图；

图6为本发明具体实施方式中实施例2的醋酸西曲瑞克纯品阴离子检测的hplc图；

图7为本发明具体实施方式中实施例3的醋酸西曲瑞克纯品纯度的hplc图；

图8为本发明具体实施方式中实施例3的醋酸西曲瑞克纯品阴离子检测的hplc图；

图9为本发明具体实施方式中实施例4的醋酸西曲瑞克纯品纯度的hplc图；

图10为本发明具体实施方式中实施例4的醋酸西曲瑞克纯品阴离子检测的hplc图；

图11为本发明具体实施方式中实施例5的醋酸西曲瑞克纯品纯度的hplc图；

图12为本发明具体实施方式中实施例5的醋酸西曲瑞克纯品阴离子检测的hplc图；

图13本发明具体实施方式中实施例6的醋酸西曲瑞克纯品纯度的hplc图；

图14为本发明具体实施方式中实施例6的醋酸西曲瑞克纯品阴离子检测的hplc图。

具体实施方式

为详细说明本发明的技术内容、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图予以说明。

本发明最关键的构思在于:本发明先将西曲瑞克粗品转醋酸盐，再用反相高效液相色谱纯化，减少醋酸根型的阴离子交换树脂和流动相的用量，节约了成本、减少对环境污染，纯化效率高，适合实现规模化纯化醋酸西曲瑞克。

本发明提供一种纯化醋酸西曲瑞克的方法，包括如下步骤：

步骤1、树脂处理：阴离子树脂处理成醋酸根型的阴离子树脂；

步骤2、转盐：西曲瑞克粗品加水溶解，加入步骤1所得的醋酸根型的阴离子树脂，在温度为25～30℃的条件下搅拌，控制溶液的ph为2.5～3.5，过滤收集滤液；

步骤3、纯化：反相色谱柱用流动相平衡，所述流动相由流动相a和流动相b组成，所述流动相a为水溶液，所述流动相b为乙腈溶液，所述流动相a和所述流动相b均加入质量百分数为0.1％～1％的醋酸溶液，将步骤2所得的滤液上样、洗脱，并分段收集洗脱液，洗脱液浓缩后冻干或直接冻干，获得粉末状醋酸西曲瑞克纯品。

从上述描述可知，本发明的有益效果在于：本发明先采用醋酸根型的阴离子交换树脂将西曲瑞克粗品转醋酸盐，再进行反相高效液相色谱纯化，相比于现有技术先纯化再转盐，能减少醋酸根型的阴离子交换树脂的使用量，减少生产成本；本发明结合醋酸根型的阴离子交换树脂和反相高效液相色谱纯化可获得纯化高达99％以上，收率40％以上的醋酸西曲瑞克，本发明不仅操作更简单，制备时间缩短、原材料便宜易得、价格成本更低，而且不存在大量使用流动相的问题，减少对环境污染，更适合规模化纯化醋酸西曲瑞克的工艺方法，达到产业化要求。

进一步的，所述步骤1中的阴离子树脂用氢氧化钠溶液或醋酸溶液交替处理，转成醋酸根型的阴离子树脂。

进一步的，所述步骤2中的西曲瑞克粗品：水：醋酸根型的阴离子树脂的重量比为1：100～400：10～200。

进一步的，所述步骤3中的反相色谱柱为烷基键合硅胶填料，粒径为3～10μm，孔径为80～200a°。

进一步的，所述步骤3中的反相色谱柱为c18填料，粒径为10μm，孔径为100a°。

进一步的，所述步骤3中的洗脱为等度洗脱，所述流动相a与所述流动相b的体积比为80:20～40:60。

进一步的，所述步骤3中的洗脱为等度洗脱，所述流动相a与所述流动相b的体积比为70:30～40:60。

进一步的，所述步骤3中的洗脱为梯度洗脱，所述流动相b％的变化率为0.1％～2％/min。

进一步的，包括如下步骤：

步骤1、树脂处理：强碱型阴离子树脂用氢氧化钠溶液或醋酸溶液交替处理，转成醋酸根型的阴离子树脂；

步骤2、转盐：西曲瑞克粗品加水溶解，加入步骤1所得的醋酸根型的阴离子树脂，西曲瑞克粗品：水：醋酸根型的阴离子树脂的重量比为1:150～250:20～50，在温度为25～30℃的条件下搅拌1～2h，控制溶液的ph为2.5～3.5，过滤收集滤液；

