一种检测T1基因rs1047896多态位点的试剂盒、使用方法及应用与流程

本发明涉及一种检测t1基因rs1047896多态位点的试剂盒、使用方法及应用，属于生物医学技术领域。

背景技术：

心血管疾病是仅次于恶性肿瘤的第二号杀手，是造成死亡的主要原因之一。目前我国约有2.3亿人患冠心病、脑卒中、心力衰竭和高血压等心血管病。死于心血管病者每年近300万人。冠心病是主要的心血管疾病，找到这类疾病的早期预警标志物对于心血管疾病的预防有重要意义。

目前单核苷酸多态(snp)与冠心病之间的关联研究是寻找预测冠心病易感性的预警标志物的主要方法之一。snp是指基因组dna水平单个核苷酸变异引起的dna序列多态性。snp在正常人群广泛存在。人类无论种族在基因组dna序列上超过99％的序列都是相同的，snp是个体间的遗传差异的主要表现。snp可以在染色体印迹、dna修饰、rna二级结构、蛋白空间结构等多个水平上影响基因的表达及活性。另外snp遗传稳定性好，易于分析，因此snp成为疾病预警的主要标志物。目前找到更多的与冠心病相关的snp，对于未来冠心病的个体化医疗、精准医学有必要作用。

近年来研究发现脑源性神经营养因子及其受体酪氨酸激酶受体b(trkb)通路除了在中枢和外周神经元的生存、生长和维持中发挥重要作用外，也在心血管系统表达和发挥作用。研究表明该通路能促进心肌存活，促进胚胎发育中的血管生成以及成年心梗后的心肌内血管生成。我们的研究发现trkb在人和小鼠的主动脉内皮中大量表达，通过促进内皮钙粘蛋白的合成维持内皮完整。我们以前的研究还发现不稳定心绞痛病人的血浆脑源性神经营养因子浓度显著低于对照组，而且高的血浆脑源性神经营养因子浓度指示低的急性心血管事件发生率和低的死亡率，提示该通路在冠心病的发病及预后中发挥重要作用。我们的这一结果引起美国心肺血研究所framingham心脏研究中心主任vasans.ramachandran的兴趣，于是他领导了大样本的孟德尔随机临床研究(kaessbm，etal.jamheartassoc.2015；4:e001544)，进一步证实了我们的结论，即脑源性神经营养因子通路与冠心病存在因果关系。

t1蛋白是体内神经酪氨酸激酶受体2(ntrk2)的截短表达形式，是脑源性神经营养因子的另一种受体。t1与trkb拥有相同的胞外域，但是却有不同的胞内域，缺少trkb的胞内激酶区，因此能与trkb竞争结合细胞外的脑源性神经营养因子，却不能活化细胞内分子通路。trkb蛋白是胚胎发育期间高表达的脑源性神经营养因子受体；而在成年期，trkb蛋白表达相比胚胎发育期间明显降低，而t1蛋白成为脑源性神经营养因子主要的受体表达形式。未来针对冠心病的个体化医疗迫切需要大量的与冠心病相关的snp，我们前期研究曾发现影响trkb蛋白表达水平的一个多态位点与冠心病相关，但目前尚没有关于t1多态位点与冠心病相关联的研究报道。

技术实现要素：

针对现有技术的不足，本发明提供了一种检测t1基因rs1047896多态位点的试剂盒、使用方法及应用，首次发现了一个影响t1蛋白表达的功能多态位点，该多态位点为rs1047896多态位点，位于t1mrna的3′非翻译区(utr)，而且该多态位点与冠心病相关，可用于预测冠心病的易感性和未来冠心病的个体化医疗。

本发明的技术方案如下：

一种检测t1基因rs1047896多态位点的试剂盒，包括以下试剂：10×pcr缓冲液，10mmdntp混合液，5u/μltaqdna聚合酶，特异性引物对t1-f、t1-r，t等位基因荧光探针t1-t，c等位基因荧光探针t1-c，ddh2o；

其中，特异性引物对分别在t1基因rs1047896多态位点的上游和下游设计，扩增产物对应基因片段的核苷酸序列如seqidno.1所示，上游引物t1-f的核苷酸序列如seqidno.2所示，下游引物t1-r的核苷酸序列如seqidno.3所示；

其中，等位基因荧光探针特异靶向rs1047896多态位点，t等位基因荧光探针t1-t的荧光报告基团为fam，淬灭基团为tamra，c等位基因荧光探针t1-c的荧光报告基团为hex，淬灭基团为tamra；t等位基因荧光探针t1-t的核苷酸序列如seqidno.4所示，c等位基因荧光探针t1-c的核苷酸序列如seqidno.5所示。

上述试剂盒中10×pcr缓冲液、dntp混合液、taqdna聚合酶均为市售产品。

根据本发明优选的，所述检测t1基因rs1047896多态位点的试剂盒组成如下：

100μl10×pcr缓冲液；

100μl10mmdntp混合液；

50μltaqdna聚合酶，浓度5u/μl；

50μlt1-f引物，浓度为10μm；

50μlt1-r引物，浓度为10μm；

50μl探针t1-t，浓度为10μm；

50μl探针t1-c，浓度为10μm；

500μlddh2o。

一种检测t1基因rs1047896多态位点试剂盒的使用方法，包括如下步骤：

(1)提取待检测样品细胞的基因组dna；

(2)使用检测t1基因rs1047896多态位点的试剂盒，配制反应体系，采用实时定量pcr结合taqman探针技术检测fam通道和hex通道荧光值；

(3)将步骤(2)中检测的fam通道和hex通道荧光值代入excel中制作散点图，其中沿着x轴分布的为tt基因型，沿着y轴分布的为cc基因型，沿着对角线分布的为ct杂合子。

根据本发明优选的，上述步骤(1)中待检测样品为体液，包括外周血，房水，羊水，腹水，心包液及胸腔积液。

根据本发明优选的，上述步骤(2)中的反应体系为：10×pcr缓冲液2μl，10mmdntp混合液2μl，5u/μltaqdna聚合酶1μl，10μmt1-f引物1μl，10μmt1-r引物1μl，10μm探针t1-t1μl，10μm探针t1-c1μl，基因组dna2μl，ddh2o补足至20μl；实时定量pcr检测程序为：95℃预变性30秒；95℃变性0秒，60℃退火5秒，72℃延伸10秒，重复35个循环，每一次循环结束检测荧光；全部反应结束后检测荧光，用色彩补偿程序校正荧光值。

上述试剂盒在预测冠心病易感性中的应用，包括如下步骤：

(1)收集待检测样品，提取样品细胞的基因组dna；

(2)应用检测t1基因rs1047896多态位点的试剂盒，配制20μl反应体系，采用实时定量pcr结合taqman探针技术检测fam通道和hex通道荧光值，确定rs1047896多态位点的基因型；

(3)冠心病易感性预测：rs1047896多态位点的基因型tt纯合子较cc纯合子和ct杂合子患冠心病的风险显著增加，相对危险度为1.56。

根据本发明优选的，上述步骤(1)中待检测样品为体液，可包括外周血，房水，羊水，腹水，心包液及胸腔积液。

根据本发明优选的，上述步骤(2)中的实时定量pcr的20μl反应体系为：10×pcr缓冲液2μl，10mmdntp混合液2μl，5u/μltaqdna聚合酶1μl，10μmt1-f引物1μl，10μmt1-r引物1μl，10μm探针t1-t1μl，10μm探针t1-c1μl，基因组dna2μl，ddh2o补足至20μl；实时定量pcr的扩增程序为：95℃预变性30秒；95℃变性0秒，60℃退火5秒，72℃延伸10秒，重复35个循环，每一次循环结束检测荧光；全部反应结束后检测荧光，用色彩补偿程序校正荧光值。

