本发明涉及个体化用药基因检测领域，具体而言，涉及一种检测药物基因组学基因型的引物组、试剂盒及指导个体化用药的检测方法。
背景技术：
：药物基因组学(pharmacogenomics,pgx)是研究基因变异所致的不同疾病对药物的不同反应的学科，其主要研究内容为基因组或基因变异对药物在人体内吸收、代谢、疗效及不良反应产生影响的现象及其机制。2016年7月临床药理学实施联盟(cpic)在geneticsinmedicine杂志上发表文献，将药物基因组学相关基因分为三大类：药物代谢酶类(cyp家族，ugt1a1，dpyd和tpmt)，药物转运体(如slco1b1)，高风险基因型(如hla-b)。药物体内代谢、转运及药物作用靶点基因的遗传变异及其表达水平的变化可通过影响药物的体内浓度和敏感性，导致药物反应性个体差异。近年来随着人类基因组学的发展，药物基因组学领域得到了迅猛发展，越来越多的药物基因组生物标记物及其检测方法相继涌现。药物基因组学已成为指导临床个体化用药、评估严重药物不良反应发生风险、指导新药研发和评价新药的重要工具，部分上市的新药仅限于特定基因型的适应症患者。美国fda已批准在140余种药物的药品标签中增加药物基因组信息，涉及的药物基因组生物标记物42个。此外，部分行业指南也将部分非fda批准的生物标记物及其特性(如mgmt基因甲基化)的检测列入疾病的治疗指南。药物反应相关基因及其表达产物的分子检测是实施个体化药物治疗的前提。药理学与遗传学结合的关键环节包括药物代谢动力学(pharmacokinetics，pk)和药物效应动力学(pharmacodynamics，pd)两方面。药物代谢动力学主要是定量研究药物在生物体内吸收、分布、代谢和排泄规律，侧重于阐明药物的体内过程；药物效应动力学主要研究药物对机体的作用、作用规律及作用机制，其内容包括药物与作用靶位之间相互作用所引起的生化、生理学和形态学变化，侧重于解释药物如何与作用靶点发生作用。对药物代谢酶和药物靶点基因进行检测可指导临床针对特定的患者选择合适的药物和给药剂量，实现个体化用药，从而提高药物治疗的有效性和安全性，防止严重药物不良反应的发生。目前对药物基因组学的检测只是基于单位点，只能检测单药。如果想要检测多个位点，只能进行多个试验检测，不仅成本高，而且周期长，不能满足临床需要。有鉴于此，特提出本发明。技术实现要素：本发明的第一目的在于提供一种检测药物基因组学基因型的引物组，该引物组是根据现有个体化用药相关基因的多个位点，经分析后，设计得到，能同时进行多个基因位点的检测，大大缩短检测周期，更好的满足临床需要。本发明的第二目的在于提供一种药物基因组学基因型检测试剂盒，为个体化用药基因的检测提供便利。本发明的第三目的在于提供一种指导个体化用药的检测方法，同时检测77个基因，219个位点，对160种药物在不同个体当中使用的安全性、有效性及毒副作用进行评估，节约了成本，提高了检测效率，经过多次试验论证，能够准确的检测目的基因，并能稳定准确的分析出对药物的综合用药评估信息。为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：一种检测药物基因组学基因型的引物组，包括390个引物；所述390个引物的核苷酸序列如seqidno：1-390所示。本发明提供的检测药物基因组学基因型的引物组，经过大量筛选和分析，最后对77个基因，219个位点，进行引物设计，得到的上述引物组，该引物组能同时实现对160种药物在不同个体当中使用的安全性、有效性及毒副作用进行检测，其所检测的位点基本覆盖了主要的药物代谢酶和药物转运体，随着更多的研究的开展，新的知识的出现，同样的检测位点，可以分析更多药物。本发明提供的检测药物基因组学基因型的方法极大地节约了成本，提高了检测效率，经过多次试验论证，能够准确的检测目的基因，并能稳定准确的分析出对药物的吸收代谢能力情况，更好的满足临床需要。本发明还提供了一种药物基因组学基因型检测试剂盒，含有上述的引物组。本发明提供的药物基因组学基因型检测试剂盒，为个体化用药基因的检测提供便利。进一步地，所述药物基因组学基因型检测试剂盒还包括增强子、dntps、缓冲液、酶、核酸纯化试剂、磁力架中的任一种或多种。进一步地，所述药物基因组学基因型测试剂盒还包括igt-i5和/或igt-i7,igt-i5的核酸序列如seqidno：391所示，igt-i7的核酸序列如seqidno：392所示。