专利名称：犬钩虫抗凝肽及其制备和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及医药及生物技术领域。具体的说，本发明涉及从犬钩虫中分离到的犬钩虫抗凝肽新基因及其编码的蛋白质。本发明还涉及这些新的犬钩虫抗凝肽的制备和应用。
背景技术：
血栓性疾病是一种常见病，常表现为心肌梗死、缺血性脑梗死、静脉血栓栓塞。每年每一千人中有I 3人发生不同形式的血栓性疾病。在当前人类疾病中，血栓栓塞性疾病已成为危害人类健康的主要因素，由血栓栓塞所致的心肌梗死、脑梗死、肺梗死等其死亡总数为各种病因之首。如何防治该类疾病是目前临床与医药科学研究的热点，尽管有肝素、 口服香豆素、链激酶和尿激酶等药物多年应用的历史，但这些药品的出血、血小板减少等副作用限制了其应用，有的用药时还需要特别监测。因此开发出疗效好、毒副作用低的血栓性疾病防治药物倍受科研人员的关注。目前临床上治疗血栓性疾病的药物主要分为抗血小板类药物、抗凝血药物和溶血栓药物三大类。其中，抗凝血药是一类干扰凝血因子，是阻止血液凝固的药物，主要用于血栓栓塞性疾病的预防与治疗，特别使用于栓塞性疾病的预防。肝素类(如低分子量肝素LMWH)药物是目前市场上占主要地位的抗凝血药物，如世界上每年有6000万病人接受肝素治疗以防治急性冠脉综合症等各种血栓性疾病。钩虫寄生于人或动物宿主肠道，引起宿主慢性失血，从而导致宿主贫血。其中原因之一是钩虫能分泌抗凝物质，使宿主被钩虫咬附伤口不易凝血，血液并迅速经钩虫消化道排出。早在20世纪初,就有学者证实了犬钩虫(Ancylostoma caninum)提取物具有抗凝作用，但直到1993年才从犬钩虫中分离出首个抗凝血肽，其后并证实该抗凝血肽可显著延长凝血酶原时间(PT)和活化部分凝血酶原激酶时间(aPTT)。该抗凝肽被命名为犬钩虫抗凝月太(Ancylostoma caninum anticoagulant peptide, AcAP),也称线虫抗凝血月太(nematode anticoagulant peptide, NAP)或线虫抗凝血蛋白(nematode anticoagulant protein, NAP)。1996年,Stassens等根据测得抗凝肽部分氨基酸序列设计核酸探针,从犬钩虫cDNA 文库中筛选到三个抗凝血肽基因，它们在Pichia pastoris中的表达产物rAcAP5 (rNAP5)、 rAcAP6 (rNAP6)和rAcAPc2 (rNAPc2)均显著延长PT，并成剂量依赖关系。其中，延长PT活性以 rAcAPc2 (rNAPc2)为最好，延长 aPTT 活性以 rAcAP5 (rNAP5)为最好，rAcAP6 (rNAP6)抗凝活性略弱于rAcAP5 (rNAP5) (Stanssens P, P W Bergum, Y Gansemans et al. Anticoagulant repertoire of the hookworm Ancylostoma caninum. Proc Natl Acad Sci USA. 1996 ； 93 :2149 2154.)。2002年，Stassens等报道了采用cDNA末端快速扩增技术，从锡兰钩虫(Ancylostoma ceylanicum)中得到了抗凝血肽AceAPl基因，并在大肠杆菌中表达获得了 rAceAPl，其抗凝活性远较 rAcAP5 (rNAP5)、rAcAP6 (rNAP6)和 rAcAPc2 (rNAPc2)低(Harssion, L. M. , Nerlinger, r. D. Bungiro et al. Molecular characterization of Ancylostoma inhibitors of coagulation factor Xa. Hookworm anticoagulant activity in vitro predicts parasite bloodfeeding in vivo[J]. J. Biol. Chem,2002 ；277 (8) 6223-29)。2004年，Juliusz等人报道了根据AcAPc2信号肽氨基酸保守序列设计引物， 采用RT-PCR从犬钩虫中获得两种同源多肽，并分别命名为AcAPc3、AcAPc4，重组表达产物 rAcAPc3、rAcAPc4 抗凝活性明显不及 rAcAPc2 (rNAPc2) (Mieszczanek J, Harrison L M, Vlasuk G P and Cappello M. Anticoagulant peptides from Ancylostoma caninum are immunologicalIy distinct and localize to separate structures within the adult hookworm. Mol Biochem Parasitol. 2004 ; 133 (2)，319-32 3)。最近，本发明人也公开了犬钩虫抗凝肽AcaNAP7基因序列(GenBank录入号DQ435781)、AcaNAP8 (GenBank录入号 DQ435782)，并实验证实它们的重组表达产物具有很好抗凝活性(申请者待发表的结果但是还未公开)。钩虫抗凝肽及其重组产物具有明确的抗凝血作用，其抗凝作用机制已引起人们的重视并被探讨应用于临床实践。rAcAPc2 (rNAPc2)和rAcAP5 (rNAP5)的临床或临床前试验表明它们具有广阔的应用前景，是目前倍受医药专家关注的正在开发的抗凝抗血栓药物。本发明人经过广泛而深入的研究，从获自广东湛江地区及广西的宿主狗肠道内的犬钩虫中分离到了新的犬钩虫抗凝肽AcaNAP9、AcaNAPlO及AcaNAPll基因，并表达纯化了 AcaNAP9、AcaNAPlO和AcaNAPlI，并进一步揭示了这些抗凝肽具有很好的抗凝活性及其在抗凝药物、抗血栓药物及抗凝制剂方面的应用。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种新的犬钩虫抗凝肽AcaNAP9 (SEQ ID NO. I)，或它的保守性变异多肽、或它的活性片段、或它的活性衍生物、或它的类似物。本发明的一个目的在于提供一种新的犬钩虫抗凝肽AcaNAPlO (SEQ ID NO. 2)，或它的保守性变异多肽、或它的活性片段、或它的活性衍生物、或它的类似物。本发明的一个目的在于提供一种新的犬钩虫抗凝肽AcaNAPll (SEQ ID NO. 3)，或它的保守性变异多肽、或它的活性片段、或它的活性衍生物、或它的类似物。本发明的一个目的在于提供一类氨基酸序列中包含有Cys-Al-Cys-A2-Cys-A3-C ys-A4-Cys-A5-Cys-A6-Cys-A7-Cys-A8-Cys-A9-Cys-A10 特征序列的具有抗凝作用的多肽序列组成。本发明的一个目的在于提供编码抗凝肽AcaNAP9的DNA (SEQ ID NO. 11)或其活性片段的DNA。本发明的一个目的在于提供编码抗凝肽AcaNAPlO的DNA (SEQ ID NO. 12)或其活性片段的DNA。