利用甜菊苷从葡萄藤的组织的细胞培养中大量生产葡萄素的方法与流程

本发明涉及利用甜菊苷从葡萄藤的组织的细胞培养中大量生产葡萄素的方法。

背景技术：

主要以白藜芦醇化合物来显示的二苯乙烯是来自由苯基丙氨酸开始的普通苯丙烷途径的一小类植物的次级代谢产物。白藜芦醇(resveratrol；3，4'，5-transtrihydroxystilbene)是如葡萄、花生及莓类等的一部分植物在应对如紫外线照射或真菌感染等的环境压力时产生的一种自然产生的植物抗毒素(phytoalexin)。白藜芦醇及其衍生物不仅在植物防御反应中作为植物抗毒素及抗氧化物质起到重要作用，而且具有多种有益特性，如抗癌效果、抗炎效果、抗肿瘤活性及抗衰老效果等。

然而，像这样，具有如抗癌、抗氧化活性等的效果的白藜芦醇是已被确定其潜力的有前途的天然功能性资源，今后可通过多种研究用作功能性食品原料及新药原料来所使用，但是，目前将韩国国内的葡萄品种作为对象，用于增加该物质的含量的培养生理学及生物技术方面的研究极少。在这方面，作为增加白藜芦醇的含量的方法，最近揭示了在已收获的葡萄上人工接种霜霉病(plasmoparaviticola)菌株的方法(韩国公开专利第2003-21976号)、在已收获的葡萄上进行短波紫外线处理的方法(j.argicfoodchem.2002oct23；50(22)：6322-9；w00200192)或用铝处理葡萄的方法(us6834398)等，但这些都是收获葡萄后的处理方法或者栽培葡萄时的简单处理方法。

在韩国公开专利第2005-0089492号中公开了“使用环境因子生产高含量白藜芦醇的葡萄的方法”，在韩国公开专利第2003-0021976号中公开了“使来自葡萄的天然抗癌物质的白藜芦醇的含量得到增大的白藜芦醇强化葡萄及其生产方法”，但如本发明所述，目前还没有公开“利用甜菊苷从葡萄藤的组织的细胞培养中大量生产葡萄素的方法”。

技术实现要素：

技术问题

本发明是根据如上所述的要求而提出的，本发明人为了构筑从来自葡萄植物的花药组织的愈伤组织中大量生产有用物质(二苯乙烯化合物)，将葡萄藤的花药组织切片移植到添加有植物生长调节物质的ms固体培养基中之后进行培养并对愈伤组织进行诱导，并且在增殖培养基中对经过诱导的上述愈伤组织进行培养来使之增殖后，在包含茉莉酮酸甲酯作为活性诱导剂、包含甜菊苷作为助溶剂的液体培养基中对经过增殖的上述愈伤组织进行振荡培养，结果确认出：在烧瓶条件下没有产生白藜芦醇，仅产生了δ-葡萄素(δ-viniferin)(图3)，在满足扩大(scale-up)条件的生物反应器的条件下确认出：不仅对δ-葡萄素有效果而且对昂贵的ε-葡萄素的生产非常有效(图5)。

并且，在经过增殖的上述愈伤组织培养的培养基中处理活性诱导剂及助溶剂(甜菊苷)之后，在烧瓶条件下进行静置培养之后，结果确认出：仅生产白藜芦醇而不生产葡萄素(图6a)，在进行振荡培养之后确认出：仅生产葡萄素而不生产白藜芦醇(图6b)。

通过本发明确认出：可以大量生产二苯乙烯，尤其，通过本发明的将甜菊苷用作助溶剂使用的来自葡萄藤的组织的愈伤组织的培养方法，不仅对δ-葡萄素的生产有效而且对昂贵的ε-葡萄素的生产非常有效，从而完成了本发明。

