TNFr与稳定性和抗聚集性增强的Fc片段融合蛋白及其制备方法与应用与流程

文档序号：14216716阅读：728来源：国知局

本发明涉及生物技术领域，具体地指一种tnfr与稳定性和抗聚集性增强的fc片段融合蛋白及其制备方法。

背景技术：

人肿瘤坏死因子(tnf-α)是一种活化的单核/巨噬细胞产生的细胞因子，并具有多种生物学效应。tnf-α能够诱导肿瘤细胞坏死或凋亡，且同时是介导炎症反应的主要细胞因子。重组人ii型肿瘤坏死因子受体-fc融合蛋白(tnfr-fc)是一种由美国fda批准的，可用于治疗如类风湿性关节炎等自身免疫疾病的蛋白药物。etanercept(enbreltm)是已经上市的商品化的tnfr-fc融合蛋白，也是抗tnf最有效的药物之一，也是生物技术药物中销售非常高的产品。中国中信国建所生产的tnfr-fc融合蛋白已生产上市，商品名为益赛普，用于治疗类风湿性关节炎、强直性脊柱炎的骨和关节损伤。

然而，这些抗体药物以及fc融合蛋白作为生物活性大分子，它也有自身的局限性，如稳定性差、抗聚集能力弱，在其表达、纯化、贮存等过程中，会倾向于聚集或者降解。而蛋白聚集所导致的免疫原性，不仅降低了药效，同时也给临床应用带来很大的风险。因此，提高抗体稳定性与抗聚集能力是该领域亟待解决的问题之一。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术中fc融合蛋白稳定性差、抗聚集能力弱的缺陷，提供一种tnfr与稳定性和抗聚集性增强的fc片段融合蛋白及其制备方法与应用，与现有tnfr-fc融合蛋白相比，它具有稳定性更好、更加抗聚集的特点，从而有助于提高tnfr-fc的药效，减少由于不稳定或者容易聚集而带来的副作用。

为实现上述目的，本发明提供了一种tnfr与稳定性和抗聚集性增强的fc片段融合蛋白，其氨基酸全长序列为seqidno.3，命名为tnfr-s23。

可选地，所述tnfr-s23的编码基因序列为seqidno.4。

本发明还提供了上述tnfr与稳定性和抗聚集性增强的fc片段融合蛋白的制备方法，其步骤如下：

(1)获取人源igg野生型fc和tnfr的基因；

(2)设计引物将野生型fc中的指定氨基酸碱基突变成编码半胱氨酸的碱基，扩增出得到突变型fc；

(3)通过搭桥pcr的方法将tnfr与突变型fc的基因进行融合得到完整的tnfr-s23基因；

(4)以tnfr-s23基因序列构建真核表达载体，转染哺乳动物细胞，进行真核表达，纯化得到目的蛋白。

本发明还揭示了上述tnfr与稳定性和抗聚集性增强的fc片段融合蛋白，在制备治疗自身免疫疾病的药剂中的应用。

本发明是通过将tnfr-fc融合蛋白的人源抗体igg的fc段的ch2和ch3结构域分别引入一对二硫键，进而提高分子的稳定性和抗聚集能力。

本发明的有益效果：

(1)相对于野生型的tnfr-fc，其稳定性更好，可降低蛋白的生产、纯化、保存成本；

(2)相对于野生型的tnfr-fc，其抗聚集能力更好，可降低因为蛋白的聚集而导致临床使用风险。

附图说明

图1为tnfr-fc、tnfr-s23蛋白的表达纯化后蛋白免疫印迹检测图。

图2为tnfr-fc、tnfr-s23蛋白的表达纯化后sds电泳图。

图3为tnfr-fc、tnfr-s23分子的存在形式分析图(单体、二聚体等)；其中a为益赛普，b为etanercept，c为tnfr-fc，d为tnfr-s23。

图4为tnfr-fc、tnfr-s23蛋白在变性剂条件下的稳定性比较图。

图5为tnfr-fc、tnfr-s23蛋白的抗聚集性比较图。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施例对本发明作进一步的详细描述。以下实施例是在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1：扩增tnfr-fc、tnfr-s23片段基因

采取人源血样，用trizolreagent(invitrogen公司)抽提细胞总rna，得到的细胞总rna溶解于50μl无rna酶的水中。然后用m-mlv逆转录酶试剂盒(promega公司)，采用随机引物，逆转录得到cdna。

根据igg的fc的基因序列(genbank:kj905798.1)，分析其氨基酸序列，设计fc基因的正、反向引物扩增目的片段：

正向引物

5-gagcccaaatctagcgacaaaactcacac-3(1)