步骤3、纯化：反相色谱柱用流动相平衡，所述反相色谱柱为c18填料，粒径为10μm，孔径为100a°，所述流动相由流动相a和流动相b组成，所述流动相a为水溶液，所述流动相b为乙腈溶液，所述流动相a和所述流动相b均加入质量百分数为0.1％～1％的醋酸溶液，将步骤2所得的滤液上样，进行等度洗脱，所述等度洗脱的流动相a与所述流动相b的体积比为70:30～40:60，分段收集洗脱液，洗脱液直接冻干，获得粉末状醋酸西曲瑞克纯品。

实施例1

一种纯化醋酸西曲瑞克的方法，包括如下步骤：

步骤1、树脂处理：醋酸根型的阴离子树脂经0.1mol/l的醋酸溶液浸泡，过滤收集树脂；

步骤2、转盐：1g西曲瑞克粗品加100ml水溶解，加入步骤1的醋酸根型的阴离子树脂10g，在温度为25℃的条件下搅拌0.5h，控制溶液的ph为2.5，过滤收集滤液。粗品纯度的hplc图谱如图1所示，西曲瑞克粗品的阴离子检测的hplc图谱如图2所示；

步骤3、纯化：粒径为3μm，孔径为120a°的反相c18柱用流动相平衡，所述流动相a为水溶液，所述流动相b为乙腈溶液，所述流动相a和所述流动相b均加入质量百分数为0.5％醋酸溶液，步骤2收集的滤液上样，进行线性梯度洗脱，流动相b％的变化率为0.1％/min，检测波长220nm，分段收集洗脱液，直接冻干后获得粉末状醋酸西曲瑞克纯品20mg，收率为40％，纯度达到99.193％，醋酸西曲瑞克纯品纯度的hplc图谱如图3所示，纯品的阴离子检测的hplc图谱如图4所示。

实施例2

步骤1、树脂处理：用2个床体积的1mol/l醋酸溶液，以2cm/min的速度，淋洗氢氧根型树脂，淋洗至淋洗液ph＜2，再以超纯水洗至ph＞4.8，使氢氧根型阴离子树脂转为醋酸根型阴离子树脂，过滤，收集醋酸根型阴离子树脂。

步骤2、转盐：1g西曲瑞克粗品加250ml水溶解，加入步骤1醋酸根型的阴离子树脂50g，在温度为30℃的条件下搅拌2h，控制溶液的ph为3.5，过滤收集滤液；

步骤3、纯化：粒径为5μm，孔径为120a°的反相c18柱用流动相平衡，所述流动相a为水溶液，所述流动相b为乙腈溶液，所述流动相a和所述流动相b均加入质量百分数为0.1％的醋酸溶液，步骤2收集的滤液上样，按流动相体积比a:b＝70:30进行等度洗脱60min，检测波长220nm，分段收集洗脱液，洗脱液减压旋蒸浓缩、冻干，获得粉末状醋酸西曲瑞克纯品23mg，收率为46％，纯度达到99.312％，醋酸西曲瑞克纯品纯度的hplc图谱如图5所示，纯品的阴离子检测的hplc图谱如图6所示。

实施例3

步骤1、树脂处理：用约20个床体积(或适合体积)的1mol/lnaoh溶液，2cm/min淋洗氯型阴离子树脂，淋洗至淋洗液不含cl-(硝酸银滴定，不产生白色沉淀)，用水洗至中性，再按实施例2中氢氧根型→醋酸根型的方法，树脂转成醋酸根型的阴离子树脂；

步骤2、转盐：1g西曲瑞克粗品加250ml水溶解，加入步骤1的醋酸根型的阴离子树脂40g，在温度为28℃的条件下搅拌1h，控制溶液的ph为3，过滤收集滤液；

步骤3、纯化：粒径为5μm，孔径为80a°的反相c18柱用流动相平衡，所述流动相a为水溶液，所述流动相b为乙腈溶液，所述流动相a和所述流动相b均加入质量百分数为1％的醋酸溶液，步骤2收集的滤液上样，进行线性梯度洗脱，流动相b％的变化率为1％/min，检测波长220nm，分段收集洗脱液，直接冻干后获得粉末状醋酸西曲瑞克纯品26mg，收率为52％，纯度达到99.599％，醋酸西曲瑞克纯品纯度的hplc图谱如图7所示，纯品的阴离子检测的hplc图谱如图8所示。