本发明的一个目的在于提供编码抗凝肽AcaNAPll的DNA (SEQ ID NO. 13)或其活性片段的DNA。本发明的一个目的在于提供编码抗凝肽AcaNAP9、AcaNAPlO, AcaNAPll的保守性变异多肽、或它的活性片段、或它的活性衍生物、或它的类似物的DNA。在本发明的第一方面，本发明提供了一种新的多肽一AcaNAP9，其基本上是由SEQ ID NO. I所示的氨基酸序列组成的，较佳的是不含信号肽序列(SEQ ID NO. 4)，或不含羧基端(C00-)3个氨基酸(SEQ ID NO. 5)，或不含羧基端(C00-) 3个氨基酸和氨基端(NH-) 3 个氨基酸(SEQ ID NO. 6)。本发明还提供了 AcaNAP9的保守性变异多肽、或它的活性片段、 或它的活性衍生物、或它的类似物。本发明的多肽可以是天然多肽、重组多肽、合成多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。在本发明的第二方面，本发明提供了一种新的多肽——AcaNAPIO，其基本上是由 SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列组成的，较佳的是不含羧基端(C00-) 3个氨基酸(SEQ ID NO. 7)，或不含羧基端(C00-) 3个氨基酸和氨基端(NH-) 3个氨基酸(SEQ ID NO. 8)。本发明还提供了 AcaNAPlO的保守性变异多肽、或它的活性片段、或它的活性衍生物、或它的类似物。本发明的多肽可以是天然多肽、重组多肽、合成多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产 物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。在本发明的第三方面，本发明提供了一种新的多肽一AcaNAPlI，其基本上是由 SEQ ID NO. 3所示的氨基酸序列组成的，较佳的是不含羧基端(C00-) 3个氨基酸(SEQ ID NO. 9)，或不含羧基端(C00-) 3个氨基酸和氨基端(NH-) 3个氨基酸(SEQ ID NO. 10)。本发明还提供了 AcaNAPlI的保守性变异多肽、或它的活性片段、或它的活性衍生物、或它的类似物。本发明的多肽可以是天然多肽、重组多肽、合成多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。在本发明的第四方面，本发明提供了氨基酸序列中包含有Cys-Al-Cys-A2-Cys-A
3-Cys-A4-Cys-A5-Cys-A6-Cys-A7-Cys-A8-Cys-A9-CyS-AlO 特征序列的具有抗凝作用的多肽。其中，①Al为一段包含有氨基酸序列Gly-Glu-Asn-Glu-Glu-Tyr-Asp-Val(SEQ ID NO. 14),或Gly-Glu-Asn-Glu-Arg-His-Asp-Glu(SEQ ID NO. 15),或Gly-Glu-Asn-Glu-Arg-Tyr-Asp-Asp (SEQ ID NO. 16)之一的序列或它们的保守变异氨基酸序列、或它们的类似物； ② A2 为一段包含有氨基酸序列 Gly-Asn-Arg-Thr (SEQ ID NO. 17)，或 Ser-Arg-Lys-Glu (SEQ ID NO. 18)，或Asn-Arg-Lys-Glu (SEQ ID NO. 19).之一的序列或它们的保守变异氨基酸序列、或它们的类似物；③A3为一段包含有氨基酸序列Asp-Leu-Lys (SEQ ID NO. 20)，或 Asp-Pro-Lys (SEQ ID NO. 21)之一的序列或它们的保守变异氨基酸序列、或它们的类似物； ④ A4 为一段包含有氨基酸序列 Gln-Tyr-Asp-Gly-Ala-Glu-Lys-Lys-Asp-Glu-Glu-Arg-As n-Ala-Glu(SEQ ID NO. 22)，或 Lys-Tyr-Asp-Gly-Thr-Glu-Glu-Lys-Asp-Asp-Glu-Lys-Pro -Val-Val(SEQ ID NO. 23),或 Lys-Tyr-Asp-Gly-Thr-Glu-Glu-Lys-Asp-Asp-Glu-Lys-Pro-Val-Glu(SEQ ID NO. 24)之一的序列或它们的保守变异氨基酸序列、或它们的类似物； A5 为一段4个氨基酸残基组成的序列； A6为一段包含有氨基酸序列Tyr-Asp-Gly-Asp (SEQ ID NO. 25)，或Tyr-Gly-Asp (SEQ ID NO. 26)，或His-Gly-Asp (SEQ ID NO. 27)之一的序列或它们的保守变异氨基酸序列、或它们的类似物； A7为Val (缬氨酸)或Ile (异亮氨酸)， 或其保守变异氨基酸； A8为一段包含有氨基酸序列Arg-Lys-Gly-Phe-Tyr-Arg-Asn-As n-Asn-Gly-Arg(SEQ ID NO.28),或 Arg-Asp-Gly-Phe-Leu-Arg-Lys-Asn-Asn-Gly-Ala(SE Q ID NO. 29).之一的序列或它们的保守变异氨基酸序列、或它们的类似物；⑨A9为一段包含有氨基酸序列 Val-Thr-Ala-Glu-Asp (SEQ ID NO. 30)，或 Val-Lys-Ala-Glu-Asp (SEQ ID NO. 31)之一的序列或它们的保守变异氨基酸序列、或它们的类似物丨⑩八川为一段包含有氨基酸序列Asn-Met-Glu-Phe-Ile-Tyr-Pro (SEQ ID NO. 32)的序列或它的保守变异氨基酸序列、或它的类似物。 在本发明的第五方面，本发明涉及一种分离的多核苷酸_AcaNAP9基因，该多核苷酸来源于犬钩虫，它包含编码具有SEQ ID NO. 1，或SEQ ID NO. 4，或SEQ ID NO. 5，或SEQ ID NO. 6的氨基酸序列的多肽的多核苷酸。在本发明的第六方面，本发明涉及一种分离的多核苷酸-AcaNAPlO基因，该多核苷酸来源于犬钩虫，它包含基本编码具有SEQ ID NO. 2，或SEQ ID NO. 7，或SEQ ID NO. 8 的氨基酸序列的多肽的多核苷酸。在本发明的第七方面，本发明涉及一种分离的多核苷酸-AcaNAPll基因，该多核苷酸来源于犬钩虫，它包含基本编码具有SEQ ID NO. 3，或SEQ ID NO. 9，或SEQ ID NO. 10 的氨基酸序列的多肽的多核苷酸。在本发明的第八方面，本发明涉及一种分离的多核苷酸，它包含编码序列SEQ ID NO. USEQ ID NO. 2,SEQ ID NO. 3,SEQ ID NO. 4,SEQ ID NO. 5,SEQ ID NO. 6,SEQ ID NO. 7、 SEQ ID NO. 8、SEQ ID NO. 9和SEQ ID NO. 10的保守性变异多肽、或它们的活性片段、或它们的活性衍生物、或它们的类似物的多核苷酸。在本发明的第九方面，本发明提供了抗凝肽AcaNAP9、或AcaNAP 10、或AcaNAP 11及他们保守性变异多肽、或它们的活性片段、或它们的活性衍生物、或它们的类似物的在抗凝药物或抗凝制剂方面的应用。