用于检测犬源锡兰钩虫和犬钩虫的SNP分子标记ITS71、引物及其应用的制作方法

本发明属于钩虫病诊断和检测
技术领域：
，具体涉及一种用于检测犬源锡兰钩虫和犬钩虫的snp分子标记its71、tm-shift引物及其应用。
背景技术：
：钩虫(ancylostome)是呈世界性分布的常见寄生虫，可对犬猫和人的健康造成严重的危害。寄生于犬的钩虫有犬钩虫(ancylostomacaninum)、锡兰钩虫(a.ceylanicum)、巴西钩虫(a.braziliense)和狭头钩虫(uncinariastenocephala)(chiltonandgasser,1999)。据调查，近年来中国犬感染的钩虫主要为锡兰钩虫和犬钩虫(liuetal.,2015)。目前，锡兰钩虫在亚洲已成为感染人的第二大类钩虫(traub,2013)，特别是在东南亚国家，如中国(chenetal.,2012；liuetal.,2014)、日本(kayaetal.,2016)、马来西亚(nguietal.,2012)、老挝(conlanetal.,2012)、泰国(traubetal.,2008)、印度(traubetal.,2007)等地。该虫是唯一可在人体内发育为成虫的动物源性钩虫。犬钩虫是分布最为广泛的钩虫种类，在世界范围内均有分布，除感染犬之外，亦可感染人(bowmanetal.,2010)。上述两种钩虫均为人畜共患的寄生虫，能寄生于宿主的消化道，夺取营养，造成肠道出血、贫血，营养不良和皮炎等严重的症状(hotezetal.,2014；georgeetal.,2016)。因此，建立犬源锡兰钩虫和犬钩虫快速准确的鉴定方法对该病的防控显得尤为重要。粪便检查是检测钩虫的传统方法。该方法简便、易行，对于钩虫重度感染具有较好的敏感性，但在轻度感染时容易漏检。由于不同钩虫虫卵形态相似，仅凭外观难以对钩虫进行种类鉴定。目前，分子检测技术已应用于钩虫的鉴别，如特异pcr、多重pcr、限制性内切酶片段长度多态性(restrictionfragmentlengthpolymorphism，rflp)和高分辨率熔解曲线(highresolutionmelting，hrm)(huetal.,2015；liuetal.,2013；nguietal.,2012)。但上述技术均存在一定的局限性，如有的无法对大量样品同时进行检测，有的操作繁琐、成本昂贵。近年来，一种基于单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism，snp)的tm-shift分子检测方法引起了人们关注。该方法无需特异性探针，仅在pcr反应体系中预先加入sybrgreenⅰ荧光染料，pcr结束后根据熔解曲线中tm值的差异直接对样品进行分析，即可完成snp的检测(wangetal.,2005)。它具有高通量、操作简单、准确、成本低和闭管操作等优点(zhouetal.,2012)。迄今为止，该方法已在医学、微生物学、水生生物学等多个领域应用(huangetal.,2015；derzelleetal.,2011；ahnetal.,2016)。最近，我们建立了猫源蓝氏贾第虫a型与f型的tm-shift分型方法，开拓了兽医原虫的基因分型方法(panetal.,2017)。技术实现要素：为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种用于检测犬源锡兰钩虫和犬钩虫的snp分子标记its71。本发明的另一目的在于提供一种用于检测犬源锡兰钩虫和犬钩虫的tm-shift引物。本发明的再一目的在于提供上述用于检测犬源锡兰钩虫和犬钩虫的snp分子标记its71或tm-shift引物的应用。本发明的目的通过下述技术方案实现：本发明的技术方案用于非治疗目的和非诊断目的。本发明提供一种用于检测犬源锡兰钩虫和犬钩虫的snp分子标记its71，所述的snp分子标记its71位于seqidno：1所示的第71位碱基c或t，此处碱基为c的为锡兰钩虫，此处碱基为t的为犬钩虫。所述的锡兰钩虫的its1-5.8srdna部分序列如seqidno：1所示(404bp)，其中，包括309bpits1(1bp～309bp)和95bp5.8srdna(310bp～404bp)；所述的犬钩虫的its1-5.8srdna部分序列如seqidno：2所示(404bp)，其中，包括309bpits1(1bp～309bp)和95bp5.8srdna(310bp～404bp)。所述的snp分子标记its71在犬源钩虫的种类鉴别、分子流行病学调查以及钩虫病爆发的风险评估中的应用。用于检测上述snp分子标记its71的试剂也属于本发明的保护范围。