这两个核酸序列用于将目标序列进行进一步扩增。本发明还提供了一种指导个体化用药的检测方法，包括以下步骤：待检测样本采用上述的引物组以及上述的igt-i5和igt-i7进行多重pcr反应，进行文库的构建；得到的所述文库测序；对测序的结果进行分析，得到所述待检测样本的个体化用药信息。本发明提供的指导个体化用药的检测方法，先构建文库，根据文库的测序情况，分析得到待检测样本的个体化用药信息，方法简便易行，能够同时检测77个基因，219个位点，对160种药物在不同个体当中使用的安全性、有效性及毒副作用进行评估，节约了成本，提高了检测效率，经过多次试验论证，能够准确的检测目的基因。进一步地，所述待检测样本为唾液gdna或血液gdna。进一步地，dna在反应体系中的浓度为2ng/μl以上。进一步地，待检测样本采用上述的引物组进行pcr反应，得到的产物进行纯化；纯化的产物以igt-i5和igt-i7进行pcr反应，纯化，得到文库。优选地，所述纯化采用磁珠方法纯化。进一步地，待检测样本采用上述的引物组进行pcr反应时，所述引物组分为两组，t1引物池为seqidno：1-195所示，t2引物池为seqidno：196-390所示，两个引物组的反应体系均为25μl，反应完成后，两者按照16.5μl和13.5μl的体积合并，然后进行纯化。该反应体系中的各组分按照常规的反应添加相应的组分即可。进一步地，构建的文库的靶片段分布区间在280bp-420bp之间，主峰在380bp左右，无杂峰。与现有技术相比，本发明的有益效果为：(1)本发明提供的引物组，同时检测77个基因，219个位点，对160种药物在不同个体当中使用的安全性、有效性及毒副作用进行评估，节约了成本，提高了检测效率。(2)本发明通过这219个位点的基因检测信息对160种药物的个体化用药情况进行评估，受检者一次检测，终身受益。(3)本发明提供的指导个体化用药的检测方法，通过高通量测序技术实现，一次检测后进行软件分析即可完成，大大缩短了时间了，降低了成本。附图说明为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，以下将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。图1为本发明实施例2中提供的文库构建的过程示意图。具体实施方式下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。实施例1一、查询资料1.各大指南：cpic，dpwg，fda，cfda等相关权威平台给出关于germlinevariant与药物代谢和药物响应之间的关系。信息来源于各大平台的官方网站。2.pubmed相关信息：1)搜索主要关键词pharmacogenetics；2)从variant影响最终药物代谢和药物响应的角度搜索信息，包括相关药物的代谢酶、药物转运体、药物作用目标和药物通路上的调控因子。3.以上各种信息收集方式，借助了《基于机器学习的生物医学文本分类方法、系统和存储介质》(pn1750734ibj)帮助整个人工搜索校对过程，最终人工校正审核。二.评估查询数据：1.根据信息的实验设计方案，进行分类。2.根据信息描述的药物代谢变化，对应当前cpic的药物代谢类型标准进行分类，包括超快代谢、快代谢、正常代谢、慢代谢、超慢代谢等。3.根据结论的可重复性及最终用药影响进行评估，评估分为4个等级。4.同时，设立外部类似数据的等级评估对照，来源为pharmgkb。用于内部信息控制。三、位点选择标准：1.各大指南cpic、dpwg、fda、cfda等关于药物用药过程明确指出，或者建议检测的位点。2.相关的位点影响药物效果的结论必须具有可重复性，至少有两篇以上在人类里的研究结论支持；位点对药物的影响机制清晰；在亚洲人群里有一定的分布；证据等级在2及2以上。