本发明涉及生物检测领域，尤其涉及一种多荧光单元复合分子的合成方法及其应用。
背景技术：
在生物体中，pH扮演了很重要的角色，而对于机体中各个器官、组织的微环境来说，精确测定pH显得尤为重要，其直接影响了组织器官的正常活动。随着生物学医学的发展，已经制备了用于测定生物体内pH的比率荧光传感器。通常的荧光传感器是用单一的荧光分子pH敏感型(Oregon488，Fluorescein)和pH惰性型(Alexa633，Rhodamine B)，在荧光传感器的标准曲线测定时，每批次传感器都需要耗费大量精力来标定标准曲线，这极大的降低了工作效率。Richard P.Haugland在Handbook of Fluorescent Probes and Reseach Products一书中列举了大量荧光分子，但没有涉及将两个荧光分子(敏感荧光分子和参比荧光分子)偶联在一起的方法。为了解决荧光组分之间的比例问题和可重复性问题，我们设计合成了一种分子，这种分子同时包括pH敏感单元和pH惰性单元。
比率荧光法荧光纳米传感器由于涉及到两个(指示和参比)或者多个荧光(两个及以上指示荧光和一个参比荧光)单元体系，很难精确固定纳米颗粒上荧光单元之间的比例，导致批次间纳米传感器间性能不稳定，亦即标准曲线批次间重复性差，造成传感器性能的不可控。虽然复杂的生物介质、纳米材料本身结构的差异、材料表面电荷等也会造成标准曲线的变化，但是在固定上述条件时，荧光传感器性能的差异主要是由指示和参比荧光分子比例变化造成的。如果仅侧重纳米传感器概念性的开发和研究，制备一次样品即可满足所有初步探索性实验要求，这样就不涉及批次间纳米传感器性能无法重现带来的困扰。
如果设计一种单一荧光指示分子，该分子由两个荧光单元(A，B)组成，在不同待测物浓度下两个荧光单元的固有的荧光波长下荧光强度(IA，IB)发生变化，通过两种荧光单元的荧光强度比值(IA/IB)随待测物浓度变化实现对待测物的定量检测，从而可解决传感器批次间标准曲线不一致问题。
技术实现要素：
本发明的目的在于解决传感器批次间标准曲线不一致的问题，提供一种固定结构多荧光组分复合分子，即一种多荧光单元复合分子；本发明的目的还在于提供所述多荧光单元复合分子的合成方法及应用。
本发明选取异硫氰根罗丹明和异硫氰根荧光素作为原料，采用Click chemistry、控制反应条件等手段实现商用多荧光分子按照固定分子结构偶联，并保证偶联后的复合分子中多种荧光组分之间比例固定，获得高效制备多荧光单元复合物的方法。进而开辟一种将多种商业荧光小分子偶联在一起的通用、高效方法，开发出制备批次间性能稳定(标准曲线重复性好)传感器的方法，尤其对系统长期使用纳米传感器作为研究工具时提供了极大的便利。
本发明的目的通过下述技术方法实现：
本发明选取异硫氰根罗丹明和异硫氰根荧光素作为原料，通过氨基化的反应，为了控制多位点的竞争，控制物质的投料比，采取柱分离的方法选择所需产品，然后分别用己炔酸、叠氮丁酸与分离得到的产品反应，得到炔基取代的产物和叠氮基取代的产物，继而在Cu+催化下，在室温通过Click chemistry成环得到多荧光单元的复合分子。
一种多荧光单元复合分子，其结构如下所示：
一种多荧光单元复合分子的合成方法，包括如下步骤：
(1)以异硫氰根荧光素为原料，选择乙二胺进行氨基化反应，反应混合物通过柱层析分离，得到化合物①。