本发明的其它方面由于本文技术内容的公开，对本领域技术人员是易于理解并实施的。例如，利用本发明可以涉及一种含有编码本发明中抗凝肽的DNA的载体；一种用含有编码本发明中抗凝肽的DNA的表达载体遗传工程化的宿主细胞；一种包括培养遗传工程化的宿主细胞并制备本发明多肽的方法。本说明书和权利要求书中使用的下列术语除非特别说明具有如下含义“氨基酸”是指天然L型氨基酸及维持了生物活性的D型氨基酸。天然的L型氨基酸包括丙氨酸(Ala，A)，精氨酸(Arg，R)，天冬酰胺(Asn，N)，天冬氨酸(Asp，D)，半胱氨酸 (Cys, C)，谷氨酰胺(Gin, Q)，谷氨酸(Glu, E)，甘氨酸(Gly, G)，组氨酸(His, H)，异亮氨酸 (He, I)，亮氨酸(Leu, L)，赖氨酸(Lys, K)，甲硫氨酸(蛋氨酸)(Met, M)，苯丙氨酸(Phe, F)，脯氨酸(Pro, P)，丝氨酸(Ser，S)，苏氨酸(Thr, T)，色氨酸(Trp, W)，酪氨酸(Tyr, Y)和缬氨酸(Val，V)。“氨基酸序列”是指寡肽、肽、多肽或蛋白质序列及其片段或部分。当本发明中的 “氨基酸序列”涉及一种天然存在的蛋白质分子的氨基酸序列时，这种“多肽”或“蛋白质” 不意味这将氨基酸序列限制为与所述蛋白质分子相关的完整的天然氨基酸。类似地，术语 “核苷酸序列”是指寡核苷酸、核苷酸或多核苷酸及其片段或部分，也可以指基因组或合成的 DNA 或 RNA。蛋白质或多核苷酸“变体”是指一种具有一个或多个氨基酸或核苷酸改变的氨基酸序列或编码它的多核苷酸序列。所述改变可包括氨基酸序列或核苷酸序列中氨基酸或核苷酸的缺失、插入或替换。变体可具有“保守性”改变，其中替换的氨基酸具有与原氨基酸相类似的结构或化学性质，如用亮氨酸替换异亮氨酸。变体也可具有非保守性改变，如用色氨酸替换甘氨酸。“分离的” 一词指将物质从它存在的原来环境(例如，自然产生的就指其天然环境)中分开。例如，一个自然产生的多核苷酸或多肽存在于生物体内中就是没有被分离出来，但同样的多核苷酸序列或多肽同一些或全部在自然系统(如前述生物体)中与之共存的物质分开就是分离的。“cDNA” 是指互补 DNA。“mRNA ” 是指信使 RNA。 “抗凝”是指具有抑制血液(包括血浆)凝固的作用。在本发明的第一方面，本发明提供了分离的一种新的多肽-AcaNAP9，它是由从犬钩虫成虫的总RNA进行反转录后扩增得到的核苷酸序列编码。肽全长由94个氨基酸残基组成，其中，成熟肽由81个氨基酸残基组成，另外有13个氨基酸残基组成的信号肽。根据氨基酸同源性比较，此多肽全长与犬钩虫抗凝肽AcAPc4 (GenBank录入号AAP82926)具有最大同源性，它们的一致性为65% (62/94);成熟肽与AcAPc3 (GenBank录入号AAP57305)具有最大同源性，它们的一致性为68% (52/76)，其次与AcAPc2 (GenBank录入号AAC47080) 和 AcaNAP7 (GenBank 录入号ABD98795)也有 65% 的一致性。在本发明的第二方面，本发明提供了分离的一种新的多肽-AcaNAP 10，它是由从犬钩虫成虫的总RNA进行反转录后扩增得到的核苷酸序列编码。该肽由80个氨基酸残基组成。根据氨基酸同源性比较，此多肽与犬钩虫抗凝肽AcAPc4(GenBank录入号 AAP82926)具有最大同源性，它们的一致性为87 %，与犬钩虫抗凝肽AcAPc3 (GenBank录入号AAP57305)、AcaNAP7 (GenBank 录入号ABD98795)、AcAPc2 (GenBank 录入号AAC47080) 的一致性依次为76%、70%、66%。在本发明的第三方面，本发明提供了分离的一种新的多肽-AcaNAP 11，它是由从犬钩虫成虫的总RNA进行反转录后扩增得到的核苷酸序列编码。该肽由80个氨基酸残基组成。根据氨基酸同源性比较，此多肽与犬钩虫抗凝肽AcAPc4(GenBank录入号 AAP82926)具有最大同源性，它们的一致性为92 %，与犬钩虫抗凝肽AcAPc3 (GenBank录入号AAP57305)、AcaNAP7 (GenBank 录入号ABD98795)、AcAPc2 (GenBank 录入号AAC47080) 的一致性依次为76%、73%、69%。本发明的抗凝多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，首选重组多肽。本发明的多肽可以是分离纯化的天然产物，或是化学合成产物，或使用重组技术在原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、昆虫和哺乳动物细胞)中表达的产物。在本发明中，还包括犬钩虫抗凝肽AcaNAP9、AcaNAPIO、AcaNAPlI的保守性变异多肽、活性片段、衍生物和类似物。在本发明中，术语“保守性变异多肽”、“片段”、“衍生物”和 “类似物”是指基本上保持本发明的犬钩虫抗凝肽AcaNAP9、AcaNAPIO、AcaNAPll相同的生物学功能或活性的多肽。这些多肽可以是①在氨基酸序列中，有一至多个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换形成的多肽；②在氨基酸序列中，有数个氨基酸缺失、插入或取代所形成的多肽；③多肽的等位变异体、天然变异体、天然突变体、诱导突变体；④前述抗凝肽与另外一种化合物(如聚乙二醇)的融合；⑤前述抗凝肽的化学衍生形式如乙酰化、羧基化或糖基化等；⑥附加一段氨基酸序列融合进前述多肽而形成的多肽序列。通过本文的阐述，这样的“保守性变异多肽”、“片段”、“衍生物”和“类似物”被认为在本领域技术人员的知识范围之内。应当理解，本发明的多肽并不限于上述列举的代表性多肽。
在本发明的第四方面，本发明提供了氨基酸序列中包含有Cys-Al-Cys-A2-Cys-A3-Cys-A4-Cys-A5-Cys-A6-Cys-A7-Cys-A8-Cys-A9-CyS-AlO 序列特征的具有抗凝作用的多肽。所指 “Al ”、“A2”、“A3”、“A4”、“A5”、“A6”、“A7”、“A8”、“A9” 依次为序列中相邻两个半胱氨酸(Cys)间的一段氨基酸序列，“A10”为最后一个半胱氨酸(Cys)羧基端后的一段氨基酸序列。