专利名称：一种纳米金颗粒原位多次扩增检测生物分子的方法
技术领域：
本发明涉及一种纳米金颗粒原位多次扩增检测生物分子的方法，属于生物检测技术领域。
基因(DNA)以及蛋白分子(如配体、受体等)的高灵敏性、简单、快速的检测，对于疾病的早期、快速诊断以及在卫生检疫、环境检测等领域都具有非常重要的意义，目前较为准确灵敏的检测方法有荧光标记、放射性标记等方法，这些方法虽然较为灵敏，但是存在着标记、分离、纯化等繁琐的操作，而且需要特殊的仪器等问题，尤其对于放射性标记，还存在同位素放射性污染的问题。因此，开发一种操作简单、快捷、设备简单、灵敏的检测方法，具有非常重要的意义和广阔的开发价值。
2000年I.Willner等人在Chem.Commun.(2000，1025-1026)上发表文章，报道了一种利用石英晶体微天平(QCM)为检测仪器的DNA检测方法。具体步骤包括将巯基DNA(探针1)固定在QCM的表面；将不同浓度的待检测的cDNA与固定在QCM表面的探针1结合；用巯基DNA与固定尺寸的金颗粒(13nm)结合制成探针2，并用探针2浸泡QCM的表面，即与固定在QCM表面的cDNA结合，达到提高DNA检测灵敏度的目的。经过纳米金颗粒增强以后DNA的检测限由原来的大约10-8mol/L提高到1010mol/L。此法具有简单、快速等优点，但是检测灵敏度有待进一步提高。根据QCM的工作原理，即其频率的降低值与其表面吸附物质的质量增加值成正比，因此，在1.Willner等人报道的方法中，如果使用的纳米金颗粒的粒径愈大，那么对于提高DNA的检测灵敏度愈有利。然而纳米金颗粒的粒径愈大(一般超过30nm)，巯基DNA与纳米金颗粒杂交时愈易于聚集(J.Am.Chem.Soc.1998,120,12674-12675)，这严重制约着这种方法检测灵敏度的进一步提高。
本发明的目的是提出一种纳米金颗粒原位多次扩增检测生物分子的方法，以提高生物分子检测的灵敏度，开发一种操作简便、快速、对仪器设备要求不高的方法，广泛应用于临床诊断、卫生检疫、环境监测等领域的高灵敏性的DNA以及蛋白质分子的检测。
本发明提出的纳米金颗粒原位多次扩增检测生物分子的方法，包括以下步骤(1)将颗粒度小于30nm的金颗粒水溶液与浓度大于0.01μg/mL、pH值为5-9的巯基DNA缓冲溶液，或与浓度大于0.01μg/mL、pH值为5-9的配体分子缓冲溶液，按照金颗粒与巯基DNA或与配体分子的摩尔比为1∶1-1000的比例，在20-60℃的条件下混合，时间大于30分钟，制备成纳米金颗粒的生物探针1；(2)用与待检测的DNA分子互补的巯基DNA或配体分子制备探针2在20-60℃的条件下，用浓度大于0.1μg/mL、pH值为5-9的巯基DNA缓冲溶液，或与浓度大于0.1μg/mL的pH值为5-9的配体分子缓冲溶液，浸泡检测仪器的样品台表面，时间大于2小时，使探针2固定在检测仪器的样品台表面；
(3)用pH值为5-9的待检测的DNA分子缓冲溶液，或pH值为5-9的待检测蛋白受体分子缓冲溶液，在20-60℃的条件下，浸泡已经固定了探针2的检测仪器的样品台表面，时间大于30分钟，使待检测的DNA分子或者待检测的蛋白受体分子结合在探针2上；(4)在20-60℃的条件下，用纳米金颗粒的生物探针1浸泡检测仪器的样品台表面，时间大于30分钟，使纳米金颗粒固定在检测仪器的样品台表面；(5)配制浓度大于0.001％的氯金酸水溶液或pH值为4-9的氯金酸缓冲溶液以及浓度大于0.01mmol/L的羟胺水溶液或羟胺缓冲溶液作为扩增试剂，对固定在检测仪器的样品台表面上的纳米金颗粒进行原位多次扩增，使纳米金颗粒的尺寸增大，每次扩增时间大于0.5分钟，即可进行对生物分子的检测。