实施例4

步骤1、树脂处理：用约20个床体积(或适合体积)的1mol/lnaoh溶液，2cm/min淋洗氯型阴离子树脂，淋洗至淋洗液不含cl-(硝酸银滴定，不产生白色沉淀)，用水洗至中性，再按实施例2中氢氧根型→醋酸根型的方法，树脂转成醋酸根型的阴离子树脂；

步骤2、转盐：1g西曲瑞克粗品加250ml水溶解，加入步骤1的醋酸根型的阴离子树脂50g，在温度为25℃的条件下搅拌1.5h，控制溶液的ph为3，过滤收集滤液；

步骤3、纯化：粒径为10μm，孔径为120a°的反相c18柱用流动相平衡，所述流动相a为水溶液，所述流动相b为乙腈溶液，所述流动相a和所述流动相b均加入质量百分数为1％的醋酸溶液，步骤2收集的滤液上样，按流动相体积比a:b＝40:60进行等度洗脱，检测波长220nm，分段收集洗脱液，直接冻干后获得粉末状醋酸西曲瑞克纯品27.5mg，收率为55％，纯度达到99.685％，醋酸西曲瑞克纯品纯度的hplc图谱如图9所示，纯品阴离子检测的hplc图谱如图10所示。

实施例5

步骤1、树脂处理：用约20个床体积(或适合体积)的1mol/lnaoh溶液，2cm/min淋洗氯型阴离子树脂，淋洗至淋洗液不含cl^-(硝酸银滴定，不产生白色沉淀)，用水洗至中性，再按实施例2中氢氧根型→醋酸根型的方法，树脂转成醋酸根型的阴离子树脂；

步骤2、转盐：1g西曲瑞克粗品加250ml水溶解，加入步骤1的醋酸根型的阴离子树脂50g，在温度为25℃的条件下搅拌1h，控制溶液的ph为3，过滤收集滤液；

步骤3、纯化：粒径为10μm，孔径为100a°的反相c18柱用流动相平衡，所述流动相a为水溶液，所述流动相b为乙腈溶液，所述流动相a和所述流动相b均加入质量百分数为1％的醋酸溶液，步骤2收集的滤液上样，按流动相体积比a:b＝45:55进行等度洗脱，检测波长220nm，分段收集洗脱液，直接冻干后获得粉末状醋酸西曲瑞克纯品30mg，收率为60％，纯度达到99.991％，醋酸西曲瑞克纯品纯度的hplc图谱如图11所示，纯品阴离子检测的hplc图谱如图12所示。

实施例6

一种纯化醋酸西曲瑞克的方法，包括如下步骤：

步骤1、树脂处理：醋酸根型的阴离子树脂经0.1mol/l的醋酸溶液浸泡，过滤收集树脂；

步骤2、转盐：1g西曲瑞克粗品加100ml水溶解，加入步骤1的醋酸根型的阴离子树脂10g，在温度为25℃的条件下搅拌0.5h，控制溶液的ph为2.5，过滤收集滤液粗品纯度的hplc图谱如图1所示，西曲瑞克粗品的阴离子检测的hplc图谱如图2所示；

步骤3、纯化：粒径为3μm，孔径为120a°的反相c18柱用流动相平衡，所述流动相a为水溶液，所述流动相b为乙腈溶液，所述流动相a和所述流动相b均加入质量百分数为0.5％醋酸溶液，步骤2收集的滤液上样，进行线性梯度洗脱，流动相b％的变化率为2％/min，检测波长220nm，分段收集洗脱液，直接冻干后获得粉末状醋酸西曲瑞克纯品32.5mg，收率为65％，纯度达到99.594％，醋酸西曲瑞克纯品纯度的hplc图谱如图13所示，纯品阴离子检测的hplc图谱如图14所示。

综上所述，本发明提供的一种纯化醋酸西曲瑞克的方法，先采用醋酸根型的阴离子交换树脂将西曲瑞克粗品转醋酸盐，再进行反相高效液相色谱纯化，相比于现有技术先纯化再转盐，能减少醋酸根型的阴离子交换树脂的使用量，减少生产成本；本发明结合醋酸根型的阴离子交换树脂和反相高效液相色谱纯化可获得纯化高达99％以上，收率40％以上的醋酸西曲瑞克，本发明不仅操作更简单，制备时间缩短、原材料便宜易得、价格成本更低，而且不存在大量使用流动相的问题，减少对环境污染，更适合规模化纯化醋酸西曲瑞克的工艺方法，达到产业化要求。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等同变换，或直接或间接运用在相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。