最后，选定77个基因，219个位点作为药物基因组学检测的目标，具体位点信息如下：chr11185637211856543mthfr；chr11225283712253000tnfrsf1b；chr12091549920915688cda_1；chr12091555720915750cda_2；chr19754459397544779dpyd_1；chr19754786997547970dpyd_2；chr19756407297564178dpyd_3；chr19756407297564178dpyd-as1；chr19791559697915741dpyd_4；chr19798117697981357dpyd_5；chr19803938098039570dpyd_6；chr19805877798058928dpyd_7；chr19815731898157480dpyd_8；chr19820586398206022dpyd_9；chr1161479572161479761fcgr2a；chr1161514437161514583fcgr3a；chr1169518930169519116f5；chr1201029830201029990cacna1s；chr1226019553226019737ephx1；chr2166892694166892828scn1a_1；chr2166909366166909562scn1a_2；chr2201526320201526444aox1；chr2211540420211540594cps1；chr2216197847216198057atic_1；chr2216212205216212380atic_2；chr2234627478234627652ugt1a5_1；chr2234627478234627652ugt1a4_1；chr2234627478234627652ugt1a8_1；chr2234627478234627652ugt1a10_1；chr2234627478234627652ugt1a9_1；chr2234627478234627652ugt1a7_1；chr2234627478234627652ugt1a6_1；chr2234668554234668666ugt1a5_2；chr2234668554234668666ugt1a4_2；chr2234668554234668666ugt1a3_1；chr2234668554234668666ugt1a8_2；chr2234668554234668666ugt1a10_2；chr2234668554234668666ugt1a9_2；chr2234668554234668666ugt1a7_2；chr2234668554234668666ugt1a6_2；chr2234668864234669065ugt1a5_3；chr2234668864234669065ugt1a4_3；chr2234668864234669065ugt1a3_2；chr2234668864234669065ugt1a8_3；234668864234669065ugt1a10_3；chr2234668864234669065ugt1a9_3；chr2234668864234669065ugt1a7_3；chr2234668864234669065ugt1a6_3；chr2234669131234669317ugt1a5_4；chr2234669131234669317ugt1a4_4；chr2234669131234669317ugt1a3_3；chr2234669131234669317ugt1a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na提取试剂盒qiagenflexigenednakit(250)(catno.51206)，参照说明书进行提取。(2)建库步骤1第一轮多重pcr反应1.多重pcr反应体系第一轮多重pcr反应分为2个反应管，使用的多重引物分别为primerpoolt1(seqidno：1-195),primerpoolt2(seqidno：196-390)。2个反应管内的其他试剂相同。具体反应体系如表1所示。表1反应体系ddh2o10-x5×multiplebuffer5enhancernb(1n)5dntps(10mm)0.5primerpool4gdnaxmultipleenzyme(2u/μl)0.5唾液gdna或血液gdna的起始量均为50ng/反应管；dna的浓度为qubit(lifetechnologies)的定量结果。注意：请按照上述表格中的反应体系和反应条件进行pcr反应，更改反应参数可能会导致文库的质量下降，甚至文库构建失败。2.多重pcr反应程序95℃3min30s；98℃20s,61℃4min,18个循环；72℃5min。步骤2第1轮pcr产物合并第1轮pcr反应结束后，2个反应管的pcr产物按照t1管16.5μl，t2管13.5μl进行合并，总体积为30μl。