在本发明中，①Al为一段包含有氨基酸序列Gly-Glu-Asn-Glu-Glu -Tyr-Asp-Val(SEQ ID NO. 14)，或 Gly-Glu-Asn-Glu-Arg-His-Asp-Glu(SEQ ID NO. 15)， 或 Gly-Glu-Asn-Glu-Arg-Tyr-Asp-Asp (SEQ ID NO. 16)之一的序列或它们的保守变异氨基酸序列、或它们的类似物，优选该序列为8个氨基酸残基组成；@A2为一段包含有氨基酸序列 Gly-Asn-Arg-Thr (SEQ ID NO. 17),或 Ser-Arg-Lys-Glu (SEQ ID NO. 18)，或 Asn-Arg-Lys-Glu. (SEQ ID NO. 19)之一的序列或它们的保守变异氨基酸序列、或它们的类似物，优选该序列为4个氨基酸残基组成； A3为一段包含有氨基酸序列Asp-Leu-Lys (SEQ ID NO. 20)，或Asp-Pro-Lys (SEQ ID NO. 21)之一的序列或它们的保守变异氨基酸序列、或它们的类似物，优选该序列为3个氨基酸残基组成A4为一段包含有氨基酸序列Gln-Ty r-Asp-Gly-Ala-Glu-Lys-Lys-Asp-Glu-Glu-Arg-Asn-Ala-Glu(SEQ ID NO. 22)，或 Lys-Tyr -Asp-Gly-Thr-Glu-Glu-Lys-Asp-Asp-Glu-Lys-Pro-Val-Val(SEQ ID NO. 23),或 Lys-Tyr-Asp-Gly-Thr-Glu-Glu-Lys-Asp-Asp-Glu-Lys-Pro-Val-Glu (SEQ ID NO. 24)之一的序列或它们的保守变异氨基酸序列、或它们的类似物，优选该序列为15个氨基酸残基组成； A5 为一段4个氨基酸残基组成的序列； A6为一段包含有氨基酸序列Tyr-Asp-Gly-Asp (SEQ ID NO. 25)，或Tyr-Gly-Asp (SEQ ID NO. 26)，或His-Gly-Asp (SEQ ID NO. 27)之一的序列或它们的保守变异氨基酸序列、或它们的类似物，优选该序列为3-4个氨基酸残基组成； A7 为Val (缬氨酸)或Ile (异亮氨酸)，或其保守变异氨基酸-M A8为一段包含有氨基酸序列 Arg-Lys-Gly-Phe-Tyr-Arg-Asn-Asn-Asn-Gly-Arg(SEQ ID NO. 28),或Arg-Asp-Gly-Ph e-Leu-Arg-Lys-Asn-Asn-Gly-Ala. (SEQ ID NO. 29)之一的序列或它们的保守变异氨基酸序列、或它们的类似物，优选该序列为11个氨基酸残基组成；@A9为一段包含有氨基酸序列 Val-Thr-Ala-Glu-Asp (SEQ ID NO. 30)，或Val-Lys-Ala-Glu-Asp (SEQ ID NO. 31)之一的序列或它们的保守变异氨基酸序列、或它们的类似物，优选该序列为5个氨基酸残基组成； ⑩AlO为一段包含有氨基酸序列Asn-Met-Glu-Phe-Ile-Tyr-Pro (SEQ ID NO. 32)的序列或其保守变异氨基酸序列、或其类似物。在本发明的第五方面，本发明涉及一种分离的多核苷酸_AcaNAP9基因，它是由从犬钩虫成虫的总RNA进行反转录后用3’ -RACE (cDNA末端快速扩增)及RT-PCR扩增得至IJ。它包括的多核苷酸序列全长为443个碱基(包括3’尾端的13个腺苷酸A)，其开放读框(26-310)编码了 94个氨基酸。根据核苷酸同源性比较，此多核苷酸序列与犬钩虫抗凝肽AcAPc4基因(GenBank录入号AY253915)具有最大同源性，它们的一致性为86 %。与 AcAPc2基因(GenBank录入号U30793)具有80%的一致性。在本发明的第六方面，本发明涉及一种分离的多核苷酸-AcaNAPlO基因，它是由从犬钩虫成虫的总RNA进行反转录后用RT-PCR扩增得到。它包括的多核苷酸序列为243 个碱基(含终止密码子)，编码80个氨基酸。根据核苷酸同源性比较，此多核苷酸序列与犬钩虫抗凝肽AcAPc4基因(GenBank录入号AY253915)具有最大同源性，它们的一致性为 93 %，与 AcAPc3 基因(GenBank 录入号AY232998)、AcaNAP7 基因(GenBank 录入号 DQ435781) 一致性分别为 84%、80%。在本发明的第七方面，本发明涉及一种分离的多核苷酸-AcaNAPll基因，它是由从犬钩虫成虫的总RNA进行反转录后用RT-PCR扩增得到。它包括的多核苷酸序列为372个碱基(含终止密码子、3-UTR及3’尾端的11个腺苷酸A )，多核苷酸序列1-240编码80个氨基酸。根据核苷酸同源性比较，此多核苷酸序列与犬钩虫抗凝肽AcAPc4基因(GenBank录入号AY253915)具有最大同源性，它们的一致性为95%，与AcAPc3基因(GenBank录入号 AY232998)、AcaNAP7 基因(GenBank 录入号DQ435781)、AcAPc2 (GenBank 录入号U30793) 基因一致性分别为84%、81%、80%。在本发明的第八方面，本发明涉及一种分离的多核苷酸，它包含编码序列SEQ ID NO. USEQ ID NO. 2,SEQ ID NO. 3,SEQ ID NO. 4,SEQ ID NO. 5,SEQ ID NO. 6,SEQ ID NO. 7、 SEQ ID NO. 8、SEQ ID NO. 9和SEQ ID NO. 10的保守性变异多肽、或它们的活性片段、或它们的活性衍生物、或它们的类似物的多核苷酸或其简并序列。本领域的人员熟知，相同的氨基酸可有1-6个密码子。在本发明中，“简并序列”是指编码本发明抗凝肽的核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的核苷酸序列。本发明的编码抗凝肽的多核苷酸全长序列或其片段可用多种方法获得，这些方法包括用杂交技术从犬钩虫cDNA文库中筛选、RT-PCR扩增法、重组法或人工化学合成的方法获得，但不仅限于上述列举出的方法。更经常选用的方法是是从犬钩虫中提取RNA，更佳的是mRNA，进行逆转录后扩增获得；或提取mRNA，构建cDNA文库中并杂交筛选或扩增分离。 提取RNA或mRNA、构建cDNA文库已有多种成熟的技术。本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用该载体或直接用钩虫抗凝肽编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。本发明中，编码抗凝肽多核苷酸序列(DNA)插入到载体中，以构成含有本发明所述多核苷酸的重组载体。术语“载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其它载体。在本发明中也不限于上述列举载体。本发明中，编码抗凝肽的多核苷酸或含有该多核苷酸的重组载体可转化或转导入宿主细胞，以构成含有该多核苷酸或重组载体的基因工程化宿主细胞。术语“宿主细胞”指原核细胞，如大肠杆菌；或是真核细胞，如酵母细胞及CHO等。这些宿主细胞是本领域技术人员所了解的。用本发明所述的DNA序列或含有所述DNA序列的重组载体转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。通过常规的重组DNA技术，利用本发明的多核苷酸序列可用来表达或生产重组的抗凝血肽。一般来说有一下步骤(I).用本发明的编码多肽的多核苷酸，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；(2).在合适的培养基中培养宿主细胞；(3).从培养基或宿主细胞中分离、纯化蛋白质。除重组法产生外，本发明中的多肽本还可用固相技术，通过直接合成肽而加以生产，或分别合成各片段，然后用化学方法加以连接以产生本发明中的多肽。