解决问题的手段

为了解决上述技术问题，本发明提供从葡萄藤中大量生产葡萄素的方法，包括：步骤(a)，将葡萄藤的组织切片移植到愈伤组织诱导培养基中来对葡萄藤的愈伤组织进行诱导；步骤(b)，在增殖培养基中对经过诱导的上述葡萄藤的愈伤组织进行培养来使之增殖；以及步骤(c)，在经过增殖的上述愈伤组织中添加活性诱导剂及助溶剂来进行振荡培养。

并且，本发明提供从葡萄藤的愈伤组织中大量生产葡萄素的组合物，包含茉莉酮酸甲酯(meja)及甜菊苷(stevioside)作为有效成分。

并且，本发明提供从葡萄藤中大量生产白藜芦醇(resveratrol)的方法，包括：步骤(a)，将葡萄藤的组织切片移植到愈伤组织诱导培养基中来对葡萄藤的愈伤组织进行诱导；步骤(b)，在增殖培养基中对经过诱导的上述葡萄藤的愈伤组织进行培养来使之增殖；以及步骤(c)，在经过增殖的上述愈伤组织中添加茉莉酮酸甲酯及甜菊苷来进行静置培养。

发明的效果

在本发明中，二苯乙烯具有如抗癌、抗病毒，抗炎、抗老化、抗氧化等的多种生理活性，因此用于保健功能食品、化妆品、药品、燃料及功能性牲畜饲料等，尤其在葡萄素的情况下，对肝脏保护、抗癌、抗氧化及皮肤的美白有效，而且对阻碍低密度脂蛋白和高密度脂蛋白的氧化和血管平滑肌细胞的增殖和迁移有效。因此，本发明有效用于从来自葡萄植物的花药组织的愈伤组织中大量生产有用物质(二苯乙烯化合物)，尤其是葡萄素的方法，这对相关产业非常重要。

附图说明

图1为示出本发明的二苯乙烯类化合物的生成过程的图。从如酪氨酸、苯基丙氨酸等的氨基酸中产生对香豆酸(p-coumaricacid)，由4-香豆酸辅酶a连接酶(4-coumarate：coaligase，4cl)产生香豆酰辅酶a。再次，将此用类固醇硫酸酯酶(steroidsulfatase，sts)转化为白藜芦醇并通过氧化酶发生氧化，进而两种白藜芦醇变成一种二聚体葡萄素。

图2为示出经过葡萄的愈伤组织的细胞培养及活性诱导剂的处理的白藜芦醇生物合成的基因(sts、romt)的转录表达的分析结果的图。此时所使用的活性诱导剂为茉莉酸甲酯(methyljasmonate，meja)、脱落酸(abscisicacid，aba)、水杨酸(salicylicacid，sa)、乙烯利、鞭毛蛋白22(flg22)、甲基紫精(methylviologen，mv)及壳聚糖。

图3为示出为了比较当通过植物液体培养来大量生产有用代谢物时用作助溶剂来使用的甲基环糊精(methyl-beta-cyclodextrin，cd-m)和甜菊苷的增容性以及物质生产效率，而在葡萄的愈伤组织的培养液中放入100μm的meja和50mm的cd-m(mj+cd)或者100μm的meja和50mm的甜菊苷(mj+stevioside)并进行培养之后提取白藜芦醇及δ-葡萄素来进行高效液相色谱法(highperformanceliquidchromatography，hplc)分析的结果的图。并且，仅使用100μm的meja(mj)作为对照区，而未使用助溶剂。

图4为示出在葡萄的愈伤组织的培养液中进行100μm的meja和50mm的cd-m的处理(a)或100μm的meja和50mm的甜菊苷(e95)的处理(b)之后，将对香豆酸(p-cou)及白藜芦醇(res)作为前体来确认根据助溶剂处理的生物转化差异的结果的图。

图5为示出进行大量培养(生物反应器条件)并在其培养液中放入100μm的meja及50mm的甜菊苷并进行培养之后，提取培养液并用高效液相色谱法分析确认δ-葡萄素及ε-葡萄素的产生的结果的图。

图6为示出用高效液相色谱法来确认通过本发明开发的白藜芦醇及δ-葡萄素的选择性生产方法来所生产的白藜芦醇(a)及δ-葡萄素(b)的生产结果的图。

具体实施方式

为了达到本发明的目的，本发明提供从葡萄藤中大量生产葡萄素的方法，包括：步骤(a)，将葡萄藤的组织切片移植到愈伤组织诱导培养基中来对葡萄藤的愈伤组织进行诱导；步骤(b)，在增殖培养基中对经过诱导的上述葡萄藤的愈伤组织进行培养来使之增殖；以及步骤(c)，在经过增殖的上述愈伤组织中添加活性诱导剂及助溶剂来进行培养。

在本发明的一实施例的方法中，上述步骤(c)的活性诱导剂可以为茉莉酮酸甲酯、水杨酸或鞭毛蛋白22，更优选地，可以为茉莉酮酸甲酯，但不仅局限于此。助溶剂可以为甜菊苷，但不仅局限于此。优选地，上述茉莉酮酸甲酯及甜菊苷可分别以50～350μm及40～60mm的浓度来添加，更优选地，可分别以100μm及50mm的浓度来添加，但不仅局限于此。

在本发明的一实施例的方法中，上述葡萄素可以为δ-葡萄素或ε-葡萄素，但不仅局限于此。

在本发明的一实施例的方法中，上述步骤(a)的愈伤组织诱导培养基可以为添加有用作生长调节剂来使用的0.05～0.2mg/l的吲哚-3-乙酸(indole-3-aceticacid，iaa)、0.05～0.2mg/l的1-萘乙酸钠(1-naphthaleneaceticacid，naa)、1～2mg/l的2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-dichlorophenoxyaceticacid，2，4-d)及0.2～0.3mg/l的激动素的培养基，优选地，可以为添加有0.1mg/l的iaa(indole-3-aceticacid)、0.1mg/l的naa(1-naphthaleneaceticacid)、1.5mg/l的2，4-d及0.25mg/l的激动素的培养基(表1)，但不仅局限于此。

在本发明的一实施例的方法中，上述步骤(b)的增殖培养基可以为包含0.5～2.0mg/l的2，4-d的ms(murashige&skoog)培养基，优选地，可以为包含1mg/l的2，4-d的ms培养基，但不仅局限于此。

优选地，本发明的一实施例的方法可以包括：步骤(a)，将经过灭菌的葡萄藤的组织切片移植到添加有用作生长调节剂来使用的0.05～0.2mg/l的iaa(indole-3-aceticacid)、0.05～0.2mg/l的naa(1-naphthaleneaceticacid)、1～2mg/l的2，4-d及0.2～0.3mg/l的激动素的愈伤组织诱导培养基中并对葡萄藤的愈伤组织进行诱导；步骤(b)，在包含0.5～2.0mg/l的2，4-d的ms培养基中对经过诱导的上述葡萄藤的愈伤组织进行培养使之增殖；以及步骤(c)，在经过增殖的上述愈伤组织中添加50～350μm的茉莉酮酸甲酯及40～60mm的甜菊苷来进行振荡培养，来大量生产δ-葡萄素或ε-葡萄素，更优选地，可以包括：步骤(a)，将经过灭菌的葡萄藤的组织切片移植到添加有用作生长调节剂来使用的0.05～0.2mg/l的iaa(indole-3-aceticacid)、0.05～0.2mg/l的naa(1-naphthaleneaceticacid)、1～2mg/l的2，4-d及0.2～0.3mg/l的激动素的愈伤组织诱导培养基中并在23～27℃条件下进行转种25～30天，来对葡萄藤的愈伤组织进行诱导；步骤(b)，在包含0.5～2.0mg/l的2，4-d的ms培养基中在23～27℃条件下对经过诱导的上述葡萄藤的愈伤组织进行培养5～10天使之增殖；以及步骤(c)，在经过增殖的上述愈伤组织中添加100μm的茉莉酮酸甲酯及50mm的甜菊苷并进行振荡培养，来大量生产δ-葡萄素或ε-葡萄素，但不仅局限于此。

并且，本发明提供从葡萄藤的愈伤组织中大量生产葡萄素的组合物，包含茉莉酮酸甲酯及甜菊苷作为有效成分。

在本发明的一实施例的组合物中，优选地，可分别以50～350μm及40～60mm的浓度来添加上述茉莉酮酸甲酯及甜菊苷，更优选地，可分别以100μm及50mm的浓度来添加，但不仅局限于此。

在本发明的一实施例的组合物中，上述葡萄素可以为δ-葡萄素或ε-葡萄素，但不仅局限于此。

并且，本发明提供从葡萄藤中大量生产白藜芦醇的方法，包括：步骤(a)，将葡萄藤的组织切片移植到愈伤组织诱导培养基中来对葡萄藤的愈伤组织进行诱导；步骤(b)，在增殖培养基中对经过诱导的上述葡萄藤的愈伤组织进行培养来使之增殖；以及步骤(c)，在经过增殖的上述愈伤组织中添加茉莉酮酸甲酯及甜菊苷来进行静置培养。

本发明的一实施例的方法可以包括：步骤(a)，将经过灭菌的葡萄藤的组织切片移植到添加有用作生长调节剂来使用的0.05～0.2mg/l的iaa(indole-3-aceticacid)、0.05～0.2mg/l的naa(1-naphthaleneaceticacid)、1～2mg/l的2，4-d及0.2～0.3mg/l的激动素的愈伤组织诱导培养基中来对葡萄藤的愈伤组织进行诱导；步骤(b)，在包含0.5～2.0mg/l的2，4-d的ms培养基中对经过诱导的上述葡萄藤的愈伤组织进行培养使之增殖；以及步骤(c)在经过增殖的上述愈伤组织中添加50～350μm的茉莉酮酸甲酯及40～60mm的甜菊苷来进行静置培养，但不仅局限于此。

在本发明的一实施例的方法中，上述静置培养可以在24～26℃条件下进行4～7天，优选地，在25℃条件下进行5天，但不仅局限于此。

以下，对本发明的实施例进行详细的说明。然而，以下实施例只是说明本发明，本发明的内容并不局限于以下实施例。

实施例1.葡萄的愈伤组织的诱导及增殖

在本发明中，愈伤组织是由代表性的商业用葡萄品种的坎贝尔(vitisviniferal.cvcampbellearly)中诱导的。在切开坎贝尔花并用流水清洗之后，在70％的乙醇溶液中浸渍一分钟来进行表面灭菌。在进行表面灭菌时，在无菌工作台内将葡萄花组织放置于玻璃瓶中，之后用商业用漂白水(约1％的sodiumhypochlorite)溶液处理了15分钟，并用灭菌蒸馏水清洗3次。对于完成表面灭菌的组织，利用灭菌滤纸去除多余水分之后用于培养中。用手术刀切开完成表面灭菌的葡萄组织之后，将各个组织移植到(花瓣、花药、手术台)培养基中。表1中表示了用于诱导葡萄的愈伤组织的培养基，并且使用了添加有用作生长调节剂来使用的0.1mg/l的iaa、0.1mg/l的naa、1.5mg/l的2，4-d及0.25mg/l的激动素的培养基。关于培养条件，在25℃的恒温条件下进行了暗培养。对于进行培养后形成的白色愈伤组织，以约4周的间隔在相同组成的固体培养基中进行转种。