5-acgcggcccagccggccttgcccgcccaggtggcatttac-3(2)(横线标注为sfii酶切位点)；

反向引物

5-gccctcctcgagtcatttacccggagacagggag-3(1)(横线标注为xhoi酶切位点)

5-gtcgccagtgctcccttcagctggg-3(2)

分别用正向引物(1)/(2)与反向引物(1)/(2)以cdna为模板进行pcr，得到fc和tnfr基因片段，再利用点突变试剂盒将fc片段四个氨基酸突变成半胱氨酸，得到s23基因片段。再设计搭桥pcr引物：

t-fc⁺-f正向引物

5-acgcggcccagccggccttgcccgcccaggtggcatttac-3

t-fc^--r反向引物

5-gccctcctcgagtcatttacccggagacagggag-3

t-fc^--f正向引物

5-caaaactcacacatccccaccgtccccagcacctgaac-3

t-fc⁺-r反向引物

5-gttcaggtgctggggacggtggggatgtgtgagttttg-3

分别将tnfr和fc/s23进行搭桥pcr，得到tnfr-fc和tnfr-s23基因。

琼脂糖凝胶电泳回收tnfr-fc、tnfr-s23基因片段，用sfii和xhoi酶切tnfr-fc、tnfr-s23基因和载体psectag2a，胶回收后将tnfr-fc、tnfr-s23基因与载体psectag2a连接、转化e.colitop10感受态，随后挑取单克隆送测序。根据测序结果，挑取序列正确的单克隆用于后续实验。

tnfr-fc的基因序列为：seqidno.2，其编码的氨基酸序列为seqidno.1。

tnfr-s23的基因序列为：seqidno.4，其编码的氨基酸序列为seqidno.3。

实施例2：表达并纯化tnfr-fc、tnfr-s23

将tnfr-fc、tnfr-s23质粒各40ug利用pei(2mg/mlpei)(polyethylenimine“max”,(mw40,000)-highpotencylinearpei,polysciences,inc.,catalogno.:24765-2,2g)转染293f细胞，分别用293f表达培养基(invitrogen)40ml于37℃、150rpm摇床培养6天。

随后，离心(6000g，4℃，15min)收集293f细胞上清(上清以鼠抗人iggfc为第一抗体、hrp标记的羊抗鼠igg为第二抗体进行蛋白免疫印迹检测，结果如图1所示，泳道1：marker；泳道2：tnfr-fc细胞上清；泳道3：tnfr-s23细胞上清)，将收集的上清过滤后，用proteing填料(ge公司)纯化tnfr-fc、tnfr-s23蛋白。随后用截留分子量为10kd的超滤离心管(merckmillipore公司)超滤浓缩该目的蛋白，经sds-page验证其纯度，如图2所示，泳道2为tnfr-fc、泳道3为tnfr-s23。

实施例3：tnfr-fc、tnfr-s23分子构象与存在形式(单体、二聚体等)

akta分析tnfr-fc、tnfr-s23存在形式：将纯化后的tnfr-fc、tnfr-s23蛋白浓缩到1mg/ml，pbs(ph7.4)为洗脱缓冲液，过columnsuperdex200increase10/300gl，其中，流速为0.5ml/min，进而对其存在形式进行检测。同时将1mg/ml的etanercept和益赛普蛋白也同样过columnsuperdex200increase10/300gl分子筛，比较蛋白存在形式。

结果如图3所示，益赛普(a)、etanercept(b)、tnfr-fc(c)、tnfr-s23(d)，对照标准曲线可以发现，tnfr-fc(c)、tnfr-s23(d)蛋白分子量约为140kda，结果表明它们以二聚体形式存在，对比etanercept和益赛普蛋白分子筛图，tnfr-s23出现的峰更为单一，说明蛋白存在性状更单一稳定。

实施例4：tnfr-fc、tnfr-s23稳定性与抗聚集性比较

变性剂条件下稳定性分析：配置浓度为0m到10m的尿素溶液，浓度梯度为0.5m，共21个样品；然后将tnfr-fc、tnfr-s23蛋白加入不同浓度梯度的尿素溶液中室温过夜处理，体积为200ul，tnfr-fc、tnfr-s23蛋白终浓度均为100ug/ml。随后，用荧光检测仪器在280nm激发，340nm处检测各个样品荧光强度，结果如图4所示，比较tnfr-fc、tnfr-s23蛋白的稳定性，从图中可以发现相比tnfr-fc，tnfr-s23的荧光信号下降趋势更缓慢，表明tnfr-s23在变性剂条件下更加稳定。

