专利名称:鹿茸组织细胞培养方法
本发明属于鹿茸组织细胞培养方法。
直到提出本发明为止，与本发明相近的研究是Morrism Bubenik G.A.对激素与生茸关系的研究[CA10045542C(1984)]。该研究只是在鹿体上探明了雄激素对茸骨成熟和骨化作用，并未涉及鹿茸组织细胞在离体条件下的培养方法。
本发明的目的是将鹿茸组织细胞移植于培养瓶中，在离体条件下，赋予人工生长环境，建立完善的鹿茸组织细胞培养技术，使鹿茸组织细胞繁延于培养瓶中，获得试管型鹿茸细胞。
本发明的特征是采取鹿茸增生带组织细胞，经过细胞分散处理，接入G-1或者G-2培养液中，在36-38℃条件下，培养成试管型鹿茸细胞。
鹿茸增生带组织细胞由未分化的间充质、前成软骨细胞和成软骨细胞三层组成。本发明选择未分化的间充质或者前成软骨细胞做为基础材料。
经细胞培养得到的液体，含有大量鹿茸细胞，该种鹿茸细胞具有良好的分裂增殖能力，称为人工离体培养鹿茸的试管型前成软骨细胞。这种试管型前成软骨细胞，经若干次分裂后，可圆缩分化为其性质相当于鹿茸“腊片”部位组织的试管型前成软骨细胞。因此，其药用价值超过一般鹿茸。此外，本发明无论对采自鹿体的二杠茸、初角茸、去势茸和畸形茸，均能培养出试管型鹿茸细胞，而且用该技术培养的试管型鹿茸细胞存在着异常强烈的生命力和繁延能力，超过其它哺乳动物的任何组织细胞。
下面按操作过程详细叙述本发明的培养方法1、材料选取选择1-5岁的健康鹿锯茸，在实验室内进行清洗、消毒，用无菌器开口，剥下茸皮，采取增生带组织未分化的间充质或者前成软骨细胞。
2、细胞分散处理细胞分散处理有两种方法。一种是细胞细碎粒的制备，将采取的鹿茸增生带组织细胞用两把尖刃刀，在滴有血清的玻片上，对刃分割鹿茸组织，直到不能分割的细碎粒为止。另一种是细胞悬液的制备，将采取的鹿茸增生带组织细胞切成小块，放入捣碎机内，加入1%MEM液，其鹿茸组织块与1%MEM液比例为1∶3(g/ml)，开机3-5分钟，停几分钟后，再开机，经数次捣细成细胞悬液。
3、培养液的制备本发明所用的培养液有G-1和G-2两种，可任选一种。G-1培养液由1%MEM液、双抗、小牛血清组成，其比例范围为1%MEM液69-96%，双抗1%，小牛血清3-30%，PH值为6.8-7.3;但G-1培养液的最优配方比为1%MEM液74%、双抗1%、小牛血清25%，PH值为7.0-7.2。G-2培养液由1%MEM液、双抗、鹿血清组成，其比例范围为1%MEM液69-96%、双抗1%、鹿血清3-30%，PH值为6.8-7.3;但G-2培养液的最优配方比为1%MEM液74%、双抗1%、鹿血清25%，PH值为7.0-7.2。
4、试管型鹿茸细胞的培养。将经过分散处理的增生带组织细胞接入G-1或者G-2培养液中，其比例为细胞细碎粒与G-1或G-2培养液1∶50(g/ml);鹿茸细胞悬液与G-1或者G-2培养液1∶25(ml/ml);装于培养瓶中，盖好瓶塞，轻轻摇动，放在37℃条件下，培养成试管型鹿茸细胞。
5、细胞传代试管型鹿茸细胞在G-1或者G-2培养液中生长14-21天后，进行细胞传代培养，细胞传代时，先倾出原培养液，用无钙、镁去离子液(FCE)洗数次，加ATV消化，再加G-1或者G-2培养液进行分瓶培养。
权利要求
1.一种鹿茸组织细胞的培养方法，其特征在于取鹿茸增生带组织细胞，经过细胞分散处理，接入G-1或者G-2培养液中，在36-38℃条件下，培养成试管型鹿茸细胞。
2.根据权利要求
1所述的培养方法，其特征在于鹿茸增生带组织细胞，选择未分化的间充质或者前成软骨细胞。
3.根据权利要求
1所述的培养方法，其特征在于细胞分散处理是将采取的增生带组织细胞，用两把尖刃刀，在滴有血清的玻片上，对刃分割鹿茸组织，直到不能分割的细碎粒为止，或者将鹿茸组织块放入捣碎机内，加1%MEM液，其鹿茸组织块与1%MEM液比例为1∶3，开机3-5分钟，经数次捣细成细胞悬液。
4.根据权利要求
3所述的培养方法，其特征在于鹿茸增生带组织细胞接入G-1或者G-2培养液中，细碎粒与G-1或者G-2培养液比例为1∶50(g/ml)，鹿茸细胞悬液与G-1或者G-2培养液比例为1∶25(ml/ml)，在37℃条件下，置于培养瓶中培养。
5.根据权利要求
1所述的培养方法，其特征在于G-1培养液由1%MEM液、双抗、小牛血清组成，其比例为1%MEM液69-96%、双抗1%、小牛血清3～30%，PH值为6.8-7.3。
6.根据权利要求
5所述的培养方法，其特征在于G-1培养液由1%MEM液、双抗、小牛血清组成，其比例为1%MEM液74%、双抗1%、小牛血清25%，PH值为7.0-7.2。
7.根据权利要求
1所述的培养方法，其特征在于G-2培养液由1%MEM液、双抗、鹿血清组成，其比例为1%MEM液69-96%、双抗1%、鹿血清3-30%，PH值为6.8-7.3。
8.根据权利要求
7所述的培养方法，其特征在于G-2培养液由1%MEM液、双抗、鹿血清组成，其比例为1%MEM液74%、双抗1%、鹿血清25%，PH值为7.0-7.2。
9.根据权利要求
1所述的培养方法，其特征在于培养而成的试管型鹿茸细胞，在G-1或者G-2培养液中生长14-21天，进行细胞传代培养。
10.根据权利要求
9所述的培养方法，其特征在于细胞传代培养，先倾出原培养液，用无钙、镁去离子液(FCE)洗数次，加ATV消化，再加G-1或者G-2培养液，进行分瓶培养。
专利摘要
一种鹿茸组织细胞的培养方法，采取鹿茸增生带组织细胞，经过细胞分散处理，接入G-1或者G-2培养液中，在36-38℃条件下，培养成试管型鹿茸细胞。该鹿茸细胞具有良好的分裂增殖能力、强烈的生命力和繁延能力，其试管型鹿茸细胞相当于鹿茸“腊片”组织细胞，其药用价值超过一般鹿茸。该培养方法的试验成功，为人工大批生产鹿茸组织细胞提供了现实可能。
文档编号C12N5/02GK86107913SQ86107913
公开日1988年6月8日 申请日期1986年11月20日
发明者高云, 吴玉林, 王斌, 李春义, 程利平, 赵世珍 申请人:中国农业科学院特产研究所导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan