本发明涉及分子生物学
技术领域：
，进一步涉及筛查慢性粒细胞白血病相关基因突变的检测试剂盒及其医学解读数据库，具体涉及一种检测cml相关基因群的检测试剂盒。
背景技术：
：cml(chronicmyeloidleukaemia即慢性粒细胞白血病)是骨髓造血干细胞克隆性增殖形成的恶性肿瘤，占成人白血病的15％，全球年发病率为1.6～2/10万。其临床特征为贫血、中性粒细胞极度增多并出现未成熟粒细胞，嗜碱性粒细胞增多，常伴有血小板增多和脾肿大。超过95％的病人会出现9号染色体和22号染色体相互易位，导致22号染色体缩短，称为费城染色体。目前检测cml的方法主要涉及细胞形态、流式细胞学、细胞遗传学、分子生物学等。其中分子生物学的实验方法主要有bcr-abl融合基因、一代测序等。bcr-abl融合基因适于检测费城染色体阳性的cml，但是仍有部分cml需要其他检测手段检测，而一代测序的方法受到测序通量的影响，无法一次性检测多个基因的全部外显子区域。而二代测序作为一种高通量的检测方法，可以一次性准确测量多个基因的外显子序列，使精准治疗成为可能。技术实现要素：本发明旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种检测cml相关基因群的检测试剂盒，以解决现有技术中慢性粒细胞白血病的诊断方法较为局限，缺乏从分子生物学的角度诊断慢性粒细胞白血病的依据。本发明要解决的另一技术问题是现有技术中慢性粒细胞白血病的诊断方法较为局限。为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：一种检测cml相关基因群的检测试剂盒，该试剂盒检测如表1所示的9个基因的突变情况：表1cml基因群列表abl1asxl1atmcsf3rfgfr3myh11ptentet2tp53。上述9个基因，由225个热点突变组成，其突变位点为本领域常规的突变位点，较佳地包括了indel突变位点(插入或缺失引起的序列改变insertionordeletion，indel)、无义突变位点、拼接区突变位点或错义突变位点，更佳地本发明所述的9个基因外显子区域的热点突变如表2所示。表2热点突变列表本发明所述的9个基因外显子区域的热点突变可用于对cml做出辅助诊断，本领域cml常规的诊断方法有形态学、细胞遗传学和流式细胞学和bcr-abl融合基因检测，本发明所述方法较佳地从基因水平对cml做出诊断。本发明提供一组检测本发明所述cml相关基因外显子区域的多重pcr引物，所述引物的扩增范围包括9个与cml相关基因的外显子区域，扩增得到的单个片段长度为250bp左右。利用本发明提供的多重pcr引物，结合二代测序技术，能够检测本发明所述突变基因群中的全部外显子区域。其中所述的二代测序试剂为本领域常规使用的试剂，只要能够满足对所得序列进行二代测序的要求即可。所述试剂制备方法为本领域常规制备方法，较佳地为市售可得。本发明所述检测试剂盒更佳地还包括将检测对象中提取的基因组dna制成可供测序使用的文库的试剂，该种试剂为本领域常规使用试剂，只要能够满足多重pcr对基因组dna质量的要求即可。所述试剂制备方法为本领域常规制备方法，较佳地为市售可得。本发明所述检测试剂盒较佳地还包括：dntp溶液，dna聚合酶，用于分离或纯化核酸的是backman磁珠。本发明所述的样本为检测对象的组织，只要能从检测样本中抽提检测对象的基因组dna即可。所述检测样本较佳地为骨髓、血液、实体瘤样本中的一种或几种，优选地为骨髓样本。一种本发明所述试剂盒的使用方法，其包括以下步骤：(1)利用本发明所述检测试剂盒抽提检测对象的骨髓，提取基因组dna；(2)用多重pcr引物对基因组dna中发明中所述9个cml相关基因的外显子区域进行扩增；(3)将步骤(2)中扩增所得的片段制成可供iontorrent测序平台测序的文库；(4)对步骤(3)中所得dna文库进行测序，得到下机数据；(5)对(4)中的下机数据进行生物信息学分析，而后利用医学解读数据库进行解读做出诊断即可。以上各个步骤的具体操作方法详见试剂盒说明书。本发明所用的试剂和原料均市售可得。本发明的积极进步效果在于：利用本发明提供的可用于筛查cml相关基因突变的基因群，结合高通量测序技术，可以实现在形态学和流式细胞学之外对cml进行辅助诊断，特别是对于疾病预后做出评估和针对相关靶药的作用效果做出预判具有特殊的优势。本发明提供的用于筛查cml相关基因突变的基因群的检测试剂盒具有检测效率高、检出率高等优点。具体实施方式以下将对本发明的具体实施方式进行详细描述。为了避免过多不必要的细节，在以下实施例中对属于公知的结构或功能将不进行详细描述。除有定义外，以下实施例中所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。材料和方法：在中国医学科学院血液病医院和协和华美医学诊断中心2015年8月至2017年4月诊断的患者中，根据以下标准，我们进行连续性入组(40名)。入选标准为：经细胞形态学和流式细胞学诊断为慢性粒细胞白血病(cml)的患者。40名患者的诊断结果如表3所示：表3患者诊断结果列表收集3ml患者骨髓提取基因组dna待测，该检测经过中国医学科学院血液病医院伦理委员会批准。样本处理：样本中基因组利用天根dna提取试剂盒(货号：dp318-03)进行抽提，具体操作方法参见试剂盒的使用说明书。用多重pcr引物对基因组dna进行扩增，实验操作方法参见life公司试剂盒的使用说明书。文库的构建：对扩增得到的dna片段使用life公司生产的iontorrent平台建库试剂盒进行测序文库的构建，实验操作方法参见life公司试剂盒的使用说明书。高通量测序：将构建好的测序文库经油包水pcr后在iontorrent平台上进行高通量测序，油包水pcr方法和高通量测序方法请参考高通量测序仪iontorrent以及其配套设备onetouch的使用说明书。生物信息学分析：首先，使用ionreport软件(v4.6,thermofisher,carlsbad,ca,usa)过滤低质量的测序片段，并将合格的测序片段比对到人类参考基因组hg19(http://hgdownload.cse.ucsc.edu/downloads.html)，使用torrentvariantccmler(v4.6.0.7)子程序检测突变位点，软件参数使用的是默认的设置。此软件已经被优化用于处理iontorrent测序平台特有的错误类型。最后对找出的突变包括snp和indel使用annovar(http://annovar.openbioinformatics.org/en/latest/)软件进行注释，注释内容包括突变在基因组中的位置，关联的基因，基因外显子编号，核苷酸水平变异，对应的蛋白水平变异，该突变在dbsnp(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/)，1000genomes数据库(http://www.1000genomes.org/)和癌症突变数据库cosmic(http://cancer.sanger.ac.uk/cosmic)中的注释，polyphen(http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/)和sift(http://sift.jcvi.org/)功能预测结果等。进一步使用以下原则筛选致病突变位点：(1)根据突变所在的基因组位置和类型，过滤掉对蛋白产物序列不产生影响的突变；(2)利用1000genomes数据库，注释每个突变在人群中的比例，如果比例小于等于1％则不认为是多态性位点；(3)检索癌症数据库cosmic，查询每一个突变在cosmic中是否有记载，是否出现在血液系统肿瘤中；(4)利用蛋白质功能预测软件polyphen-2预测该突变是否影响蛋白功能；(5)如果经过(2)(3)(4)后，一个突变满足“非多态性”、“在血液系统肿瘤中记载过”和“影响蛋白功能”这三条中至少两条的，将被判为与疾病可能相关。最后，如果一个突变虽然不满足(5)但是在cosmic中记录为在肿瘤中检测到过，则被判读为意义不明的突变。最后如果一个突变在文献中被明确记载为与疾病高度相关，则直接判为热点突变。统计分析：统计每个基因携带致病突变的比例，筛选出突变率最高的基因，使用的软件为excel。医学解读：用医学解读数据库对生物信息学分析得出的基因突变型做出分子病理诊断。所用的医学解读数据库如下：(1)abl1激酶突变主要见于长期使用imatinib的cml患者，尤其是cml发生急变患者。abl1激酶突变是cml患者tki耐药的主要机制之一。当发生t315i突变时对imatinib,dasatinib,nilotinib和bosutinib耐药，t315i,f317l,v299l对dasatinib耐药，y253h,e255k/v和f359v/c对nilotinib耐药，t315i和v299l对bosutinib耐药；f317l,y253h,e255k/v和f359v/c/i对bosutinib敏感，y253h,e255v,t315i和f359v对ponatinib敏感，其他突变考虑高剂量伊马替尼或达沙替尼或尼罗替尼；y253h,e255k/v,f359v和ct315i和疾病预后和复发密切相关。(nccnguidelinesversion2.2017；pmid:18403620；19589924；19652056)(2)asxl1突变可见于aml,cml,mds,mpn等多种髓系肿瘤，突变大多位于exon12，可有错义突变、无义突变、框移突变以及移码突变等多种形式。在aml中，asxl1突变在aml-mrc中比例最高，继发性aml患者比原发性aml患者多见，并且患者年龄偏高，男性比女性多见。文献报道asxl1突变在aml,cmml,pmf,mds等多种疾病中均提示化疗效果不佳，预后不良。(pmid:28027687)(3)atm突变主要见于cll和mcl，在其他血液系统肿瘤亦有少量报道。atm基因位于11q，突变可导致基因功能丧失，突变形式主要是移码、无义、错义以及11q缺失。11q缺失导致的atm突变cll患者疾病进展较快，生存期短。杂合的atm基因胚系突变在cll疾病的快速进展中也发挥重要作用。目前文献报道atm突变在mcl中尚不具有明显预后意义。(pmid:24584352；26314984；21933854；12697903；16461462)(4)csf3r突变主要见于cnl，也可见于acml,mm和儿童aml。2016who髓系肿瘤分类指出：csf3r突变与cnl具有密切关联，同时可见于不到10％的acml；另外严重的先天性中性粒细胞减少患者在慢性粒细胞减少症向aml转化过程中csf3r突变频率增高(pmid:7542747)。在cnl和acml中，该基因主要为两种突变形式：靠近膜的突变和截短突变；发生靠近膜的t615a和t618i突变的患者对ruxolitinib较为敏感，发生截短突变(如：w741x；y752x；d711fs,s783fs,w791x)的患者对dasatinib较为敏感(pmid:23656643)。csf3r突变的cmml患者预后较差(pmid:23774674)。(5)fgfr3突变多见于mm。fgfr3基因编码成纤维细胞生长因子受体3，能够影响有丝分裂以及细胞分化。(pmid:26282654；25269480)(6)myh11基因编码肌球蛋白。aml患者中可见myh11与cbfb基因发生融合，且cbfb-myh11突变的aml患者预后较好。(pmid：26376137)(7)pten突变主要见于all和lymphoma。petn是一个肿瘤抑制基因，在pi3k-akt通路中扮演重要角色。该基因失活能够激活pi3k-akt通路，导致白血病患者对化疗耐药，带有petn基因exon7突变的t-all患者复发风险增高。pten抑制剂为temsirolimus。egfr抑制剂cetuximab和mtor抑制剂everolimus都可干预pten突变导致的信号通路异常。(pmid:19829307)(8)tet2突变见于aml,mds,mpn,mds/mpn和lymphoma，多位于exon4或exon12，主要形式为错义、无义和移码突变。aml中tet2突变倾向发生于年纪较大患者，tet2突变在cn-aml(核型正常的aml)患者发生率约为23％，提示预后较差，如合并flt3-itd突变则提示预后更差，而且tet2突变和idh突变通常互斥。tet2突变可发生在约20％的mds和14％mpn中。tet2突变在mds中提示预后良好，而在mds/mpn和saml中提示预后不良。(pmid:21828143；19262601；19666869；22430270；21828143)(9)tp53突变主要见于mds,aml和cll。tp53突变的mds患者生存率降低且大多预后不良。tp53在cll中的突变频率约14％，与cll疾病进展相关；17p-和/或tp53突变的cll患者预后极差，且对于fludarabine,cyclophosphamide,rituximab治疗反应较差。作用于tp53及其通路相关的药物有cisplatin，fluorouracil,docetaxel,paclitaxel，aspirin。携带tp53基因突变的mds或aml患者可能对于dicitabine反应较好(pmid:21714648,27959731,23138133,23415222)。使用本发明试剂盒检测结果：40名患者所检测出9个基因的阳性率如下表4所示：表49个基因阳性率列表经统计后表明：(根据上述表格进行总结)由此可见，使用二代测序的方法对慢性粒细胞白血病进行辅助诊断，具有诊断准确、获得信息量大的特点。以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明。凡在本发明的申请范围内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。当前第1页12