用于检测上述snp分子标记its71的试剂在犬源钩虫的种类鉴别、分子流行病学调查以及钩虫病爆发的风险评估中的应用。本发明提供一套用于检测人畜共患的犬源锡兰钩虫和犬钩虫的tm-shiftpcr引物，可用于犬源钩虫的种类鉴别、分子流行病学调查以及钩虫病爆发的风险评估。首先参考从ncbi下载的犬钩虫(lc177192.1)和锡兰钩虫(km066110.1)its序列，基于its1一个snp位点its71设计一套tm-shiftpcr引物(2条正向特异性引物及1条共同反向引物)，见表1。表1基于its1序列snp位点its71的tm-shift引物含有所述tm-shiftpcr引物的试剂盒也属于本发明保护的范围。本发明提供了上述试剂盒在犬源钩虫的种类鉴别、分子流行病学调查以及钩虫病爆发的风险评估中的应用。一种用于检测犬源锡兰钩虫和犬钩虫的方法，包括如下步骤：(1)构建犬源锡兰钩虫和犬钩虫的标准化熔解曲线，使原始数据标准化；(2)提取待测钩虫样品的基因组dna；(3)以待测钩虫样品的基因组dna为模板，利用its71af、its71ef和its71r引物，进行tm-shiftpcr反应，通过监测待测钩虫样品的实时荧光信号来绘制熔解曲线；(4)根据待测钩虫样品的不同熔点(tm)并结合不同的峰形来判读样品的钩虫种类。步骤(3)中所述的tm-shiftpcr的反应体系(表2)和反应条件：表2tm-shiftpcr反应体系反应条件：熔解过程70～95℃，0.5℃/s。本发明提供了上述用于检测犬源锡兰钩虫和犬钩虫的方法在犬源钩虫的种类鉴别、分子流行病学调查以及钩虫病爆发的风险评估中的应用。本发明的机理是：本发明基于犬源锡兰钩虫和犬钩虫rdnaits1序列一个snp位点its71，探索鉴别犬源锡兰钩虫和犬钩虫的tm-shift方法，旨在建立一种快速、准确的犬源钩虫种类鉴定方法，以期为犬源钩虫临床检测和人畜共患风险评估提供技术手段。迄今尚无一种tm-shift方法对犬钩虫混合感染进行检测。与常规pcr和real-timepcr相比，tm-shiftpcr不但保持了较高的特异性和稳定性，而且较之更为快捷经济；同时在检测犬源钩虫未知种混合感染上具有无可比拟的优势。tm-shiftpcr即将成为临床疾病实验室诊断或排查的重要手段，它与传统的经典方法相结合，为疾病的快速诊断展示了广阔的应用前景。因此，犬源钩虫tm-shift快速基因检测技术的建立已成为人们多年来盼望实现的目标。本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：(1)通过实验例证明犬源锡兰钩虫和犬钩虫tm-shift快速基因检测技术中引物设计合理，且各项条件均符合tm-shiftpcr检测的要求。(2)本发明针对犬源钩虫its1序列的snp位点its71设计特异性引物，并在两条引物5'端加入不同长度的gc序列，根据pcr扩增后熔解曲线tm值的差异进行种类鉴别。结果显示，基于snp位点its71设计的引物能对锡兰钩虫与犬钩虫进行准确鉴定；两者tm值的变异系数(cv)分别为0.09％与0.15％；当锡兰钩虫与犬钩虫样品稀释度低至1:107(即5.33×10-6ng/μl和5.03×10-6ng/μl)时，tm-shift方法仍可对二者进行区分；对10份已知钩虫待检dna样本的检测结果与已知种完全一致；对临床样品的检出率明显高于镜检，准确率与测序结果完全一致。该技术可用于犬源钩虫的种类鉴别和分子流行病学调查以及钩虫病爆发的风险评估。附图说明图1是犬钩虫和锡兰钩虫基于its71的引物的标准曲线；其中，acap：犬钩虫标准质粒；acep：锡兰钩虫标准质粒；neg：阴性对照。图2是基于its71的引物对待检样品的熔解曲线；其中，a：钩虫样品d1-d10；b：钩虫样品d11-d21。图3是基于its71的引物的tm-shift法可视化结果。具体实施方式下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照生产厂家所建议的实验条件。实施例中所用的锡兰钩虫和犬钩虫阳性质粒标准品的制备是参考文献“developmentoftm-shiftgenotypingmethodfordetectionofcat-derivedgiardialamblia.parasitolres,2017,116(4):1151-1157.”中的方法进行的，具体操作如下：采用pmd18-tvector，将纯化后的pcr产物分别进行连接、转化、克隆后进行菌液pcr鉴定，阳性菌液送往上海生工有限公司测序，以验证所提质粒的钩虫种类。