表1

实施例2.经过葡萄的愈伤组织的细胞培养及活性诱导剂处理的白藜芦醇生物合成的基因(sts、romt)的转录表达分析

为了从葡萄的愈伤组织中建立白藜芦醇的生产系统，而通过上述实施例1中的诱导来得到稳定的葡萄的愈伤组织的液体培养，来进行转录表达分析。在属于包含1mg/l的2，4-d的ms培养基的ms1d(4.4g的ms、30g的蔗糖、0.5g的mes、0.1g的肌醇、0.4mg的盐酸硫胺素、1mg/l的2，4-d)液体培养基上在25℃温度下、在90rpm条件下培养7天后，处理了活性诱导剂，之后从经过24小时后的葡萄的愈伤组织中分离出总rna(kimcyetal.2010，physiologiaplantarum139:259～261)。对于被分离的总rna(5μg)，按照说明书，利用first-strandcdnasynthesiskit(fermantas，canada)来进行了cdna的合成。将经过合成的cdna(20μl)稀释2.5倍之后，以2μl为模板从葡萄的愈伤组织中对白藜芦醇及紫檀芪的生物合成相关的基因进行了rt-pcr。对于pcr扩增，通过在94℃温度下进行2分钟的变性处理、在95℃温度下进行30秒钟、在50℃温度下进行40秒钟、在72℃温度下1分钟作为一个循环进行25次循环及在72℃温度下进行10分钟的最终延伸反应来执行。在本发明的实验中所使用的葡萄的白藜芦醇、紫檀芪生物合成的基因及葡萄actin的rt-pcr引物如下：sts-f:5'-atggcttcagttgaggaaatcaga-3'(序列号1)、sts-r:5'-ttaatttgtcaccataggaatgcta-3'(序列号2)、romt-f:5'-atggatttggcaaacggtgtga-3'(序列号3)、romt-r:5'-tcaaggataaacctcaatgaggga-3'(序列号4)、actin-f:5'-tgctgacagaatgagcaagg-3'(序列号5)、actin-r:5'-tactaagaagctttcaacccagtata-3'(序列号6)。通过处理多种活性诱导剂来促进了二苯乙烯化合物的生产增加，此时所使用的活性诱导剂为meja(methyljasmonate)、aba(abscisicacid)、sa(salicylicacid)、乙烯利、鞭毛蛋白22(flg22)、mv(methylviologen)、壳聚糖。其结果，确认出：当处理meja、sa、flg22时两种基因的表达增加，其中，当处理meja时，基因的表达最高(图2)。

实施例3.葡萄的愈伤组织中的活性诱导剂及助溶剂的处理

利用上述实施例2中选择的活性诱导剂(100μm的meja)对二苯乙烯化合物的生产进行了诱导。在20ml的ms培养基中接种2g的葡萄的愈伤组织后，在125ml的烧瓶中培养7天后，处理100μm的meja，5天后获得葡萄愈伤组织。提取后进行了高效液相色谱法分析的结果，在葡萄的愈伤组织内中确认了微量的云杉新甙(piceid)(数据未显示)，并且对通过甜菊苷处理来生产的二苯乙烯化合物进行增容性处理来进行了提高生产率的实验。如上所述，在葡萄的愈伤组织培养7天的培养液中按照浓度处理5mm、10mm、25mm、50mm的甜菊苷，或者与100μm的meja一起按照浓度进行了处理之后，在培养第五天将试料用过滤网进行过滤来分离出愈伤组织和愈伤组织的培养液。用过滤网过滤分离的愈伤组织并进行脱水处理，并用液氮冷冻后，将其保存在-80℃直至提取。愈伤组织的培养液的试料直接提取使用无需贮存期。