作为优选项，所述步骤(1)中氨基化反应的条件为：20-30℃避光搅拌18-24h。
作为优选项，所述步骤(1)中柱层析分离所用洗脱剂为二氯甲烷:乙醇＝1-2:1(V/V)的混合溶液；进一步优选的，二氯甲烷:乙醇＝1:1。
(2)化合物①与叠氮丁酸进行取代反应，反应混合物通过柱层析进行梯度洗脱，得到化合物②。
作为优选项，所述步骤(2)中用水:乙醇＝20-100:1(V/V)的混合溶液溶解化合物①；进一步优选的，水:乙醇＝60:1。
作为优选项，所述步骤(2)中叠氮丁酸溶解在水中，先加入EDC活化0.5-2h后，再加入NHS活化0.5-2h；
作为优选项，所述步骤(2)中取代反应的条件为：20-30℃避光搅拌18-24h；
作为优选项，所述步骤(2)中梯度洗脱的洗脱剂分别为二氯甲烷:乙醇＝1-3:1(V/V)的混合溶液、二氯甲烷:甲醇＝1:2-4(V/V)的混合溶液，收集二氯甲烷:甲醇＝1:2-4的洗脱组分；进一步优选的，二氯甲烷:乙醇＝1:1，二氯甲烷:甲醇＝1:2。
(3)以异硫氰根罗丹明为原料，选择乙二胺进行氨基化反应，反应混合物通过柱层析分离，得到化合物③。
作为优选项，所述步骤(3)中氨基化反应的条件为：20-30℃避光搅拌18-24h；
作为优选项，所述步骤(3)中柱层析分离所用洗脱剂为二氯甲烷:乙醇＝11-15:1(V/V)的混合溶液；进一步优选的，二氯甲烷:乙醇＝11:1。
(4)化合物③与己炔酸进行取代反应，反应混合物通过柱层析分离，得到化合物④。
作为优选项，所述步骤(4)中用水:乙醇＝20-60:1(V/V)的混合溶液溶解化合物③；进一步优选的，水:乙醇＝40:1。
作为优选项，所述步骤(4)中己炔酸溶解在水中，先加入EDC活化0.5-2h后，再加入NHS活化0.5-2h；
作为优选项，所述步骤(4)中取代反应的条件为：20-30℃避光搅拌18-24h；
作为优选项，所述步骤(4)中柱层析分离所用洗脱剂为二氯甲烷:甲醇＝8-10:1(V/V)的混合溶液；进一步优选的二氯甲烷:甲醇＝8:1。
(5)化合物②和化合物④通过点击化学反应(Click chemistry)成环得到化合物⑤。
作为优选项，所述步骤(5)中化合物②和化合物④的摩尔比为1:1；
作为优选项，所述步骤(5)中溶解化合物②和化合物④的溶剂为水:叔丁醇:乙醇＝4:1:1(V/V)；
作为优选项，所述步骤(5)中Cu2+作为催化剂前体；
作为优选项，所述步骤(5)中抗坏血酸钠作为还原剂，将Cu2+还原为Cu+作为催化剂；
上述步骤(1)、(3)中氨基化反应所选择乙二胺还可替换为三(2-氨基乙基)胺。
上述多荧光单元复合分子在比率荧光传感器中的应用。本发明的多荧光单元复合分子，与单荧光分子相比，克服了单荧光分子和多位点活性化合物存在的竞争反应，实现多荧光分子的高效偶联，并保证偶联后的复合分子中多种荧光组分之间比例固定。进而开辟出一种将多种商业荧光小分子偶联在一起的通用、高效方法，开发出制备批次间性能稳定(标准曲线重复性好)传感器的方法，尤其对系统长期使用纳米传感器作为研究工具时提供了极大的便利。
一种多荧光单元复合分子的合成方法，为将两种荧光分子用异硫氰根修饰后，按照上述方法进行氨基化反应、取代反应和点击化学反应合成多荧光单元复合分子。
本发明的优点和有益效果为：
(1)利用乙二胺进行氨基化，并通过柱层析的方法将其分离，从而得到所需的产物。