抗聚集性分析：将tnfr-fc、tnfr-s23蛋白终浓度调整为1mg/ml，在60℃水浴锅处理，每隔一定时间取样，在λ＝320nm处检测吸光度并记录数据，其中，pbs溶液为空白对照，比较tnfr-fc，tnfr-s23蛋白的抗聚集性强弱，从图5中可以发现tnfr-s23信号上升趋势较缓，表明其抗聚集能力更好。

序列表

<110>武汉班科生物技术股份有限公司

<120>tnfr与稳定性和抗聚集性增强的fc片段融合蛋白及其制备方法与应用

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>466

<212>prt

<213>tnfr-fc

<400>1

leuproalaglnvalalaphethrprotyralaprogluproglyser

151015

thrcysargleuargglutyrtyraspglnthralaglnmetcyscys

202530

serlyscysserproglyglnhisalalysvalphecysthrlysthr

354045

seraspthrvalcysaspsercysgluaspserthrtyrthrglnleu

505560

trpasntrpvalproglucysleusercysglyserargcysserser

65707580

aspglnvalgluthrglnalacysthrarggluglnasnargilecys

859095

thrcysargproglytrptyrcysalaleuserlysglngluglycys

100105110

argleucysalaproleuarglyscysargproglypheglyvalala

115120125

argproglythrgluthrseraspvalvalcyslysprocysalapro

130135140

glythrpheserasnthrthrserserthraspilecysargprohis

145150155160

glnilecysasnvalvalalaileproglyasnalasermetaspala

165170175

valcysthrserthrserprothrargsermetalaproglyalaval

180185190

hisleuproglnprovalserthrargserglnhisthrglnprothr

195200205

progluproserthralaproserthrserpheleuleuprometgly

210215220

proserproproalagluglyserthrglyaspgluprolyssercys

225230235240

asplysthrhisthrcysproprocysalaprogluleuleuglygly

245250255

proservalpheleupheproprolysprolysaspthrleumetile

260265270

serargthrprogluvalthrcysvalvalvalaspvalserhisglu

275280285

aspprogluvallyspheasntrptyrvalaspglyvalgluvalhis

290295300

asnalalysthrlysproargglugluglntyrasnserthrtyrarg

305310315320

valvalservalleuthrvalleuhisglnasptrpleuasnglylys

325330335

glutyrlyscyslysvalserasnlysalaleuproalaproileglu

340345350

lysthrileserlysalalysglyglnproarggluproglnvaltyr

355360365

thrleuproproserargaspgluleuthrlysasnglnvalserleu

370375380

thrcysleuvallysglyphetyrproseraspilealavalglutrp

385390395400

gluserasnglyglnprogluasnasntyrlysthrthrproproval

405410415

leuaspseraspglyserphepheleutyrserlysleuthrvalasp

420425430

lysserargtrpglnglnglyasnvalphesercysservalmethis

435440445

glualaleuhisasnhistyrthrglnlysserleuserleuserpro

450455460

glylys

465

<210>2

<211>1401

<212>dna

<213>tnfr-fc

<400>2

ttgcccgcccaggtggcatttacaccctacgccccggagcccgggagcacatgccggctc60

agagaatactatgaccagacagctcagatgtgctgcagcaaatgctcgccgggccaacat120

gcaaaagtcttctgtaccaagacctcggacaccgtgtgtgactcctgtgaggacagcaca180

tacacccagctctggaactgggttcccgagtgcttgagctgtggctcccgctgtagctct240

gaccaggtggaaactcaagcctgcactcgggaacagaaccgcatctgcacctgcaggccc300

ggctggtactgcgcgctgagcaagcaggaggggtgccggctgtgcgcgccgctgcgcaag360

tgccgcccgggcttcggcgtggccagaccaggaactgaaacatcagacgtggtgtgcaag420

ccctgtgccccggggacgttctccaacacgacttcatccacggatatttgcaggccccac480

cagatctgtaacgtggtggccatccctgggaatgcaagcatggatgcagtctgcacgtcc540

acgtcccccacccggagtatggccccaggggcagtacacttaccccagccagtgtccaca600

cgatcccaacacacgcagccaactccagaacccagcactgctccaagcacctccttcctg660

ctcccaatgggccccagccccccagctgaagggagcactggcgacgagcccaaatcttgt720

gacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtc780

ttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcaca840

tgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggac900

ggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtac960

cgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaag1020

tgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaa1080

gggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaag1140

aaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggag1200

tgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactcc1260

gacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcagggg1320

aacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagc1380

ctctccctgtctccgggtaaa1401

<210>3