本发明涉及烟草加工领域，特别是涉及一种用于烟草处理的复合酶的制备方法，并进一步涉及通过该制备方法制备获得的复合酶对烟叶进行处理的方法。
背景技术：
：烤烟的上部烟叶包括二棚叶和顶叶，共6～7片叶，占整株烟叶总产量的30％～40％。上部烟叶成熟度不够，烘烤后青烟和浮青烟多，由于身份较厚，组织结构较紧密，含氮化合物含量较高，杂气、刺激性较重等品质缺陷，工业可用性较差。研究表明，上部烟叶中淀粉、蛋白质的含量分别为7％左右及10％以上，较优等烟叶(淀粉4％～5％，蛋白质7％左右)明显偏高，化学成分不协调。因此，降低上部烟叶中淀粉、蛋白质等大分子物质的含量，可以有效减少烟叶在吸食过程中产生的辛辣味和刺激性，使烟叶吸食起来更加柔和，从而改善烟叶吸食品质，提高上部烟叶利用价值。目前，国内外专家及学者针对烟草原料自身的不足进行了多方面的探索，其中利用生物酶技术改善烟草原料吸食品质的研究越来越多，希望提高烟草原料的内在品质及综合利用率。利用外加酶制剂在较温和的环境下经过一定时间的处理，可以促进烟草物料中如果胶、纤维素、淀粉和蛋白质等大分子物质部分降解为低聚糖、还原糖、和氨基酸等小分子物质，并能够使烟草中香气成分有所增加，有效减少卷烟燃吸时的杂气、刺激性，改善烟草产品的吸食品质。但是目前酶法改善上部烟叶品质的研究也存在各种问题，如市售酶制剂的种类不全，不同来源的酶活单位可能定义不同，导致缺乏统一的酶活标准及标准的检测方法等，从而无法比较不同来源酶制剂的作用效果，施加重现性差；此外，商品酶制剂由于含有一定量的防腐剂、稳定剂等添加剂，施加于烟草可能引起异味。因而以烟草粉末作为发酵培养基底物，采用微生物发酵法生产适用于上部烟叶品质改善的复合酶制剂具有十分重要的价值。技术实现要素：鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种通过微生物发酵液对烟叶进行处理的方法，用于解决现有技术中的问题。为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种用于烟草处理的复合酶的制备方法，包括：1)将含有上部烟叶的液态发酵培养基接种黑曲霉，发酵；2)将发酵所得产物固液分离，液相浓缩，即可制备获得复合酶的发酵液。本申请所提供的烟草处理方法中，所述黑曲霉(aspergillusniger)为半知菌亚门、丝孢纲、丝孢目、丛梗孢科、曲霉属中的一个种。本申请所提供的烟草处理方法中，所述上部烟叶通常指烤烟的上部烟叶，包括二棚叶和顶叶，共6～7片叶，通常占整株烟叶总产量的30～40wt％。在本发明一些实施方式中，所述含有上部烟叶的液态发酵培养基为分散有上部烟叶的水溶液。所述液态发酵培养基中，上部烟叶通常可以被粉碎后，均匀分散于水体中，构成悬浮液，本领域技术人员可选择合适参数的上部烟叶(例如，种类、配比、大小等)以制备液态发酵培养基，例如，上部烟叶的种类可以是河南b22、河南b33、湖南b22、贵州b22、贵州b33等中的一种或多种的组合，再例如，液态发酵培养基中上部烟叶干基的重量百分比为1-10％，再例如，上部烟叶的粒径通常可以≥100目，还可以≤50目。在本发明一些实施方式中，所述液态发酵培养基的ph通常为3-10，调节培养基ph的方式对于本领域技术人员来说应该是已知的，例如，可以采用ph调节剂调节培养基的ph值，所使用的ph调节剂可以是例如盐酸(hcl)、氢氧化钠(naoh)水溶液等。在本发明一些实施方式中，将含有上部烟叶的液态发酵培养基接种黑曲霉种子液。在本发明一些实施方式中，所述黑曲霉种子液的制备方法包括：将黑曲霉接种于含有上部烟叶的液态种子培养基中，培养。本领域技术人员可选择合适的培养条件用于黑曲霉种子液的培养，具体的培养条件可以是：上部烟叶粉碎物(80目)10g/l，装液量200/500ml锥形瓶，30℃、160r/min摇床培养72h。在本发明一些实施方式中，所述含有上部烟叶的液态种子培养基为分散有上部烟叶的水溶液。所述液态种子培养基中，上部烟叶通常可以被粉碎后，均匀分散于水体中，构成悬浮液，本领域技术人员可选择合适参数的上部烟叶(例如，种类、配比、大小等)以制备液态种子培养基，例如，上部烟叶的种类可以是河南b22、河南b33、湖南b22、贵州b22、贵州b33等中的一种或多种的组合，再例如，液态种子培养基中上部烟叶干基的重量百分比为1-10％，再例如，上部烟叶的粒径通常可以≥100目，还可以≤50目。在本发明一些实施方式中，黑曲霉种子液的接种量相对于液态发酵培养基的重量百分比为1-15wt％。在本发明一些实施方式中，将黑曲霉接种于含有上部烟叶的液态种子培养基中的接种的方式斜面接种。本申请所提供的烟草处理方法中，所述发酵通常为液态发酵法，本领域技术人员通常可根据菌种生长所需的适合温度、发酵周期、所需产物的指标等参数选择合适的发酵条件。在本发明一些实施方式中，发酵的温度可以是例如25-35℃，发酵的时间可以是例如2-10天。