根据本发明优选的，上述步骤(2)中rs1047896多态位点的基因型的确定方法为：将步骤(2)中检测的fam通道和hex通道荧光值代入excel中制作散点图，其中沿着x轴分布的为tt基因型，沿着y轴分布的为cc基因型，沿着对角线分布的为ct杂合子。

根据本发明优选的，上述步骤(3)中rs1047896多态位点的基因型tt纯合子较cc纯合子和ct杂合子患冠心病的风险显著增加，相对危险度为1.56。

有益效果：

1、本发明针对影响t1蛋白表达的功能多态位点rs1047896，提供了一种检测t1基因rs1047896多态位点的试剂盒，rs1047896多态位点位于t1mrna的3′非翻译区，该试剂盒包括用于扩增包含rs1047896多态位点的特异性引物，以及用于标记不同基因型的等位基因荧光探针，可快速、准确的检测t1基因rs1047896多态位点的基因型。

2、由于影响t1蛋白表达的功能多态位点rs1047896与冠心病的相关性，本发明所述检测t1基因rs1047896多态位点的试剂盒，可用于冠心病的预防、辅助诊断。

附图说明:

图1为rs1047896多态位点的等位基因鉴别图谱；

其中：沿着x轴分布的为tt基因型，沿着y轴分布的为cc基因型，沿着对角线分布的为ct杂合子；

图2为萤光素酶报告载体示意图及rs1047896多态位点对蛋白表达的影响。

具体实施方式

下面结合实施例和说明书附图对本发明的技术方案进行进一步说明，但并不仅限于此，其中采用的实验方法若无特殊说明均为常规方法。

本发明所用试剂及药品均为普通市售产品。其中，10×pcr缓冲液，10mmdntp混合液和taqdna聚合酶购自大连宝生物公司；罗氏高保真taq酶购自美国罗氏公司，双荧光素酶报告系统试剂盒购自promega公司，脂质体2000购自invitrogen公司。

实施例1：一种检测t1基因rs1047896多态位点的试剂盒

一种检测t1基因rs1047896多态位点的试剂盒，包括以下试剂：10×pcr缓冲液，10mmdntp混合液，5u/μl的taqdna聚合酶，特异性引物对t1-f、t1-r，t等位基因荧光探针t1-t，c等位基因荧光探针t1-c，ddh2o；

其中，待检测的t1基因rs1047896多态位点，位于t1mrna的3′非翻译区(utr)，pcr扩增产物对应基因片段的核苷酸序列(seqidno.1)如下，方框内为rs1047896多态位点：

attaaaattgacctgcaaagttaaaaaaaaattaaagttgagaacaggtataagtgcacactgaatagtctaatctacatgtaacacatattttagttgattttctatactctaatcagcactgaattcagagggtttgactttttcatctataacacagtgactaaaagagttaagggtatatataccatcactttgggacttggt

特异性引物对序列如下：

上游引物t1-f：5'-accaagtcccaaagtgat-3'(seqidno.2)，

下游引物t1-r：5'-attaaaattgacctgcaaag-3'(seqidno.3)；

等位基因荧光探针序列如下：

t等位基因t1-t：fam-gaaaatcatactaaaatat–tamra(seqidno.4)，

c等位基因t1-c：hex-gaaaatcacactaaaatat-tamra(seqidno.5)，

其中，fam为t等位基因荧光探针t1-t的荧光报告基团，tamra为淬灭基团，hex为c等位基因荧光探针t1-c的荧光报告基团，tamra为淬灭基团。

实施例2：一种检测t1基因rs1047896多态位点试剂盒的应用

冠心病组：血液样本数为1460，非冠心病组：血液样本数为1640。

dna提取方法：取血液样本1毫升，edta抗凝；10000rpm离心5min；用巴斯德吸管吸取白细胞层到一新的ep管中；加入0.2％nacl至900μl，颠倒混匀；10000rpm离心5min；去上清，加入100μl的10mmtris-hci和10mmedta重悬沉淀；加入300μl白细胞裂解液(含10％sds，25mg/ml蛋白酶k和10mg/mlrnasea)，颠倒混匀，37℃水浴过夜；用氯仿抽提2次，取水相；加入1/3体积3m醋酸钠溶液，2倍体积冷无水乙醇，颠倒混匀，沉淀dna；用70％乙醇洗沉淀2次；用te缓冲液溶解dna，然后用分光光度计测定dna浓度；调整所有标本的dna浓度为30ng/μl，-20℃保存。