包含本发明的多肽的重组蛋白能显著延长人血浆凝血酶原时间(PT)和活化部分凝血酶原激酶时间(aPTT)，具有显著抗凝活性，可用于作为抗凝药物或抗凝制剂。包含本发明的多肽的重组蛋白具有抗动物血栓形成作用，可用于作为或发展成为抗栓药物。
图I :犬钩虫抗凝 肽AcaNAP9核苷酸序列及其编码的氨基酸序列。图2 :犬钩虫抗凝肽AcaNAPlO核苷酸序列及其编码的氨基酸序列。图3 :犬钩虫抗凝肽AcaNAPll核苷酸序列及其编码的氨基酸序列。图4 AcaNAP9/pET-32a 在宿主菌 BL21 (DE3)表达的 SDS-PAGE 图。其中泳道 I 为蛋白分子量标准；泳道2为未经诱导的pET-32a/AcaNAP9 ;泳道3为经诱导的pET_32a/ AcaNAP9 ;泳道4、5为未经诱导的空质粒pET_32a ;泳道6为可溶蛋白表达情况；泳道7为不可溶蛋白表达情况；泳道8为经镍琼脂糖凝FF亲和纯化的Trx-AcaNAP9融合蛋白。图5 AcaNAP10/pET-32a 在宿主菌 BL21 (DE3)表达的 SDS-PAGE 图。其中泳道 I 为未经诱导的pET-32a/AcaNAP10 ;泳道2为未经诱导的空质粒pET_32a ;泳道3为经诱导的 pET-32a/AcaNAP10 ;泳道4为经镍琼脂糖凝FF亲和纯化的Trx-AcaNAPlO融合蛋白；泳道5 为蛋白分子量标准。图6 =AcaNAPl l/pET-32a 在宿主菌 BL21 (DE3)表达的 SDS-PAGE 图。其中泳道 I为蛋白分子量标准；泳道2为经诱导的空质粒pET-32a ;泳道3为经诱导的pET_32a/ AcaNAP 11 :泳道4为经镍琼脂糖凝FF亲和纯化的Trx-AcaNAPll融合蛋白；泳道5为经诱导的成熟肽羧基端缺失3个氨基酸， 即SEQ ID NO. 5序列)；泳道6为经镍琼脂糖凝FF亲和纯化的Trx-AcaNAPllcd融合蛋白； 泳道7为经诱导的pET-32a/AcaNAPllend (AcaNAPllend代表AcaNAPll成熟肽氨基端及羧基端分别缺失3个氨基酸，即SEQ ID NO. 6序列)；泳道6为经镍琼脂糖凝FF亲和纯化的 Trx-AcaNAPllcnd 融合蛋白。
具体实施例方式下面结合具体实例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如 Sambrook 等人，分子克隆实验室手册(New York Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。实施例I :钩虫抗凝妝基因的克隆I.引物设计根据AcaNAP7 (GenBank 录入号DQ435781)、AcAPc4 (GenBank 录入号AY253915)、 AcAPc3 (GenBank 录入号AY232998)及 AcAPc2 (GenBank 录入号U30793)核苷酸序列设计引物下游引物N2 ;根据钩虫剪切引导序列设计上游引物NSL1，序列如下NSLl :5’ -GGTTTAATTACCCAAGTTTGAG-3’N2 :5， -TTTGGTCATTTTCTGTTAGG-3’2. RNA的分离及反转录
取犬钩虫成虫20条(宿主狗来自广东湛江地区及广西)，用TRIzol Reagent (Invitrogen)按操作说明提取总RNA。依操作说明用3’_Full RACE Core Set (大连Takara)对提取的犬钩虫总RNA进行反转录获得cDNA。3.抗凝肽基因片段的扩增、克隆及测序
以前述方法获得的3 U I犬钩虫成虫cDNA为模板，NSLl及N2为引物，扩增获得约 300bp核酸片段。PCR反应条件为预变性，94°C，5min ;变性，94°C，30s ;退火，50°C，30s ;延 #, 720C，Imin, 30个循环；最后延伸72°C，IOmin0扩增产物用DNA纯化试剂盒(TIANGEN公司)纯化后，用pUCm-T Vector PCR产物克隆试剂盒(上海Sangon)连接到pUCm-T Vector, 转化E. coli DH5 a感受态细胞。随机挑取10个阳性克隆，送交上海Sangon进行测序，获得了 2种编码不同氨基酸序列的基因。根据测序结果，设计引物上游引物N9-1、N10-1，下游引物用3’ -Full RACE Core Set试剂盒提供的锚定引物(SAP)序列，各引物序列如下N9-1 :5，-GCAGTACTAACATTGTTAAACCAAA-3’NlO-I :5，-GCAGTGTAATGCAAATCCAAG-3’SAP :5’ -CTGATCTAGAGGTACCGGATCC-3’(I) AcaNAP9基因全长序列的克隆以2iU犬钩虫cDNA为模板，N9-1及SAP为引物，PCR反应条件为预变性， 94°C，5min ;变性，94°C，30s ;退火，50°C，30s ;延伸，72°C，lmin，30 个循环；最后延伸 72。。， IOmin,扩增获得约400bp核酸片段。扩增产物经纯化、TA克隆后送交上海Sangon测序。测序结果经拼接后，得到AcaNAP9基因全长序列，即SEQ ID NO. 11。(2) AcaNAPlI序列的筛选及克隆以2 ill犬钩虫cDNA为模板，N10-1及SAP为引物，PCR反应条件为预变性， 94°C，5min ;变性，94°C，30s ;退火，50°C，30s ;延伸，72°C，lmin，30 个循环；最后延伸 72。。， lOmin，扩增获得约400bp核酸片段。扩增产物经纯化、TA克隆后送交上海Sangon测序，得到抗凝肽AcaNAPll编码序列及其3-UTR，即SEQ ID NO. 13。(3) AcaNAPlO序列的筛选及克隆为获得AcaNAP11编码肽，根据AcaNAP11序列结果设计引物，设计引物NAP11_2，序列如下N11-2 :5’ -CGAAGCTTGGTCATTTTCTATTAGGG-3，。以2iU犬钩虫cDNA为模板，NlO-I及NI 1-2为引物，PCR反应条件为预变性， 94°C，5min ;变性，94°C，30s ;退火，50°C，30s ;延伸，72°C，lmin，30 个循环；最后延伸 72。。， lOmin，扩增获得约250bp核酸片段。扩增产物经纯化、TA克隆后，挑选阳性克隆送交上海 Sangon测序。除获得编码AcaNAPll序列外,还获得编码另外一抗凝肽-AcaNAPlO基因序列，即 SEQ ID NO. 12。 实施例2 :犬钩虫抗凝肽AcaNAP9序列信息与同源性分析分离的犬钩虫抗凝肽AcaNAP9全长cDNA序列全长为443个碱基(包括3’尾端的 13个腺苷酸A) (SEQ ID NO. 11)，其开放读框(26-310)编码了 94个氨基酸组成的肽类(SEQ ID NO. I)，其中成熟肽由81个氨基酸残基组成(SEQ ID NO. 4)，另外还有13个氨基酸残基组成的信号肽。(图I)。