其结果，确认出甜菊苷在50mm的浓度下最稳定地生产二苯乙烯化合物。并且，为了分析在植物组织或细胞培养时用作助溶剂来所使用的甲基环糊精(methyl-beta-cyclodextrin，cd-m)及甜菊苷的增容性及二苯乙烯化合物的生产效率，而与100μm的meja一起处理50mm的各个助溶剂后，提取培养液并确认了二苯乙烯化合物的生产倾向。其结果，在处理100μm的meja和50mm的cd-m的情况下，反式白藜芦醇的生产最多，在处理100μm的meja和50mm的甜菊苷的情况下，生产δ-葡萄素的二苯乙烯化合物占据了大部分。在100μm的meja和50mm的cd-m的处理区中，生产了高达40mg/l的白藜芦醇，在100μm的meja和50mm的甜菊苷的处理区中，生产了高达700mg/l的δ-葡萄素(图3)。

实施例4.葡萄的愈伤组织中的生物转化

以上述实施例3中实施的结果为基础，在进行葡萄的愈伤组织的悬浮培养时，将对香豆酸及白藜芦醇用作基质企图生物转化。首先，将在100μm的meja和50mm的cd-m上未放入基质的部分作为对照区，将2mm的对香豆酸及白藜芦醇用基质来处理的部分作为实验区，并确认其图案(图4a)。其结果，在放入基质的情况下，除白藜芦醇之外生产了二苯乙烯二聚体(pallidol)、parthenocissina、quadrangularina及δ-葡萄素(图4a)。但是，将在100μm的meja和50mm的甜菊苷(e95)中未放入基质的部分作为对照区，并且将2mm的对香豆酸及白藜芦醇用基质处理的部分作为实验区之后，确认了其图案(图4b)。其结果，确认出：与未处理基质的对照区相同，在处理了基质的实验区中大量生产出δ-葡萄素。以此结果为基础，确认出：在进行葡萄的愈伤组织的悬浮培养时，若将对甜菊苷用作助溶剂来使用，则对于δ-葡萄素的生产非常有效(图4)。

实施例5.利用生物反应器的葡萄的愈伤组织的大量培养中的活性诱导剂及助溶剂的处理

将上述实施例1中得到稳定的葡萄愈伤组织放入100ml的ms1d液体培养基之后，分别接种在每10g的3个烧瓶中之后，在25℃温度、在90rpm条件下培养14天。对经过14天的培养后得到增殖的愈伤组织预先进行灭菌处理，并均加入到干燥的3l的生物反应器中之后，添加了1.2l的ms1d液体培养基。如上述实施例3所述，与100μm的meja一起处理了50mm的甜菊苷，之后用过滤网过滤经过5天的培养的试料，来分离出愈伤组织和愈伤组织的培养液。用过滤网过滤分离的愈伤组织后进行了脱水处理，并利用液氮冷冻后，将其保存在-80℃直至提取。而且直接提取并使用愈伤组织的培养液的试料，无需贮存期。用高效液相色谱法分析愈伤组织的培养液的提取物的结果，确认出可以生产ε-葡萄素及δ-葡萄素(图5)。

实施例6.葡萄的愈伤组织的培养液的提取及高效液相色谱法分析

利用液氮对上述实施例3、实施例4及实施例5中分离的葡萄的愈伤组织进行粉末化处理。用3ml的80％的甲醇提取1g的上述愈伤组织的粉末后，利用离心获得上层部的愈伤组织的提取物。注入空气(air)来对经过提取的滤液进行干燥，并且将干燥物溶解于600μl的80％的甲醇中，用0.2μm的ptfe来进行过滤(hydrophilic，advantec，日本)，来使用于高效液相色谱法分析。10ml的愈伤组织的培养液通过向用相同量的乙酸乙酯来分配并提取水和乙酸乙酯来获得的乙酸乙酯层注入空气来进行了干燥处理。将干燥物溶解于1ml的80％的甲醇中，并用0.2μm的ptfe进行过滤来使用于高效液相色谱法分析。用agilenttechnology1200series进行了hplc的分析。泵系统使用了4个溶剂泵(quaternarypump)，柱使用了agilent公司的zorbaxsb-18(5mm，4.6×150mm)，对流动相利用水(a，0.05％的三氟乙酸)和乙腈(b，0.05％的三氟乙酸)、利用梯度洗脱原理进行了分析。在经过7天培养的上述葡萄的愈伤组织的培养液中，按浓度处理100μm的meja和5mm、10mm、25mm、50mm的甜菊苷的结果，确认出：在从低浓度到高浓度的顺序处理甜菊苷时，浓度越高二苯乙烯的含量逐渐增加，在50mm的条件下二苯乙烯化合物的含量最高(数据未图示)，并观察出与未处理甜菊苷的处理区相比，二苯乙烯化合物的含量显著增加(图3)。在未处理甜菊苷的处理区及愈伤组织的提取物中不能确认二苯乙烯化合物。

