本发明涉及分子生物技术领域，尤其是涉及一种鉴别岱衢族大黄鱼和闽-粤东族大黄鱼的方法及其用途。
背景技术：
大黄鱼(pseudosciaenacrocea(richardson))，隶属鲈形目(perciformes)鲈亚目(percoidei)石首鱼科(sciaenidae)黄鱼属(pseudosciaena)，属于亚热带集群性近海鱼类，分布于黄海中部以南至琼州海峡以东的中国大陆近海及朝鲜西海岸，雷州半岛以西也偶有发现。根据大黄鱼的外部形态和生态地理学特征，我国沿海大黄鱼分为3个地理种群。其中，岱衢族，分布于黄海南部至东海中部，包括吕泗洋、岱衢洋、猫头洋、洞头洋至福建嵛山岛附近；闽-粤东族，主要分布在东海南部、台湾海峡和南海北部(嵛山岛以南至珠江口)。
因岱衢族大黄鱼在体色、体型、营养价值和风味方面等方面的优势,在市场上价格要比闽-粤东族大黄鱼高;在养殖方面,其生长速度、成活率、发病率、饵料系数和抗寒能力等方面也强于福建的闽-粤东族大黄鱼。而在宁波、舟山地区养殖的大黄鱼绝大部分为闽-粤东族大黄鱼,其在外观上与岱衢族大黄鱼很相似,采用传统的性状观察,主观性强,也很难进行有效区分。
技术实现要素：
本发明的目的之一在于一种鉴别时间短，可有效避免假阴性结果，准确率高的鉴别岱衢族大黄鱼和闽-粤东族大黄鱼的方法。
本发明的目的之二在于将鉴别岱衢族大黄鱼和闽-粤东族大黄鱼的方法用于快速准确地鉴别岱衢族大黄鱼和闽-粤东族大黄鱼，克服了形态特征鉴定的缺陷，解决了种质混杂的问题，为种质保护、合理利用以及种质的生物多样性研究提供了技术支撑。
本发明针对背景技术中提到的问题，采取的技术方案为：鉴别岱衢族大黄鱼和闽-粤东族大黄鱼的方法，鉴定引物为：
j1：f1:5’-ggcatttacacacatggac-3’;r1:5’-gggatcacaacagagcgg-3’
j2：f2:5’-cattcccttccgcgctagt-3’;r2:5’-ggctgcaagttcctgac-3’。充分利用两种地理种群大黄鱼基因的高频差异位点，同时兼顾引物的二级结构，利用引入错配碱基的方法，设计出的本发明的鉴定引物。设计得到的鉴定引物特异性强，pcr扩增效率高，相较于现有技术，鉴别时间更短，准确率更高。
鉴别岱衢族大黄鱼和闽-粤东族大黄鱼的方法，具体操作步骤：
1）采用标准酚-氯仿法提取大黄鱼总dna作为模板dna，琼脂电泳检测dna质量，紫外分光光度计测定dna浓度，并设计鉴定引物：
j1：f1:5’-ggcatttacacacatggac-3’;r1:5’-gggatcacaacagagcgg-3’
j2：f2:5’-cattcccttccgcgctagt-3’;r2:5’-ggctgcaagttcctgac-3’；
2）配置pcr扩增体系，总体积为25μl，各成分及终浓度为buffer10mm，dntp0.2mm，mgcl21.5mm，4种引物每种0.2mm，taq1u，大黄鱼dna50ng，用双蒸水补齐到25μl。pcr扩增，95℃预变性5min，然后95℃变性20s，60℃退火20s，72℃延伸1min，进行30个循环，最后72℃延伸5min。上述pcr扩增条件能使两对引物的pcr扩增同步进行。取扩增得到的产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，并采用紫外凝胶成像系统观察、照相，琼脂糖凝胶的浓度为1％-1.5％。将电泳结果与标准图谱对比，若图谱中1000~1500bp区间内仅有一条1250bp的条带，则为岱衢族大黄鱼；若图谱中1000~1500bp区间内仅有一条1085bp的条带，则为闽-粤东族大黄鱼。仅仅通过观察凝胶电泳图就可以鉴别岱衢族大黄鱼和闽-粤东族大黄鱼，既省去了繁琐复杂的形态鉴定程序，又节约了成本，更重要的是大大提高了工作效率。
为优化上述方案，所采取的措施为：配置pcr扩增体系，总体积为25μl，各成分及终浓度为buffer10mm，dntp0.2mm，mgcl21.5mm，4种引物每种0.2mm，taq1u，大黄鱼dna50ng，再加入1.6ng2-氯-5-硝基苯甲酸和0.1ng二苯基甲醇，用双蒸水补齐到25μl。pcr扩增，95℃预变性5min，然后95℃变性20s，60℃退火20s，72℃延伸1min，进行30个循环，最后72℃延伸5min。2-氯-5-硝基苯甲酸、二苯基甲醇和镁离子具有协同作用，不仅能够极大地激活taq聚合酶的活性，提高扩增反应效率，缩短鉴别的时间，而且能够钝化dna模板所含有的pcr抑制物，避免了假阴性结果的出现，使鉴别结果更加准确。
与现有技术相比，本发明的优点在于：充分利用两种地理种群大黄鱼基因的高频差异位点，同时兼顾引物的二级结构，利用引入错配碱基的方法，设计出的本发明的鉴定引物。设计得到的鉴定引物特异性强，pcr扩增效率高，相较于现有技术，鉴别时间更短，准确率更高。仅仅通过观察凝胶电泳图就可以鉴别岱衢族大黄鱼和闽-粤东族大黄鱼，既省去了繁琐复杂的形态鉴定程序，又节约了成本，更重要的是大大提高了工作效率。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明方案作进一步说明：
实施例1：
鉴别岱衢族大黄鱼和闽-粤东族大黄鱼的方法，具体操作步骤：
1）采用标准酚-氯仿法提取大黄鱼总dna作为模板dna，琼脂电泳检测dna质量，紫外分光光度计测定dna浓度，并设计鉴定引物：
j1：f1:5’-ggcatttacacacatggac-3’;r1:5’-gggatcacaacagagcgg-3’
j2：f2:5’-cattcccttccgcgctagt-3’;r2:5’-ggctgcaagttcctgac-3’；
2）配置pcr扩增体系，总体积为25μl，各成分及终浓度为buffer10mm，dntp0.2mm，mgcl21.5mm，4种引物每种0.2mm，taq1u，大黄鱼dna50ng，用双蒸水补齐到25μl。pcr扩增，95℃预变性5min，然后95℃变性20s，60℃退火20s，72℃延伸1min，进行30个循环，最后72℃延伸5min。上述pcr扩增条件能使两对引物的pcr扩增同步进行。取扩增得到的产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，并采用紫外凝胶成像系统观察、照相，琼脂糖凝胶的浓度为1％-1.5％。将电泳结果与标准图谱对比，若图谱中1000~1500bp区间内仅有一条1250bp的条带，则为岱衢族大黄鱼；若图谱中1000~1500bp区间内仅有一条1085bp的条带，则为闽-粤东族大黄鱼。
实施例2：
鉴别岱衢族大黄鱼和闽-粤东族大黄鱼的方法，具体操作步骤：
1）采用标准酚-氯仿法提取大黄鱼总dna作为模板dna，琼脂电泳检测dna质量，紫外分光光度计测定dna浓度，并设计鉴定引物：
j1：f1:5’-ggcatttacacacatggac-3’;r1:5’-gggatcacaacagagcgg-3’
j2：f2:5’-cattcccttccgcgctagt-3’;r2:5’-ggctgcaagttcctgac-3’；
2）配置pcr扩增体系，总体积为25μl，各成分及终浓度为buffer10mm，dntp0.2mm，mgcl21.5mm，4种引物每种0.2mm，taq1u，大黄鱼dna50ng，再加入1.6ng2-氯-5-硝基苯甲酸和0.1ng二苯基甲醇，用双蒸水补齐到25μl。pcr扩增，95℃预变性5min，然后95℃变性20s，60℃退火20s，72℃延伸1min，进行30个循环，最后72℃延伸5min。上述pcr扩增条件能使两对引物的pcr扩增同步进行。取扩增得到的产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，并采用紫外凝胶成像系统观察、照相，琼脂糖凝胶的浓度为1％-1.5％。将电泳结果与标准图谱对比，若图谱中1000~1500bp区间内仅有一条1250bp的条带，则为岱衢族大黄鱼；若图谱中1000~1500bp区间内仅有一条1085bp的条带，则为闽-粤东族大黄鱼。
本发明的操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。
以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110>浙江海洋大学
<120>鉴别岱衢族大黄鱼和闽-粤东族大黄鱼的方法及其应用
<160>4
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>19
<212>dna
<213>大黄鱼(pseudosciaenacrocea)
<400>1
ggcatttacacacatggac19
<210>2
<211>18
<212>dna
<213>大黄鱼(pseudosciaenacrocea)
<400>2
gggatcacaacagagcgg18
<210>3
<211>19
<212>dna
<213>大黄鱼(pseudosciaenacrocea)
<400>3
cattcccttccgcgctagt19
<210>4
<211>17
<212>dna
<213>大黄鱼(pseudosciaenacrocea)
<400>4
ggctgcaagttcctgac17