将犬钩虫抗凝肽AcaNAP9全长cDNA序列及其编码蛋白质用BLAST程序在Genbank+EMBL+DDB J+PD数据库中进行核酸和蛋白质同源性检索，表明数据库中与 AcaNAP9氨基酸序列同源性最大的是犬钩虫抗凝肽AcAPc4 (GenBank录入号AAP82926)， 它们的一致性为65% (62/94)核苷酸序列同源性最大的是犬钩虫抗凝肽 AcAPc4基因(GenBank录入号AY253915)，它们的一致性为86%，AcaNAP9核苷酸序列与 AcAPc2 (GenBank录入号U30793)基因也具有80%的一致性。实施例3 :犬钩虫抗凝肽AcaNAPlO序列信息与同源性分析分离的犬钩虫抗凝肽AcaNAPIO cDNA序列为243个碱基(含终止密码子)(SEQ ID NO. 12)，多核苷酸序列1-240编码80个氨基酸(SEQ ID NO. 2)。(图2)。用BLAST程序在Genbank+EMBL+DDBJ+PD数据库中进行核酸和蛋白质同源性检索， 表明数据库中与AcaNAPlO氨基酸序列同源性最大的是犬钩虫抗凝肽AcAPc4 (GenBank录入号AAP82926)，它们的一致性为87%，其它依次为AcAPc3 (GenBank录入号AAP57305)( 一致性为 76% ), AcaNAP7 ( 一致性为 70% ), AcAPc2 ( 一致性为 66% )。；与 AcaNAPlO 核苷酸序列同源性最大的是犬钩虫抗凝肽AcAPc4基因(GenBank录入号AY253915)，它们的一致性为 93%，AcaNAPlO 核苷酸序列与 AcAPc3 (GenBank 录入号AY232998)、AcaNAP7 (GenBank 录入号DQ435781)基因一致性分别为84%、80%。实施例4 :犬钩虫抗凝肽AcaNAPl I序列信息与同源性分析分离的犬钩虫抗凝肽AcaNAPll cDNA序列为372个碱基(含终止密码子、3’ -UTR 及3’尾端的11个腺苷酸A) (SEQ ID NO. 13)，多核苷酸序列1-240编码80个氨基酸(SEQ ID NO. 3)。(图 3)。用BLAST程序在Genbank+EMBL+DDBJ+PD数据库中进行核酸和蛋白质同源性检索， 表明数据库中与AcaNAPll氨基酸序列同源性最大的是犬钩虫抗凝肽AcAPc4 (GenBank录入号AAP82926)，它们的其一致性为92 %，其它与犬钩虫抗凝肽AcAPc3 (GenBank录入号 AAP57305)、AcaNAP7 (GenBank 录入号ABD98795)、AcAPc2 (GenBank 录入号AAC47080)的一致性依次为;与AcaNAPll核苷酸序列同源性最大的是犬钩虫抗凝肽 AcAPc4基因(GenBank录入号AAP82926)，它们的一致性为95%，AcaNAPll核苷酸序列与与 AcAPc3 基因(GenBank 录入号AY232998)、AcaNAP7 基因(GenBank 录入号DQ435781)、 AcAPc2 基因(GenBank 录入号U30793) —致性分别为 84%、81 %、80%。实施例5 :犬钩虫抗凝肽AcaNAP9的体外表达、分离和纯化(I)犬钩虫抗凝肽AcaNAP9成熟肽的体外表达、分离和纯化根据序列SEQ ID NO. 11及图I所示编码区序列，设计出一对特异性引物，序列如下
N9-3 :5’ -GCGGATCCAAACCAAACTGTGGTGAGA-3’(含内切酶位点 BamH I 及保护碱基 GC)N9-4 :5’ -CGAAGCTTGGTCATTTTCTTTTAGGG-3 (含内切酶位点 Hind III 及保护碱基CG)BamH I和Hind III酶切位点相应于表达载体PET_32a上的选择性内切酶位点。 以重组质粒AcaNAP9/pUCm-T为模板，扩增编码AcaNAP9蛋白(SEQ ID NO. I)的核酸序列。 PCR 反应条件为:预变性，94°C，5min ;变性，94°C，30s ;退火，54°C，30s ;延伸，72°C，30s，30个循环。最后延伸72°C，IOmin15PCR产物用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收纯化后，用BamH I和 Hind III进行双酶切；表达质粒PET-32a亦用BamH I和Hind III双酶切。分别回收前述两酶切产物，将两者用T4DNA连接酶连接并将连接产物转化至E. coli DH5a感受态细胞中， 在含氨苄青霉素的培养基中培养。用PCR法筛选阳性克隆，并进行测序鉴定，所得正确的重组质粒命名为AcaNAP9/pET-32a。经鉴定正确的重组表达质粒转化至大肠杆菌BL21 (DE3) 感受态细胞。在含氨苄青霉素的LB培养液中培养含重组表达质粒AcaNAP9/pET-32a宿主菌BL21 (DE3)，加入IPTG至终浓度为I. Ommol/L进行诱导。离心收集菌体，经超声破碎后收集上清，取上清液用镍琼脂糖凝FF (北京卓冠科技有限公司)进行纯化。行SDS-PAGE电泳检测表达的融合蛋白分子量大小和纯度。结果表明获得了氨基端融合有硫氧还蛋白(Trx) 的Trx-AcaNAP9融合蛋白，融合蛋白分子量大小约为29Kda。由于AcaNAP9氨基端的融合蛋白的分子量大小约为20Kda，推算AcaNAP9蛋白分子量大小约为9Kda，与理论预测相符。该电泳结果见图4。
(2)犬钩虫抗凝肽AcaNAP9成熟肽不含羧基端3个氨基酸的肽段(AcaNAP9cd)的体外表达、分离和纯化根据图I所示编码区序列中编码缺失羧基端3个氨基酸肽段，即SEQ ID NO. 5的编码序列设计上游引物N9-3 (5，-GCGGATCCAAACCAAACTGTGGTGAGA-3’，含内切酶位点BamH I及保护碱基GC)及下游引物N9-6(5’ -CGAAGCTTAGGGTAGATGAACTCCATAIT-3’，含内切酶位点Hind III及保护碱基CG)，以重组质粒AcaNAP9/pUCm-T为模板，扩增编码AcaNAP9成熟肽不含羧基端3个氨基酸的肽段(SEQ ID NO. 5)的核酸序列。扩增产物经酶切连接入表达载体PET-32a，转化至宿主菌BL21 (DE3)进行诱导表达及纯化，获得Trx_AcaNAP9cd，即成熟肽不含羧基端3个氨基酸的肽段AcaNAP9cd与硫氧还蛋白(Trx)的融合蛋白。(3)犬钩虫抗凝肽AcaNAP9成熟肽不含羧基端和氨基端3个氨基酸的肽段 (AcaNAP9cnd)的体外表达、分离和纯化根据图I所示编码区序列中编码不含羧基端和氨基端3个氨基酸的编码序列设计上游引物N9-5 (5，-GCGGATCCTGTGGTGAGAATGAAGAGTA-3’，含内切酶位点BamH I及保护碱基 GC)及下游引物 N9-6 (5’-CGAAGCTTAGGGTAGATGAACTCCATAIT-3’，含内切酶位点 Hind III 及保护碱基CG)，以重组质粒AcaNAP9/pUCm-T为模板，扩增编码AcaNAP9成熟肽不含羧基端和氨基端3个氨基酸的肽段，即SEQ ID NO. 6的核酸序列。