实施例7.葡萄的愈伤组织生产葡萄素分离及nmr分析

将由上述实施例3中制备的助溶剂处理的来自葡萄的花药的愈伤组织的培养液用水和乙酸乙酯进行分配并提取，来获得乙酸乙酯层，并对上述乙酸乙酯层进行了减压浓缩。利用mplc装置、利用反相柱(10×30cm)对获得的浓缩物(15g)进行了第一步分离。此时，洗脱溶剂使用了水和乙腈的混合溶液，使水和乙腈的混合溶液的极性从100:1降低至100％的乙腈，来进行洗脱，从而获得了7种分划物(a-g)。对包含大量目标化合物的δ-葡萄素(trans-δ-viniferin，以下化学式1)的分划c进行浓缩，获得1.3g的浓缩物。利用recylcinglc装置，在水和乙腈(2:2)的混合溶剂的条件下对获得的1.3g的浓缩物进行反相色谱法，获得具有80％以上纯度的160mg的δ-葡萄素。并进行用95％的甲醇对获得的分划物进行洗脱处理的凝胶色谱法(sephadexlh-20)，来获得了具有98％的纯度的12mg的δ-葡萄素。获得的化合物的结构通过¹h-nmr、¹³c-nmr、2d-nmr、dept及质谱鉴定。

trans-δ-viniferin:¹hnmr(500mhz，acetone-d6)d7.45(dd，j＝8.5，2.0hz，h-6)，7.27(s，h-4)，7.25(d，j＝8.5hz，h-2，6a)，7.07(d，j＝16.5hz，h-2')，6.92(d，j＝16.5hz，h-1')，6.88(d，j＝8.1hz，h-7)，6.86(d，j＝8.5hz，h-3，5a)，6.55(d，j＝2.0hz，h-2，6c)，6.29(t，j＝2.0hz，h-2b)，6.27(t，j＝2.0hz，h-4c)，6.21(d，j＝2.0，h-4，6b)，5.47(d，j＝8.0hz，h-2)，4.48(d，j＝8.0hz，h-3)；¹³cnmr(125mhz，acetone-d6)d159.7(c-7a)，158.8(c-1，3b)，158.6(c-3，5c)，157.5(c-4a)，144.3(c-5b)，139.8(c-1c)，131.6(c-3a)，131.2(c-1a)，130.8(c-5)，128.2(c-2')，127.7(c-6)，127.6(c-2，6a)，126.3(c-1')，123.0(c-4)，115.2(c-3，5a)，109.2(c-7)，106.4(c-4，6b)，104.7(c-2，6c)，101.8(c-4c)，101.4(c-2b)，93.1(c-2)，56.9(c-3)。