本申请所提供的烟草处理方法中，本领域技术人员可选取合适的方法，将发酵所得产物固液分离。在本发明一些实施方式中，发酵所得产物可以通过离心实现固液分离。在本发明一些实施方式中，液相浓缩至原始淀粉酶活≥102u/ml。在本发明一些实施方式中，液相浓缩至原液体积的1/5-1/200。本领域技术人员可选择合适的浓缩方法和条件，以实现液相的浓缩，例如，液相可以通过切向流超滤进行浓缩。本发明第二方面提供所述复合酶的制备方法制备获得复合酶。本发明第三方面提供所述复合酶在烟草处理中的用途。本发明第四方面提供一种烟草处理方法，包括：将所述复合酶施加至上部烟叶，保温、烘干。在本发明一些实施方式中，将所述复合酶的发酵液施加至上部烟叶。在本发明一些实施方式中，发酵液按4-20:1的料液比均匀施加。在本发明一些实施方式中，发酵液施加至经切丝的上部烟叶。在本发明一些实施方式中，保温处理的温度可以为30-50℃，时间可以为1-5小时。在本发明一些实施方式中，烘干至水分含量为10-15wt％。本发明利用微生物发酵法采用上部烟叶作为液态发酵的培养基发酵黑曲霉，并以发酵浓缩液改善上部烟叶品质的方法，首先筛选可以利用烟叶粉末的悬液作为培养基产淀粉酶、蛋白酶等生物酶的黑曲霉菌种，再经烟叶添加量、接种量、ph、发酵温度等进一步优化，得到产各种生物酶的最佳条件，有针对性的产生含淀粉酶、蛋白酶等生物酶的复合酶液，最后将最佳条件下的发酵液进行适当浓缩，用于上部烟叶品质的改善，从而可以在一定条件下使黑曲霉分泌相应的生物酶对上部烟叶中的大分子物质(蛋白质、淀粉等)进行酶解转化为自身生长所需的碳源和氮源等，进而分离并收集发酵液，通过超滤浓缩得到复合酶液，制备得到微生物发酵复合酶制剂。然后基于生物酶解作用，在较低水分条件下，对上部烟叶中的蛋白质、淀粉等成分进行生物转化，将其用于上部烟叶中大分子物质的降解而改善其吸食品质。本发明所提供的烟草处理方法具有工艺相对简单、易于实现、成本相对较低，只以上部烟叶作为唯一培养基底物发酵产复合酶，在保留烟叶本身特殊的风味的同时，在浓缩复合酶液作用于上部烟叶时不仅明显降低了其淀粉、蛋白质等大分子成分的残留量，从而改善了上部烟叶吸食品质；同时，仅以上部烟叶作为微生物的发酵培养基，避免了外加商品酶制剂带来的不良风味。具体实施方式以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。须知，下列实施例中未具体注明的工艺设备或装置均采用本领域内的常规设备或装置。此外应理解，本发明中提到的一个或多个方法步骤并不排斥在所述组合步骤前后还可以存在其他方法步骤或在这些明确提到的步骤之间还可以插入其他方法步骤，除非另有说明；还应理解，本发明中提到的一个或多个设备/装置之间的组合连接关系并不排斥在所述组合设备/装置前后还可以存在其他设备/装置或在这些明确提到的两个设备/装置之间还可以插入其他设备/装置，除非另有说明。而且，除非另有说明，各方法步骤的编号仅为鉴别各方法步骤的便利工具，而非为限制各方法步骤的排列次序或限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容的情况下，当亦视为本发明可实施的范畴。实施例1对于黑曲霉发酵生产复合酶的过程及相关发酵条件的优化过程如下：(1)制备种子液，将活化后的黑曲霉菌种接种到种子培养基中，具体步骤为：加10ml无菌水在活化培养基斜面上，用接种针搅拌使黑曲霉尽量分散于无菌水中，吸取5ml菌悬液接种于黑曲霉种子培养基中；摇床发酵培养结束后，将摇瓶从培养箱中取出作为种子液用于下一步的发酵培养。制备黑曲霉种子液所用培养基配方为：上部烟叶(贵州b22)粉碎物(80目)10g/l，装液量200/500ml锥形瓶，30℃、160r/min摇床培养72h；(2)发酵培养，将步骤(1)中所制备的种子液扩增发酵培养，具体步骤为：将黑曲霉种子液接种到发酵培养基中，30℃、160r/min摇床培养96h；所述发酵培养基配方为：上部烟叶粉碎物(80目)30g/l、ph6.0(以hcl溶液或naoh溶液作为ph调节剂调节培养基的ph值)；黑曲霉种子液接种到发酵培养基的接种量按5％体积分数计算。(3)粗提酶液，发酵液经抽滤滤去菌体及培养基，再经超滤浓缩得粗酶液，测定酶活后即为复合酶成品。实施例2单因素实验确定影响复合酶酶活的主要影响因素为：烟叶添加量、接种量、ph。发酵培养条件的优化采用中心组合设计(centralcompositedesign)方法，以主要影响因素：烟叶添加量(a)、接种量(b)、ph(c)为自变量，淀粉酶活力(y1)和蛋白酶活力(y2)为响应值设计，采用designexpert10.0.3(stat-easeinc,minneapolis,usa)软件完成相关的实验设计、数据分析和模型建立，其中d(轴向点)为1.682。影响因素和对应水平的取值如表1所示，实验的具体方法如表2所示。按表2所给出的实验方案，除自变量参照表2外，其他具体实验步骤均参照实施例1，所得的实验结果亦如表2所示。