若使用的检测仪器的样品台表面为金属(如金、铂)，则在其表面固定金颗粒探针之前，需进行适当的封闭。封闭条件在温度为20-60℃的条件下，时间不少于1小时；封闭试剂的浓度大于0.01μg/mL；封闭试剂包括牛血清白蛋白、巯基乙醇～巯基十八醇、巯基乙酸～巯基十八酸、巯基乙胺～巯基十八胺、乙硫醇～十八硫醇等。
使用本发明提出的纳米金颗粒原位多次扩增检测生物分子的方法，可以显著提高DNA分子以及蛋白质受体分子的检测灵敏度，经过二次或多次扩增之后检测灵敏度提高大约5个数量级，检测限达到10-15mol/L。本发明可以广泛应用于DNA以及蛋白质分子的检测，具有、检测灵敏度高、操作简便、快速、对仪器设备要求不高等优点，可以广泛应用于临床诊断、卫生检疫、环境监测等领域，具有十分广泛的应用前景与开发价值。
下面详细介绍本发明的实施例。
实施例1(1)纳米金颗粒的生物探针1的制备用2mL、颗粒度为13nm的金颗粒水溶液与0.5mL、40μg/mL的pH值为7.0的巯基DNA-5’-HS-(CH2)6-GCGCGAACCGTATA-3的PBS缓冲溶液混合，制得金颗粒探针1；(2)探针2在检测仪器的样品台表面的固定用20μg/mL、pH值为8.0的巯基DNA:5’-TCTATCCTACGCT-(CH2)6-SH-3’(探针2)的磷酸盐(PBS)缓冲溶液，在40℃的条件下浸泡QCM的金电极表面20小时，实现探针2在检测仪器的样品台表面的固定；(3)用2mg/mL、pH值为7.0的牛血清白蛋白PBS缓冲溶液，对QCM的表面进行封闭；(4)用pH值为7.0的不同浓度的被检测的核酸分子cDNA:5’-AGCGTAGGATAGATATACGGTTCGCGC-3’的PBS缓冲溶液浸泡QCM的表面，将cDNA分子与探针2结合；(5)在30℃的条件下，用探针1浸泡QCM的表面2小时，实现金颗粒在QCM表面的固定；(6)用0.08％的氯金酸水溶液与0.06mmol/L的羟胺水溶液对固定于QCM的表面金颗粒进行二次扩增，每次扩增1分钟。实验结果如下表
10-15＜1 120 210实施例2(1)纳米金颗粒的生物探针1的制备用2mL、24nm的金颗粒水溶液与0.5mL、10μg/mL的pH值为8.5的巯基DNA:5’-HS-(CH2)6-ATGGGCCT-3’的PBS缓冲溶液混合，制得金颗粒探针1；(2)探针2在检测仪器的样品台表面的固定将20μg/mL的巯基DNA:5’-SH-(CH9)6-CAGGTTCAT-3’(探针2)，在25℃的条件下浸泡QCM的金电极表面3小时，实现探针2在检测仪器的样品台表面的固定；(3)用巯基乙醇/巯基乙胺的混合溶液，在55℃的条件下，对QCM的表面进行封闭10小时；(4)在25℃的条件下，用pH值为8.5的不同浓度被检测的cDNA:5’-ATGAACCTGAGGCCCAT-3’的PBS缓冲溶液，浸泡QCM的表面6小时；(5)在50℃的条件下用金颗粒的生物探针1浸泡QCM的表面1小时，实现金颗粒在QCM表面的固定；(6)用pH值为7.0的1％的氯金酸PBS缓冲溶液与0.1mol/L的羟胺水溶液对固定于QCM表面的金颗粒进行二次扩增，每次扩增时间2分钟。实验结果如下表
实施例3(1)纳米金颗粒的生物探针1的制备在20℃的条件下，用2mL、10nm的金颗粒水溶液与0.5mL、10μg/mL的pH值为5.5的链亲和素的PBS缓冲溶液混合24小时制得金颗粒探针1；(2)探针2在检测仪器的样品台表面的固定将80μg/mL的巯基DNA:5’-SH-(CH2)6-ATGGGCCT-3’(探针2)在20℃的条件下，浸泡QCM的表面20小时，实现探针2在检测仪器的样品台表面的固定；(3)用丁硫醇/巯基丁醇的混合溶液，在20℃的条件下对QCM的表面进行封闭6小时；(4)在20℃的条件下，用pH值为5.5的不同浓度被检测的核酸分子cDNA:5’-ATGAACCTGAGGCCCAT-3’的PBS缓冲溶液浸泡QCM的表面1小时；(5)在20℃的条件下，将50μg/mL的生物素化DNA:5’CAGGTTCAT-Biotin-3’与固定在QCM表面的cDNA混合2小时，并在20℃的条件下，用探针1浸泡QCM的表面2小时，实现金颗粒在QCM表面的固定；(6)用10％、pH值为5.5的氯金酸PBS缓冲溶液与1mol/L的羟胺水溶液对固定于QCM表面的金颗粒进行二次扩增，每次扩增时间10分钟。实验结果如下表
权利要求
1.一种纳米金颗粒原位多次扩增检测生物分子的方法，其特征在于该方法包括以下步骤(1)将颗粒度小于30nm的金颗粒水溶液与浓度大于0.01μg/mL、pH值为5-9的巯基DNA缓冲溶液，或与浓度大于0.01μg/mL、pH值为5-9的配体分子缓冲溶液，按照金颗粒与巯基DNA或与配体分子的摩尔比为1∶1-1000的比例，在20-660℃的条件下混合，时间大于30分钟，制备成纳米金颗粒的生物探针1；(2)用与待检测的DNA分子互补的巯基DNA或配体分子制备探针2在20-60℃的条件下，用浓度大于0.1μg/mL、pH值为5-9的巯基DNA缓冲溶液，或与浓度大于0.1μg/mL的pH值为5-9的配体分子缓冲溶液，浸泡检测仪器的样品台表面，时间大于2小时，使探针2固定在检测仪器的样品台表面；(3)用pH值为5-9的待检测的DNA分子缓冲溶液，或pH值为5-9的待检测蛋白受体分子缓冲溶液，在20-60℃的条件下，浸泡已经固定了探针2的检测仪器的样品台表面，时间大于30分钟，使待检测的DNA分子或者待检测的蛋白受体分子结合在探针2上；(4)在20-60℃的条件下，用纳米金颗粒的生物探针1浸泡检测仪器的样品台表面，时间大于30分钟，使纳米金颗粒固定在检测仪器的样品台表面；(5)配制浓度大于0.001％的氯金酸水溶液或pH值为4-9的氯金酸缓冲溶液以及浓度大于0.01mmol/L的羟胺水溶液或羟胺缓冲溶液作为扩增试剂，对固定在检测仪器的样品台表面上的纳米金颗粒进行原位多次扩增，使纳米金颗粒的尺寸增大，每次扩增时间大于0.5分钟，即可进行对生物分子的检测。
全文摘要
本发明涉及一种纳米金颗粒原位多次扩增检测生物分子的方法,首先制备成纳米金颗粒的生物探针1,用与待检测的DNA分子互补的巯基DNA或配体分子制备探针2,然后使待检测的DNA分子或者待检测的蛋白受体分子结合在探针2上,再使纳米金颗粒固定在检测仪器的样品台表面,最后使用扩增试剂对纳米金颗粒进行原位多次扩增,即可进行对生物分子的检测。本发明方法具有检测灵敏度高、操作简便、快速等优点。
文档编号C12Q1/68GK1321776SQ0111813
公开日2001年11月14日 申请日期2001年5月18日 优先权日2001年5月18日
发明者马占芳, 隋森芳 申请人:清华大学