化学式1

实施例8.葡萄的愈伤组织生产ε-葡萄素分离及nmr分析

将由上述实施例5中制备的助溶剂处理的来自葡萄的花药的愈伤组织培养液用水和乙酸乙酯分配并提取，来获得乙酸乙酯层，并对上述乙酸乙酯层进行了减压浓缩。利用mplc装置、利用反相柱(10×30cm)对获得的浓缩物(10g)进行了第一步分离。此时，洗脱溶剂使用了水和乙腈的混合溶液，使水和乙腈的混合溶液的极性从70:1降低至100％的乙腈，来进行洗脱，从而获得了5种分划物(a-e)。对包含大量目标化合物ε-葡萄素(trans-ε-viniferin，以下化学式2)的分划b进行浓缩，获得1.5g的浓缩物。利用recylcinglc装置，在水和乙腈(2:1)的混合溶剂的条件下对获得的1.5g的浓缩物进行反相色谱法，获得具有85％以上纯度的100mg的ε-葡萄素。并进行用95％的甲醇对获得的分划物进行洗脱处理的凝胶色谱法(sephadexlh-20)，来获得了具有98％的纯度的30mg的ε-葡萄素。获得的化合物的结构通过¹h-nmr、¹³c-nmr、2d-nmr、dept及质谱鉴定。

trans-ε-viniferin¹h-nmr(400mhz，meod)d7.14(2h，d，j＝8.0hz，h-2(6)a)，7.03(2h，d，j＝8.0hz，h-2(6)b)，6.80(1h，d，j＝13.6hz，h-7b)，6.78(2h，d，j＝8.0hz，h-3(5)a)，6.65(2h，d，j＝8.0hz，h-3(5)b)，6.56(1h，d，j＝13.6hz)，6.28(1h，brs，h-12b)，6.21(1h，brs，h-12a)，6.18(2h，brs，h-10a，14a)，5.37(1h，d，j＝8.0hz，h-7a)，4.35(1h，d，j＝4.0hz，h-8a)；¹³c-nmr(100mhz，meod)d161.3(c-11b)，158.6(c-11a，13a)，158.3(c-13b)，157.1(c-4a)，156.9(c-4b)，146.0(c-9a)，135.6(c-9b)，132.5(c-1a)，129.1(c-1b，7b)，127.5(c-2(6)b)，127.0(c-2(6)a)，122.4(c-8b)，118.8(c-10b)，115.1(c-3(5)b)，115.1(c-3(5)a)，106.3(c-14a，10a)，103.1(c-14b)，101.0(c-12a)，95.6(c-12b)，93.5(c-7a)，56.9(c-8a)。

化学式2

实施例9.白藜芦醇及δ-葡萄素(δ-viniferin)的选择性生产技术开发

为了从上述实施例1中诱导的葡萄的愈伤组织中主要分别生产白藜芦醇及δ-葡萄素，而在不同的条件下诱导了物质生产。在包含1mg/l的2，4-d的100ml的ms培养基中接种10g的葡萄的愈伤组织之后，在25℃温度下、在90rpm条件下培养了6天。将此每分成25ml之后在相同条件下培养24小时之后，分别处理100μm的meja及50mm的甜菊苷，并在25℃温度下进行静置培养或者在90rpm条件下分成两个组进行培养5天。之后，利用上述实施例6中实施的方法来提取物质之后用于高效液相色谱法分析。当具有不同的培养速度时，确认出在进行静置培养的试料的情况下，白藜芦醇的产生量与δ-葡萄素相比显著多，在进行振荡培养的试料的情况下，δ-葡萄素的产生量与白藜芦醇相比显著多(图6)。

序列表

<110>韩国生命工学研究院

<120>利用甜菊苷从葡萄藤的组织的细胞培养中大量生产葡萄素的方法

<130>pct1706

<160>6

<170>kopatentin2.0

<210>1

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>1

atggcttcagttgaggaaatcaga24

<210>2

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<212>dna

<213>人工序列

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<223>引物

<400>2

ttaatttgtcaccataggaatgcta25

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<213>人工序列

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<213>人工序列

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tcaaggataaacctcaatgaggga24

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<213>人工序列

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<211>26

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<213>人工序列

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<223>引物

<400>6

tactaagaagctttcaacccagtata26