应用检测t1基因rs1047896多态位点试剂盒，检测上述样本中rs1047896多态位点基因型，具体步骤如下：

1、根据上述样本数量，按照下表体系，配置总反应液，然后分装到罗氏毛细管中，分别加入提取的上述样本的基因组dna2μl,盖上盖子，离心将反应液甩到管底，用罗氏荧光定量pcr仪，上机检测fam通道和hex通道的荧光值；

表1实时定量pcr反应体系

2、pcr检测程序为：

95℃预变性30秒；95℃变性0秒，60℃退火5秒，72℃延伸10秒，重复35个循环，每一次循环结束检测荧光；全部反应结束后检测荧光，用色彩补偿程序校正荧光值。

3、将检测到的fam通道和hex通道荧光值代入excel中制作散点图，生成等位基因鉴别图谱，如图2所示，三种不同基因型在坐标系中位于不同位置，其中沿着x轴分布的为tt基因型，沿着y轴分布的为cc基因型，沿着对角线分布的为tc杂合子(图1)。

基因型频率及基因频率分布如表2所示：

表2基因型频率及基因频率分布情况

结果显示所有基因型频率都符合hardy-weinberg遗传平衡定律，统计效率为100％。rs1047896基因多态的基因频率和基因型频率在冠心病组及非冠心病组中显著不同，在冠心病组中tt基因型个体较非冠心病组明显增高(p<0.05)。

实施例3：rs1047896基因多态与冠心病的相关性检测

统计分析：表2中病例-对照的基因频率和基因型频率差异的比较以及遗传平衡的检验采用卡方检验。评价基因型与冠心病的关系采用logistic回归分析计算似然比及95％可信区间。连续变量的组间差异用studentt检验。分类变量比较采用卡方检验。所有统计检测设置双侧p<0.05为具有显著性差异。所有统计分析应用spss15.0软件(spss,chicago,il)。

统计结果：

1)对照-病例基本临床资料如表3所示：

表3对照-病例基本临床资料

2)rs1047896基因多态与冠心病显著相关

多因素logistic回归分析结果表明在消除性别，年龄和体重指数，血压，血脂和血糖等混淆因素的影响后，rs1047896多态tt基因型是冠心病的一个独立危险因素,tt纯合子相较cc纯合子和ct杂合子患冠心病的风险显著增加，相对危险度为1.56(1.28-1.91)，如表4所示：

表4

实施例4：rs1047896多态位点对t1蛋白表达水平的影响

应用罗氏高保真taq酶，pcr扩增t1基因含rs1047896基因多态位点的3′utr区。pcr扩增产物经酶切后克隆到pgl3质粒载体中产生pgl3-t1utr质粒。进行定点诱变产生分别含rs1047896位点c碱基和含rs1047896位点t碱基的报告质粒。

海肾荧光素酶对照质粒与目的质粒共转染作为内参来校正不同标本间转染效率的差异；用脂质体2000分别转染pgl3-t1utr-c和pgl3-t1utr-t报告质粒到hela细胞48小时后，加入萤光素酶底物并用多功能酶标仪的化学发光功能检测结果。实验结果采用三次重复实验的平均值。

结果表明，在hela细胞中pgl3-t1utr-c组的荧光素酶活性显著低于pgl3-t1utr-t组(图2)，说明pgl3-t1utr-c和pgl3-t1utr-t相比，t1蛋白的表达显著降低。

sequencelisting

<110>山东大学齐鲁医院

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