(2)利用叠氮丁酸和己炔酸分别对单荧光素-乙二胺和单罗丹明-乙二胺进行修饰，从而为点击化学反应做准备。
(3)利用点击化学的方法巧妙的将两个商用多荧光分子按照固定分子结构偶联，确保了荧光分子的固定结构和固定比率。
(4)将合成出的多荧光单元复合分子应用到比率荧光传感器中，可制备出批次间性能稳定(标准曲线重复性好)传感器。
具体实施方式
以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1单荧光素-乙二胺的制备
反应式如下式所示：
具体步骤为：
(1)取1mL水加入到2mL离心管中，向离心管中加入4.72μL乙二胺，再加入8.92μL三乙胺，转移至烧瓶中，超声混合均匀。
(2)称取25mg异硫氰根荧光素(FSITC)，将其溶解在4mL无水乙醇中，充分溶解后加入至(1)中的烧瓶中，室温避光搅拌24h，用旋转蒸发仪蒸干溶剂，使用1-2mL二氯甲烷:乙醇＝1:1(V/V)的混合溶液进行复溶。
(3)将玻璃层析柱固定在铁架台上，将100-200nm的硅胶装入到玻璃层析柱中，硅胶的高度占玻璃层析柱高度的一半即可，然后用循环水式多用真空泵将其抽实。取一个干净的90mm的玻璃培养皿，在其中加入少量100-200nm硅胶，将(2)中复溶的液体滴加到培养皿的硅胶上，用微量药勺将其搅拌均匀，直到硅胶变干。将其加入到装有硅胶的玻璃层析柱中，再加入少量硅胶或棉花作为保护层。使用二氯甲烷:乙醇＝1:1(V/V)的混合溶液作为洗脱剂洗脱，收集液体，真空干燥，得到化合物①单荧光素-乙二胺。
实施例2单荧光素-乙二胺-叠氮丁酸的制备
反应式如下式所示：
具体步骤为：
(1)称取9mg单荧光素-乙二胺，将其溶解在6mL水和100μL乙醇中，加入20μL氨水(25-28％)，超声充分溶解。
(2)称取2.5mg叠氮丁酸溶解在1mL水中，加入EDC 7.16mg活化1h，再加入NHS 2.3mg活化1小时，将其加入至(1)的单荧光素-乙二胺溶液中，室温避光搅拌24h。冷冻干燥后用1-2mL二氯甲烷:乙醇＝1:1(V/V)的混合溶液复溶。
(3)将玻璃层析柱固定在铁架台上，将100-200nm的硅胶装入到玻璃层析柱中，硅胶的高度占玻璃层析柱高度的一半即可，然后用循环水式多用真空泵将其抽实。取一个干净的90mm的玻璃培养皿，在其中加入少量100-200nm硅胶，将(2)中复溶的液体滴加到培养皿的硅胶上，用微量药勺将其搅拌均匀，直到硅胶变干。将其加入到装有硅胶的玻璃层析柱中，再加入少量硅胶或棉花作为保护层。使用二氯甲烷:乙醇＝1:1(V/V)的混合溶液作为洗脱剂洗脱得到第一组份，当第一组份的红色褪去时，说明第一组份洗脱完毕；然后再用二氯甲烷:甲醇＝1:2(V/V)的混合溶液作为洗脱剂洗脱得到第二组分。将第二组份旋蒸除去溶剂后复溶在1-2mL水中，真空干燥得到化合物②单荧光素-乙二胺-叠氮丁酸。
实施例3单罗丹明-乙二胺的制备
反应式如下式所示：
具体步骤为：
(1)取3mL水加入到5mL离心管中，向离心管中加入12.6μL乙二胺，再加入11.7μL三乙胺，转移至烧瓶中，超声混合均匀。
(2)称取30mg异硫氰根罗丹明，将其溶解在6mL无水乙醇中，充分溶解后加入至(1)中的烧瓶中，室温避光搅拌24h，用旋转蒸发仪蒸干溶剂，使用1-2mL二氯甲烷:甲醇＝11:1(V/V)的混合溶液进行复溶。