表1表2编号a烟叶添加量％b接种量％cphy1淀粉酶活力u/mly2蛋白酶活力u/ml1438192.37839.212356285.271029.183356254.63987.424234106.87675.845474211.17589.926278212.89621.467478289.43878.458356278.35997.559356243.441076.6710434111.22679.4811238107.59873.691227491.37383.9113359.36204.43946.9414356229.04947.39151.3256109.07428.6216356261.49958.06174.6856188.19738.951838.366174.85384.291931.646166.08429.8620352.64155.28827.94将表2所得数据录入designexpert10.0.3(stat-easeinc,minneapolis,usa)软件软件进行进一步处理，输出结果如表3、表4所示，表3所示为基于淀粉酶活的运算结果，表4所示为基于蛋白酶活为评价指标的运算结果。表3来源平方和自由度均方f值p-值显著性回归模型69388.0697709.787.990.0038显著a-烟叶添加量12826.54112826.5413.290.0065显著b-接种量6658.7816658.786.900.0303c-ph9718.3319718.3310.070.0131ab1436.7511436.751.490.2571ac172.701172.700.180.6834bc1737.8511737.851.800.2164a220567.25120567.2521.320.0017b213022.95113022.9513.500.0063c210306.34110306.3410.680.0114残差7718.468964.81失拟项6113.2051222.642.280.2641不显著纯误差1605.263535.09总差79551.8019对上表数据进行回归分析，各因素经回归拟合后得到的二次响应面回归方程为：y1＝258.85+30.65a+22.08b+26.68c+13.40ab+4.65ac+14.74bc-37.79a2-30.07b2-26.75c2对上述方程及相关实验结果进行分析，发酵培养时淀粉酶活理论最高值可达258.85u/ml，此时对应的培养基配方为：烟叶添加量3％、接种量5％、ph＝6。以此最有条件再进行验证，即培养基配方为：烟叶添加量3％、接种量5％、ph＝6，其他步骤参照实施例1，淀粉酶活实验值为252.81u/ml，与理论值近似，表明本发明所提供酶活性能较为稳定、可靠。表4对上表数据进行回归分析，各因素经回归拟合后得到的二次响应面回归方程为：y2＝999.23+69.86a-49.14b+79.36c+61.73ab+1.61ac+21.06bc-126.78a2-189.25b2-19.42c2对上述两个方程及相关实验结果进行分析，得到淀粉酶和蛋白酶理论酶活的最高值分别为277.65u/ml和1049.27u/ml，此时对应的培养基配方为：烟叶添加量3.4％、接种量5.47％、ph＝7.74。为便于操作，取培养基配方为，即培养基配方为：烟叶添加量3.5％、接种量5.5％、ph＝7.7，在30℃、160r/min摇床培养6d，所得发酵液中淀粉酶活实验值为267.81u/ml，蛋白酶活实验值为1032.17u/ml，与理论值近似，表明本发明所提供酶活性能较为稳定、可靠。实施例2在上述最佳发酵条件下(烟叶添加量3.5％、接种量5.5％、ph＝7.7，其他步骤均参照实施例1，下同)，所产复合酶浓缩液稀释5倍，按料液比5:1均匀喷洒到上部烟叶上，于40℃酶解2.5h，酶解后烘干至水分含量12.5％，测定淀粉和蛋白残留量较未经酶解的对照组样品分别降低21.2％和18.4％，感官评价结果优于对照组样品。在上述最佳发酵条件下，所产复合酶浓缩液稀释5倍，按料液比10:1均匀喷洒到上部烟叶上，于40℃酶解2.5h，酶解后烘干至水分含量12.5％，测定淀粉和蛋白残留量较未经酶解的对照组样品分别降低17.7％和15.2％，感官评价结果较优于对照组样品。在上述最佳发酵条件下，所产复合酶浓缩液稀释5倍，按料液比20:1均匀喷洒到上部烟叶上，于40℃酶解3h，酶解后烘干至水分含量12.5％，测定淀粉和蛋白残留量较未经酶解的对照组样品分别降低12.9％和14.4％，感官评价结果较优于对照组样品。综上所述，本发明有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属
技术领域：
中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。当前第1页12