取50μl经测序鉴定为阳性的菌液，接种于5ml含有amp、iptg和x-gal的lb液体培养基中，37℃摇菌过夜。按小量质粒回收试剂盒说明书抽提质粒，-20℃保存备用，将所制备的锡兰钩虫和犬钩虫阳性质粒分别命名为acep和acap。取提取的质粒1μl，用超微量分光光度计检测质粒的a260/a280值和浓度(a260/a280值应在1.8～2.0之间，最适浓度为50ng/μl左右)，-20℃保存备用。其中，锡兰钩虫阳性质粒含有如seqidno：1所示的目的片段；犬钩虫阳性质粒含有如seqidno：2所示的目的片段。实施例1.犬源锡兰钩虫与犬钩虫的鉴别(1)首先参考从ncbi下载的犬钩虫(lc177192.1)和锡兰钩虫(km066110.1)its序列，基于its1一个snp位点its71设计一套tm-shiftpcr引物(2条正向特异性引物及1条共同反向引物)，见表1。表1基于its1序列snp位点its71的tm-shift引物根据上述引物确立tm-shiftpcr的反应体系(表2)和反应条件：表2tm-shiftpcr反应体系反应条件：熔解过程70～95℃，0.5℃/s。(2)基于snp位点its71的tm-shift引物对锡兰钩虫(acep)和犬钩虫(acap)标准质粒的tm-shift的标准曲线见图1。结果显示，基于snp位点its71的tm-shift方法能将锡兰钩虫与犬钩虫区分开来。通过rotor-geneq系列软件分析，its71的引物中，锡兰钩虫和犬钩虫的tm值分别为88.0℃和86.0℃。实施例2.tm-shift方法的稳定性试验为评价已建立的基于snp位点its71的tm-shift方法的稳定性，试验对构建的2种已知质粒标准品进行重复性检测。批内每个样本重复检测7次，批间重复3次，qpcr-tm-shift反应体系及循环参数同上所述。试验结果显示，在its71的引物中，犬钩虫与锡兰钩虫的tm值的变异系数(cv)分别为0.15％与0.09％(表3)，故该tm-shift分子检测方法批内重复性和批间重复性均为良好。表3重复性试验结果实施例3.tm-shift方法的敏感性试验为检测已建立的基于snp位点its71的tm-shift方法的敏感性，将制备的2种质粒标准品分别10倍倍比稀释，按1：10～1：108浓度进行检测，qpcr-tm-shift反应体系及循环参数同上所述。结果显示，当犬钩虫与锡兰钩虫样品稀释度低至1:107(即5.33×10-6ng/μl和5.03×10-6ng/μl)时，tm-shift方法仍可将其二者区分开来(见表4)。表4引物对不同浓度犬钩虫与锡兰钩虫的tm值注：“-”表示无法检测到目标峰实施例4.tm-shift方法的准确性检测为检测基于its1一个snp位点its71的tm-shift方法的准确性，对10份已知种类的钩虫dna样品进行tm-shift分子检测。qpcr-tm-shift反应体系及循环参数同上所述。结果显示，its71的引物对犬源钩虫10个样品的tm-shift检测结果与已知钩虫种类完全一致(表5)。表5引物对已知钩虫样品的tm值样本its71(tm)序列登录号d22(犬钩虫)86.0℃kc755016d55(锡兰钩虫)88.0℃kc755015d60(锡兰钩虫)88.0℃kc755020d74(锡兰钩虫)88.0℃kc755021d23(犬钩虫)86.1℃kc755017d28(犬钩虫)86.0℃kc755018d34(犬钩虫)86.1℃kc755019d79(锡兰钩虫)88.0℃kc755022g23(锡兰钩虫)87.9℃kf279132g32(锡兰钩虫)88.0℃kf279133其中，样品d22、d23、d28、d34、d55、d60、d74、d79均在文献“molecularidentificationofhookwormsinstrayandshelterdogsfromguangzhoucity,chinausingitssequences,journalofhelminthology.vol.89,no.2,pp.196-202,2015.”中公开；样品g23、g32均在文献“thezoonoticriskofancylostomaceylanicumisolatedfromstraydogsandcatsinguangzhou,southchina,biomedresearchinternational.vol.2014,pp.208759,2014.”中公开。实施例5：一、材料与方法1、待检样本处理50份犬粪样本分别来自广东汕头、佛山、韶关流浪犬救助中心。参照刘远佳等(2013)建立的pcr检测方法，提取样本基因组dna。2、tm-shift方法检测样本采用已建立的基于its1序列snp位点its71的tm-shift检测方法对犬源dna样品进行检测和种类鉴别，qpcr-tm-shift反应体系及循环参数同上所述。3、tm-shift数据分析tm-shift分析采用rotor-geneq仪器提供的最新软件(rotor-geneqseriessoftware2.0.2)来进行。首先构建标准化熔解曲线使原始数据标准化，在建立的标准熔解曲线的基础上，依据重复性试验、敏感性试验和准确性试验得到的检测结果作为判断的依据。通过监测临床样品的实时荧光信号来绘制熔解曲线，根据不同熔点(tm)并结合不同的峰形来判读样本的钩虫种类。二、结果1.tm-shift检测结果采用tm-shift方法检测，结果显示21份为阳性，编号为d1-d21。对于its71的引物，犬源钩虫样品d2、d3、d4、d6、d7、d8、d9、d10、d12、d13、d16、d17、d19、d20的tm值在88.0℃左右，判为锡兰钩虫；d1、d5、d11、d14、d15、d18、d21的tm值在86.0℃左右，判为犬钩虫。其熔解曲线如图2所示。2.tm-shift的可视化结果基于its71的引物分析，犬源钩虫样品d2、d3、d4、d6、d7、d8、d9、d10、d12、d13、d16、d17、d19、d20的tm值分别是87.9℃、87.8℃、87.8℃、87.9℃、87.8℃、87.9℃、87.8℃、87.9℃、88.0℃、88.0℃、87.9℃、88.0℃、88.0℃、88.0℃，鉴定结果为锡兰钩虫；犬源钩虫样品d1、d5、d11、d14、d15、d18、d21的tm值分别是86.1℃、85.9℃、86.1℃、86.0℃、86.1℃、86.1℃、86.0℃，鉴定结果为犬钩虫。其可视化结果如图3所示，其中，dog1-21与简写d1-21对应。3.测序结果通过测序验证，tm-shift对待检样本的检测结果与测序结果完全一致。三、讨论与小结犬是人畜共患钩虫锡兰钩虫和犬钩虫重要的保虫宿主。锡兰钩虫主要分布在亚洲，在中国及其周边的许多国家(日本、印度、泰国、老挝、马来西亚、柬埔寨)均有报道。来自中国(huetal.,2016)、马来西亚(nguietal.,2013)、柬埔寨(inpankaewetal.,2014)、印度(georgeetal.,2016)等地锡兰钩虫的遗传进化分析表明，犬源锡兰钩虫与人源锡兰钩虫的亲缘关系最近，而且人的锡兰钩虫感染率与本地犬锡兰钩虫的感染率呈现相关性，证实其存在人畜互传的可能性(nguietal.,2012)。犬钩虫主要感染犬、猫，亦可感染人。犬既是人类的伴侣动物，也是钩虫的易感动物。随着经济的发展和生活质量的提高，饲养犬的人也越来越多。因此，建立犬源锡兰钩虫和犬钩虫的tm-shift分子检测方法对防控人畜共患钩虫病具有重要意义。目前，国内外学者对钩虫的种类鉴定主要采用多聚酶链反应(pcr)、多重pcr、限制性片段长度多态性(rflp)、高分辨率熔解曲线(hrm)等分子生物学手段(nguietal.,2012；liuetal.,2013；huetal.,2015)。pcr技术是较为常用的检测手段，通过对钩虫的目的基因进行扩增与序列分析，对钩虫进行分类鉴定。多重pcr是一种特殊的pcr技术，可以在同一反应体系中加入多对引物同时检测多种病原。rflp是利用基因组某一区段dna序列的多态性和限制性内切酶识别的专一性，根据限制性内切酶消化所产生的不同带型来实现种类鉴别。hrm是基于新型饱和荧光染料的基因分型技术，其原理是通过监测pcr产物dna双链溶解时被释放的荧光信号分子，通过qpcr仪器绘制成溶解曲线。然而，tm-shift方法是一种基于单核苷酸多态性(snp)的分子生物学技术。该方法也是在real-timepcr仪上闭管操作，通过对pcr反应结束后熔解曲线中tm值的差异直接对样品进行区分。与特异pcr、多重pcr、rflp等方法相比，该法在荧光pcr仪上一步完成，更为简便，耗时更短；无需再进行凝胶电泳等步骤，可减少凝胶电泳反应中其它杂质的污染和eb(溴化乙锭)等有毒试剂的使用。与hrm相比，tm-shift法的成本更加低廉。该法使用的仪器为普通荧光pcr仪，使用的荧光染料为普通的sybrgreenⅰ荧光染料，比evagreen、lcgreen等饱和染料更具有价格优势而不影响其扩增效果。对比hrm的三步法扩增片段，tm-shift法采用两步法即可完成目的片段的扩增，大大节省了实验时间，提高了检测效率。当然，该方法也有其局限性。tm-shift法并不能适用于所有的snp。本试验起初设计的5个snp位点中，有两个位点对犬钩虫和锡兰钩虫的区分度不高，熔解曲线几乎重合，导致分种失败。而基于its71snp位点能对这两种钩虫进行正确区分。从结果来看，its71熔解曲线中两种钩虫峰值的差距在2℃，其鉴别效果很好。基于试验结果，我们将犬钩虫(86.1±0.2℃)与锡兰钩虫(88.0±0.2℃)熔解曲线的tm值作为its71定种的参考标准。综上所述，基于犬源钩虫its1序列snp位点its71设计的引物可用于检测人畜共患的锡兰钩虫和犬钩虫的tm-shift种类鉴别，该方法具有高效灵敏、经济实用、操作简便、无毒安全的优点。迄今为止，虽有不同领域包括医学(huangetal.,2015；zhouetal.,2012；zhouetal.,2015)、微生物学(derzelle,etal.,2011)、水生生物学(ahnetal.,2016)、兽医原虫学(panetal.,2017)的学者应用该方法对snp进行检测与分型，但本次在兽医蠕虫学领域属于首次报道。随着该技术的不断完善，不远的将来在预防兽医学、预防医学、微生物分型和食品安全检测等方面将具有广阔的发展空间。上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。序列表<110>华南农业大学<120>用于检测犬源锡兰钩虫和犬钩虫的snp分子标记its71、引物及其应用<160>5<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>404<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>锡兰钩虫的its1-5.8srdna部分序列<400>1ctttgtcgggaaggttgggagtatcgccccccgttacagccctacgtgaggtgtctatgt60gcagcaagagccgttcctgggtggcggcagtgattgctgtgcgaagttcgcgtttcgctg120agctttagacttgatgagcattgcatgaatgccgccttactgcttgtgttggtggttgag180cattaggctaacgcctagtgcggcacctgtctgtcaggaaaccttaatgatctgctaacg240cggacgccagtacagcaataactttttacgtttaatgtttgcagaatcgtgactttatgt300cacaatcgactagcttcagcgatggatcggtcgattcgcgtatcgatgaaaaacgcagct360agctgcgttatttaccacgaattgcagacgcttagagtggtgaa404<210>2<211>404<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>犬钩虫的its1-5.8srdna部分序列<400>2ctttgtcgggaaggttgggagtatcacccaccgttacagccctacgtaaggtgtctatgt60gcagcaagagtcgttactgggtggcggcagtgattgctgtgcgaagttcgcgtttcgctg120agctttagacttgatgagcattgcatgaatgccgccttactgcttgtgttggtggttgag180cattaggctaacgcctgatgcgtcacctgtctgtcaggaaaccttaatgatctgctaacg240cggacgccagtacagcaataactttttacgtttaatgtttgcagaatcgtgacttgatgt300cacaatcgactagcttcagcgatggatcggtcgattcgcgtatcgatgaaaaacgcagct360agctgcgttatttaccacgaattgcagacgcttagagtggtgaa404<210>3<211>23<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>its71af<400>3gcggcgctatgtgcagcaagagt23<210>4<211>31<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>its71ef<400>4gcgggcagggcgggctatgtgcagcaagagc31<210>5<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>its71r<400>5acaagcagtaaggcggcattca22当前第1页12