(3)将玻璃层析柱固定在铁架台上，将100-200nm的硅胶装入到玻璃层析柱中，硅胶的高度占玻璃层析柱高度的一半即可，然后用循环水式多用真空泵将其抽实。取一个干净的90mm的玻璃培养皿，在其中加入少量100-200nm硅胶，将(2)中复溶的液体滴加到培养皿的硅胶上，用微量药勺将其搅拌均匀，直到硅胶变干。将其加入到装有硅胶的玻璃层析柱中，再加入少量硅胶或棉花作为保护层。使用二氯甲烷:甲醇＝11:1(V/V)的混合溶液作为洗脱剂进行洗脱，使用锥形瓶进行液体收集，真空干燥得到化合物③单罗丹明-乙二胺。
实施例4制备单罗丹明-乙二胺-己炔酸
反应式如下式所示：
具体步骤为：
(1)称取3.4mg单罗丹明-乙二胺，将其溶解在4mL水和100μL乙醇中，超声充分溶解。
(2)将0.54μL己炔酸溶解在1mL水中，加入EDC 1.78mg活化1h，再加入NHS 0.57mg活化1小时，将其加入至(1)的单罗丹明-乙二胺溶液中，室温避光搅拌24h。冷冻干燥后用1-2mL二氯甲烷:甲醇＝8:1(V/V)的混合溶液复溶。
(3)将玻璃层析柱固定在铁架台上，将100-200nm的硅胶装入到玻璃层析柱中，硅胶的高度占玻璃层析柱高度的一半即可，然后用循环水式多用真空泵将其抽实。取一个干净的90mm的玻璃培养皿，在其中加入少量100-200nm硅胶，将(2)中复溶的液体滴加到培养皿的硅胶上，用微量药勺将其搅拌均匀，直到硅胶变干。将其加入到装有硅胶的玻璃层析柱中，再加入少量硅胶或棉花作为保护层。使用二氯甲烷:甲醇＝8:1(V/V)的混合溶液作为洗脱剂进行洗脱，使用锥形瓶进行液体收集。旋蒸除去溶剂后复溶在乙醇溶液中，真空干燥得到化合物④单罗丹明-乙二胺-己炔酸。
实施例5click chemistry反应
反应式如下式所示：
具体步骤为：
(1)先配制含500μM Cu2+的五水硫酸铜溶液和20mM的抗坏血酸钠溶液，备用。
(2)将5mg单罗丹明-乙二胺-己炔酸溶于8mL水得到单罗丹明-乙二胺-己炔酸水溶液。将2.5mg单荧光素-乙二胺-叠氮丁酸中溶于8mL水得到单荧光素-乙二胺-叠氮丁酸水溶液。
(3)将4mL单罗丹明-乙二胺-己炔酸水溶液和1.9mL单荧光素-乙二胺-叠氮丁酸水溶液加入到25mL圆底烧瓶中，向圆底烧瓶中加入1.475mL叔丁醇和1.475mL无水乙醇。将圆底烧瓶放在37℃水浴中搅拌10min，再加入200μL的500μM含Cu2+的五水硫酸铜溶液，搅拌10min，加入200μL的抗坏血酸钠溶液，继续搅拌24h，反应结束，得到多荧光单元复合分子。
以上实施例描述了本发明的特殊实施例子，以便对本发明作进一步的说明，这些实施例只是说明而不表示本发明所有的可能性。本发明并不仅仅局限于这些实施例中提到的材料、反应条件或参数，任何在相关领域具备经验的人，都可以按照本专利的原理，利用其它类似材料或反应条件实现本发明所描述的制备批次间性能稳定(标准曲线重复性好)传感器的材料。这些并不脱离本发明描述的基本概念。因此，这些修改或者不同的应都在本发明的覆盖范围之内。
应当理解的是，本说明书未详细阐述的部分均属于现有技术。上述针对较佳实施例的描述较为详细，并不能因此而认为是对本发明专利保护范围的限制，本领域的普通技术人员在本发明的启示下，在不脱离本发明权利要求所保护的范围情况下，还可以做出替换或变形，均落入本发明的保护范围之内，本发明的请求保护范围应以所附权利要求为准。