扩增产物经酶切连接入表达载体PET-32a，转化至宿主菌BL21 (DE3)进行诱导表达及纯化，获得Trx_AcaNAP9cnd，即成熟肽不含羧基端和氨基端3个氨基酸的肽段AcaNAP9cnd与硫氧还蛋白(Trx)的融合蛋白。实施例6 :犬钩虫抗凝肽AcaNAPlO的体外表达、分离和纯化(I)犬钩虫抗凝肽AcaNAPlO成熟肽的体外表达、分离和纯化根据序列SEQ ID NO. 12及图2所示编码区序列，设计出一对特异性引物，序列如下N10-3 :5’ -GAGGATCCAATCCAAGCTGTGGTGAG-3’(含内切酶位点 BamH I 及保护碱基 GA)N11-2 :5’ -CGAAGCTTGGTCATTTTCTATTAGGG-3 (含内切酶位点 Hind III 及保护碱基CG)BamH I和Hind III酶切位点相应于表达载体PET_32a上的选择性内切酶位点。以重组质粒AcaNAPlO/pUCm-T为模板，扩增编码AcaNAPIO蛋白(SEQ ID NO. 2)的核酸序列。 PCR 反应条件为:预变性，94°C，5min ;变性，94°C，30s ;退火，54°C，30s ;延伸，72°C，30s，30 个循环。最后延伸72°C，IOmin15PCR产物用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收纯化后，用BamH I和 Hind III进行双酶切；表达质粒PET-32a亦用BamH I和Hind III双酶切。分别回收前述两酶切产物，将两者用T4DNA连接酶连接并将连接产物转化至E. coli DH5a感受态细胞中， 在含氨苄青霉素的培养基中培养。用PCR法筛选阳性克隆，并进行测序鉴定，所得正确的重组质粒命名为AcaNAP10/pET-32a。经鉴定正确的重组表达质粒转化至大肠杆菌BL21 (DE3) 感受态细胞。在含氨苄青霉素的LB培养液中培养含重组表达质粒AcaNAP10/pET-32a宿主菌BL21 (DE3)，加入IPTG至终浓度为I. Ommol/L进行诱导。离心收集菌体，经超声破碎后收集上清，取上清液用镍琼脂糖凝FF (北京卓冠科技有限公司)进行纯化。行SDS-PAGE电泳检测表达的融合蛋白分子量大小和纯度。结果表明获得了氨基端融合有硫氧还蛋白(Trx) 的Trx-AcaNAPlO融合蛋白，融合蛋白分子量大小约为29Kda。由于AcaNAPIO氨基端的融合蛋白的分子量大小约为20Kda，推算AcaNAPlO蛋白分子量大小约为9Kda，与理论预测结果相符。电泳结果见图5。 (2)犬钩虫抗凝肽AcaNAPlO成熟肽不含羧基端3个氨基酸的肽段(AcaNAPlOcd) 的体外表达、分离和纯化根据图2所示编码区序列中编码缺失羧基端3个氨基酸肽段，即SEQ ID NO. 7的编码序列设计上游引物N10-3 (5’ -GAGGATCCAATCCAAGCTGTGGTGAG-3’，含内切酶位点BamH I 及保护碱基 GA)及下游引物 N10-6 (5’-CGAAGCTTAGGGTAGATAAACTCCATGITGTC-3’，含内切酶位点Hind III及保护碱基CG)，以重组质粒AcaNAP10/pUCm-T为模板，扩增编码AcaNAPlO 成熟肽不含羧基端3个氨基酸的肽段(SEQ ID NO. 7)的核酸序列。扩增产物经酶切连接入表达载体PET-32a，转化至宿主菌BL21 (DE3)进行诱导表达及纯化，获得Trx-AcaNAPlOcd, 即成熟肽不含羧基端3个氨基酸的肽段AcaNAPlOcd与硫氧还蛋白(Trx)的融合蛋白。(3)犬钩虫抗凝肽AcaNAPlO成熟肽不含羧基端和氨基端3个氨基酸的肽段 (AcaNAPlOcnd)的体外表达、分离和纯化根据图2所示编码区序列中编码不含羧基端和氨基端3个氨基酸的肽段，即SEQ ID NO. 8 编码序列设计上游引物N10-5 (5，-GCGGATCCTGTGGTGAGAATGAAAGGC-3’，含内切酶位点 BamH I 及保护碱基GC)及下游引物N10-6 (5’-CGAAGCTTAGGGTAGATAAACTCCATGITGTC-3’， 含内切酶位点Hind III及保护碱基CG)，以重组质粒AcaNAP10/pUCm-T为模板，扩增编码 AcaNAPlO成熟肽不含羧基端和氨基端3个氨基酸的肽段，即SEQ ID NO. 8的核酸序列。扩增产物经酶切连接入表达载体PET-32a，转化至宿主菌BL21 (DE3)进行诱导表达及纯化，获得Trx-AcaNAPlOcnd,即成熟肽不含羧基端和氨基端3个氨基酸的肽段AcaNAPlOcnd与硫氧还蛋白(Trx)的融合蛋白。实施例7 :犬钩虫抗凝肽AcaNAPll的体外表达、分离和纯化(I)犬钩虫抗凝肽AcaNAPll成熟肽的体外表达、分离和纯化根据序列SEQ ID NO. 13及图3所示编码区序列，设计出一对特异性引物，序列如下N10-3 :5’ -GAGGATCCAATCCAAGCTGTGGTGAG-3’(含内切酶位点 BamH I 及保护碱基 GA)
N11-2 :5’ -CGAAGCTTGGTCATTTTCTATTAGGG-3J (含内切酶位点 Hind III 及保护碱基CG)BamH I和Hind III酶切位点相应于表达载体PET_32a上的选择性内切酶位点。 以重组质粒AcaNAPll/pUCm-T为模板，扩增编码AcaNAPll蛋白(SEQ ID NO. 3)的核酸序列。 PCR 反应条件为:预变性，94°C，5min ;变性，94°C，30s ;退火，54°C，30s ;延伸，72°C，30s，30 个循环。最后延伸72°C，IOmin15PCR产物用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收纯化后，用BamH I和 Hind III进行双酶切；表达质粒PET-32a亦用BamH I和Hind III双酶切。分别回收前述两酶切产物，将两者用T4DNA连接酶连接并将连接产物转化至E. coli DH5a感受态细胞中， 在含氨苄青霉素的培养基中培养。用PCR法筛选阳性克隆，并进行测序鉴定，所得正确的重组质粒命名为AcaNAPll/pET-32a。经鉴定正确的重组表达质粒转化至大肠杆菌BL21 (DE3) 感受态细胞。在含氨苄青霉素的LB培养液中培养含重组表达质粒AcaNAPll/pET-32a宿主菌BL21 (DE3)，加入IPTG至终浓度为I. Ommol/L进行诱导。离心收集菌体，经超声破碎后收集上清，取上清液用镍琼脂糖凝FF (北京卓冠科技有限公司)进行纯化。行SDS-PAGE电泳检测表达的融合蛋白分子量大小和纯度。结果表明获得了氨基端融合有硫氧还蛋白(Trx) 的Trx-AcaNAPll融合蛋白，融合蛋白分子量大小约为29Kda。由于AcaNAPll氨基端的融合蛋白的分子量大小约为20Kda，推算AcaNAPll蛋白分子量大小约为9Kda，与理论预测结果相符。电泳结果见图6。