步骤3磁珠纯化合并产物1.向30μlpcr合并产物加入30μl室温平衡后的ampurexp磁珠，用移液器吸打混匀数次；2.室温孵育5min后，将pcr管置于dynamag-96side磁力架上3min；3.彻底移除上清，将pcr管从磁力架取下，向管内加入40μlyfbufferb，用移液器吸打混匀数次；4.室温孵育5min后，将pcr管置于dynamag-96side磁力架上3min；5.移除上清，pcr管继续放置在磁力架上，向管内加入100μl80％乙醇溶液，将pcr管在磁力架上来回放置，洗涤磁珠1.5min后彻底移除上清(建议使用10μl移液器移除底部残留乙醇溶液)；6.室温静置10min，使残留乙醇彻底挥发；7.将pcr管从磁力架取下，加入22μlnuclease-freewater，移液器轻轻吸打重悬磁珠,避免产生气泡，室温静置2min；8.将pcr管重新置于磁力架上，静置3min；9.用移液器吸取17μl上清液，转移到新的200μlpcr管内，管内上清液为合并后的多重pcr产物。步骤4第2轮接头序列pcr反应表2反应体系pcrproductmixture为上一步纯化后的多重pcr产物。igt-i5的序列如seqidno：391所示，igt-i7的序列如seqidno：392所示。2.多重pcr反应程序95℃3min30s；98℃20s，58℃1min，72℃30s，8个循环；72℃5min。注意：请按照上述表格中的反应体系和反应条件进行pcr反应，更改反应参数可能会导致文库的质量下降，甚至文库构建失败。步骤5第2轮磁珠纯化1.向25μlpcr反应体系内加入23μl室温平衡后的ampurexp磁珠，用移液器吸打混匀数次；2.室温孵育5min后，将pcr管置于dynamag-96side磁力架上3min；3.彻底移除上清，将pcr管至于dynamag-96side磁力架上3min；4.室温孵育5min后，将pcr管置于dynamag-96side磁力架上3min；5.移除上清，pcr管继续放置在磁力架上，向管内加入100μl80％乙醇溶液，将pcr管在磁力架上来回放置，洗涤磁珠1.5min后彻底移除上清(建议使用10μl移液器移除底部残留乙醇溶液)；6.室温静置10min，使残留乙醇彻底挥发；7.将离心管从磁力架取下，加入20μlnuclease-freewater或者1×tebuffer(ph8.0)，用移液器吸打混匀数次，重悬磁珠,避免产生气泡，室温静置2min；8.将pcr管重新置于磁力架上，静置3min；9.用移液器吸取18μl上清液，转移到新的pcr管中，管中上清为制备好的多重pcr文库。具体构建文库的过程如表1所示。步骤6文库定量1.取2μl文库使用3.0fluorometer(qubitdsdnahsassaykit)进行文库浓度测定，记录文库浓度。唾液gdna,血液gdna所构正常文库的浓度范围为5ng/μl-15ng/μl，文库浓度主要与模板的质量相关。步骤7文库质量检测取1μl文库样本使用agilent2100bioanalyzersystem(highsensitivitydnakit)或者使用qsep100全自动核酸蛋白分析系统(厚泽生物)进行文库片段长度和纯度测量，正常文库的靶片段分布区间在280bp-420bp之间，主峰在380bp左右，无杂峰。采用hiseq3000/4000测序平台进行测序，测序结果采用为朔医学数据科技(北京)有限公司开发的个性化药物筛查分析软件进行分析，直接可得到个体化用药的数据。本发明上述可检测的药物如表3所示。表3检测的药物实施例3按照实施例2的方法对样本检测，检测设备：illumina-2500，检测基因数目为77个，检测药物有效种类62个，其他检测的药物结果无意义，不再列出，结果如表4所示。表4检测结果表中，其他表示：门冬酰胺酶、阿糖胞苷、柔红霉素、地塞米松、依托泊苷、亚叶酸钙、甲氨蝶呤、强的松(糖皮质激素类药物)、长春新碱。表中，√表示按照说明书或遵医嘱服用药物；！表示有一定毒副反应风险或者药效较差。本发明提供的指导个体化用药的检测方法已经经过大量试验验证，均能能够准确的检测目的基因，并能稳定准确的分析出个体对药物的反应情况，不再一一列举。尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。当前第1页12