(2)犬钩虫抗凝肽AcaNAPll成熟肽不含羧基端3 个氨基酸的肽段(AcaNAPllcd) 的体外表达、分离和纯化根据图3所示编码区序列中编码缺失羧基端3个氨基酸肽段，即SEQ ID NO. 9的编码序列设计上游引物N10-3 (5’ -GAGGATCCAATCCAAGCTGTGGTGAG-3’，含内切酶位点BamH I 及保护碱基 GA)及下游引物 Nll-6 (5’-CGAAGCTTAGGGTAGATAAACTCCATAITGTC-3’，含内切酶位点Hind III及保护碱基CG)，以重组质粒AcaNAPl I/pUCm-T为模板，扩增编码AcaNAPll 成熟肽不含羧基端3个氨基酸的肽段(SEQ ID NO. 9)的核酸序列。扩增产物经酶切连接入表达载体PET-32a，转化至宿主菌BL21 (DE3)进行诱导表达及纯化，获得Trx-AcaNAPl led， 即成熟肽不含羧基端3个氨基酸的肽段AcaNAPllcd与硫氧还蛋白(Trx)的融合蛋白。 SDS-PAGE电泳结果见图6。(3)犬钩虫抗凝肽AcaNAPll成熟肽不含羧基端和氨基端3个氨基酸的肽段 (AcaNAPllcnd)的体外表达、分离和纯化根据图3所示编码区序列中编码不含羧基端和氨基端3个氨基酸的肽段，即SEQ ID NO. 10 编码序列设计上游引物 Nll-5(5’ -GCGGATCCTGTGGTGAGAATGAAAGGTAT-3’，含内切酶位点 BamH I 及保护碱基 GC)及 N11-6 (5，-CGAAGCTTAGGGTAGATAAACTCCATAITGTC-3’， 含内切酶位点Hind III及保护碱基CG)，以重组质粒AcaNAPl I/pUCm-T为模板，扩增编码 AcaNAPll成熟肽不含羧基端和氨基端3个氨基酸的肽段，即SEQ ID NO. 10的核酸序列。扩增产物经酶切连接入表达载体PET-32a，转化至宿主菌BL21 (DE3)进行诱导表达及纯化，获得Trx-AcaNAP Ilcnd,即成熟肽不含羧基端和氨基端3个氨基酸的肽段AcaNAP 11 end与硫氧还蛋白(Trx)的融合蛋白。SDS-PAGE电泳结果见图6。实施例8 :犬钩虫抗凝妝融合蛋白 Trx_AcaNAP9、Trx-AcaNAPlO、Trx-AcaNAPlI、 Trx_AcaNAP9cd、Trx-AcaNAP10cd>Trx-AcaNAPlled、Trx_AcaNAP9cnd、Trx-AcaNAPlOcnd及Trx-AcaNAPllcnd的抗凝活性实验用试管法(使用一次性塑料试管，规格12X75mm)手工测定PT和aPTT。对纯化的融合蛋白 Trx_AcaNAP9、Trx-AcaNAP 10、Trx-AcaNAP11、Trx_AcaNAP9cd、Trx-AcaNAPIOcd、 Trx-AcaNAPlled、Trx_AcaNAP9cnd、Trx-AcaNAPlOcnd 及 Trx-AcaNAPllcnd 进行适当比例稀释后按照试剂盒(上海太阳生物技术公司产品)提供的使用要求及步骤测定数据， 每个浓度均重复3次。同时用本实验室用同样方法制备的Trx-ACAPC2(Trx-NAPC2)和 Trx-AcAP5 (Trx-NAP5)融合蛋白作阳性对照，生理盐水作阴性对照。凝血酶原时间(PT)测定取一定浓度的蛋白纯化产物10 ill和90 ill正常人血浆 (取自广东医学院附属医院体检的健康人体)混匀后37°C孵育3min，加入37°C预温的PT 试剂0. 2ml ，记录凝固时间，即为PT值。每个浓度均重复3次，取各浓度PT值均数与空白对照组PT值比较即为该浓度延长PT倍数。活化部分凝血活酶时间(aPTT)测定取一定浓度的蛋白纯化产物10 和90 yl 正常人血浆(取自广东医学院附属医院体检的健康人体)混匀后，加入37°C预温的aPTT试剂0. Iml 37°C孵育5min，加入37°C预温的0.025mol/L的CaCl2溶液0. 1ml，记录凝固时间， 即为aPTT值。每个浓度均重复3次，取各浓度aPTT值均数与空白对照组aPTT值比较即为该浓度延长aPTT倍数。各重组犬钩虫抗凝肽融合蛋白对健康人血浆PT、aPTT值影响见表I、表2。如表所示，本发明中所述犬钩虫抗凝肽融合蛋白Trx_AcaNAP9、Trx_AcaNAP10、 Trx-AcaNAPlI、Trx_AcaNAP9cd、Trx-AcaNAPIOcd> Trx-AcaNAPlled、Trx_AcaNAP9cnd、 Trx-AcaNAPlOcnd及Trx-AcaNAPllcnd在实验中均显著延长人血衆PT、aPTT,即具有显著抗凝活性。延长人血衆PT以Trx_AcaNAP9、Trx_AcaNAP9cd及Trx_AcaNAP9cnd为活性最好； 延长人血衆 aPTT 以 Trx-AcaNAPlI、Trx-AcaNAPllcd 及 Trx-AcaNAPllcnd 为活性最好。各钩虫抗凝肽羧基端或氨基端缺失3个氨基酸时，生物活性没有明显变化，因为分子量小的多肽可能能避免或减少对机体用药时形成对它的抗体，对体内用药的好处是显而易见。分子量小的多肽也更易于生产，尤其是在化学合成生产多肽时。与NAPc2相比较，本发明中所述钩虫抗凝肽融合蛋白虽然在延长PT活性方面具有一定差异(表1)，但他们在延长aPTT活性方面是显著强于NAPc2的(表2);与NAP5相比较， 本发明中所述钩虫抗凝肽融合蛋白虽然在延长aPTT活性方面具有一定差异(表2)，但他们在延长PT活性方面是显著强于NAP5的，如在60. Onmol -L^1浓度时，融合蛋白Trx_NAP5基本无延长PT活性，但本发明中所述钩虫抗凝肽融合蛋白均具有显著的延长PT的活性(表 I)。这些结果表明本发明中所述钩虫抗凝肽具有独特的作用特点。表I各重组钩虫抗凝肽融合蛋白延长人血浆PT倍数表(表中数值为延长PT倍
数)
权利要求
1.一种分离的犬钩虫抗凝肽，其特征在于，该抗凝肽选自下组 (a)由SEQID NO. 2氨基酸序列组成的多肽； (b)由SEQID NO. 7氨基酸序列组成的多肽； (c)由SEQID NO. 8氨基酸序列组成的多肽。
2.一种分离的多核苷酸，其特征在于其编码权利要求I所述的犬钩虫抗凝肽。
3.—种载体,其特征在于它包含权利要求2所述的多核苷酸。
4.一种宿主细胞，其特征在于它包含权利要求2所述的多核苷酸或权利要求3所述的载体。
5.权利要求I所述犬钩虫抗凝肽的制备方法，其特征，该方法包括 (a)在合适的培养基中培养权利要求4所述的宿主细胞； (b)从培养基或宿主细胞中分离、纯化犬钩虫抗凝肽。
6.一种药物组合物，其特征在于，它包含有权利要求I所述的犬钩虫抗凝肽及药学上可接受的载体。
7.权利要求I所述的犬钩虫抗凝肽在制备抗凝药物、抗血栓药物中的应用。
全文摘要
本发明是申请号为200710079673.0的发明专利申请的分案。本发明公开了一种新的犬钩虫抗凝肽及其编码序列。本发明获得的抗凝肽具有抗凝活性，能显著延长人血浆凝血酶原时间(PT)和活化部分凝血酶原激酶时间(aPTT)，并具显著抗血栓形成作用。本发明还涉及上述抗凝肽在抗凝药物、抗血栓药物方面的应用。
文档编号C12N5/10GK102617722SQ20121002624
公开日2012年8月1日 申请日期2007年3月5日 优先权日2007年3月5日
发明者吴亚敏, 彭礼飞, 杨陈, 甘伟琼, 胡晶晶, 邓莉 申请人:广东医学院