用于增强基因沉默的药物组合物和方法与流程

本申请要求2016年6月29日提交的韩国专利申请号kr10-2016-0081914的优先权，所述韩国专利申请的内容以引用的方式整体并入本文。

本发明提供增强sirna细胞进入或活性的化合物或药剂。本发明进一步提供识别此类化合物或药剂的方法。

背景技术：

rna干扰(rnai)能够以高特异性及有效的方式抑制基因表达。通过将双链rna引入细胞中，rnai导致目标mrna的降解，所述双链rna包含具有与目标基因的mrna同源的序列的有义链和具有与目标基因的mrna互补的序列的反义链。

为开发基于sirna的有效治疗剂，必须克服与例如稳定性、细胞进入和沉默效率有关的技术障碍。例如，因为由于磷酸酯骨架结构的负电荷，sirna不能通过细胞膜，所以体内递送的有效性受到挑战。尽管在体外递送的情况下，存在许多采用阳离子脂质和阳离子聚合物以加强细胞穿透的试剂，但这些试剂不适合在治疗背景下使用。

需要用于改良或增强sirna活性的药物组合物和方法，包括加强sirna细胞进入的组合物以推进这个有前途的技术。

技术实现要素：

在各种方面和实施方案中，本发明提供增强sirna细胞进入或活性的化合物或药剂。本发明进一步提供识别此类药剂的方法。本文中描述充当l-型钙通道阻断剂的示例性药剂且表明其增强sirna的细胞进入。

一方面，本公开提供包含诸如细胞穿透不对称小干扰rna(cp-asirna)的sirna和l-型钙通道阻断剂的药物组合物。所述l-型钙通道阻断剂加强sirna的细胞穿透，引起更有效的基因沉默。在一些实施方案中，所述l-型钙通道阻断剂为二氢吡啶或非二氢吡啶l-型钙通道阻断剂。所述药物组合物可以被配制用于各种递送途径，包括局部递送、肺部递送和肠胃外递送以用于治疗方法中。

在其他方面中，本公开提供一种在受试者中基因沉默的方法，其中所述方法包括向所述受试者施用有效量的小干扰rna(sirna)和l-型钙通道阻断剂。所述sirna和所述l-型钙通道阻断剂可以作为单一药物组合物被施用，或在一些实施方案中，所述sirna和所述l-型钙通道阻断剂作为单独的药物组合物被施用。在一些实施方案中，所述sirna为不对称sirna(asirna)，诸如细胞穿透asirna(cp-asirna)或长反义asirna(lasirna)。所述l-型钙通道阻断剂可以为二氢吡啶l-型钙通道阻断剂或非二氢吡啶l-型钙通道阻断剂。在各种实施方案中，sirna和l-型钙通道阻断剂中的一者或两者被配制用于局部递送、肺部递送或肠胃外递送。

另一方面，本公开提供一种筛选化合物以改良诸如细胞穿透不对称小干扰rna(cp-asirna)或长反义asirna(lasirna)的sirna的细胞进入或基因沉默活性的方法。所述方法可以包括使sirna与细胞接触；和使候选化合物与所述细胞接触；以及检测或定量所述细胞中的sirna，或在一些实施方案中，定量目标rna的表达的减少。通过将sirna穿透或活性与对照进行比较，可以识别加强或增强sirna活性或细胞进入的化合物或药剂，可选地被衍生化并且配制为药物组合物。在一些实施方案中，可以高通量筛选出增强活性的化合物。

在额外实施方案中，所述方法还包括选择增加sirna(例如asirna，例如cp-asirna或lasirna)的细胞穿透或活性的候选化合物。这些化合物可以与sirna一起配制，或分开配制，且递送给病患以增强sirna的基因沉默活性。

附图说明

图1描绘高通量筛选的示例性方案。图(a)：高通量筛选策略的概要。图(b)：高通量筛选和命中化合物的结果。

图2说明通过由筛选识别的3种命中化合物对cp-asirna的加强的基因沉默功效。图(a)：由3种命中化合物验证加强的基因沉默效能。图(b)：进一步分析西尼地平(cilnidipine)的加强的基因沉默效能。图表中的所有数据表示3次独立实验的平均值±sd。

图3说明dhp(二氢吡啶)l-型钙通道阻断剂的作用。图(a)：分析由衍生自dhpl-型钙通道阻断剂的氨氯地平(amlodipine)引起的基因沉默活性。图(b)：基于nucleocounter(nc-3000)定量由dhpl-型钙通道阻断剂引起的细胞摄取。图表中的所有数据表示3次独立实验的平均值±sd。

图4说明由非dhpl-型钙通道阻断剂对cp-asirna的基因沉默功效。图表中的所有数据表示3次独立实验的平均值±sd。

图5说明l-型钙通道阻断剂与t-型钙通道阻断剂的比较。图(a)：使用定量实时逆转录聚合酶链反应(qrt-pcr)分析的相对mrna水平。图(b)：与l-型钙通道阻断剂相比，基于nucleocounter(nc-3000)定量由t-型钙通道阻断剂引起的细胞摄取。图表中的所有数据表示3次独立实验的平均值±sd。

图6显示l-型钙通道阻断剂对cplasirna的基因沉默功效。通过浓缩将cp-lasictgf(0.01μm、0.03μm、0.1μm)与氨氯地平和西尼地平一起处理进希拉(hela)细胞中。24小时后，使用定量实时逆转录聚合酶链反应(qrt-pcr)分析相对mrna水平。通过除以gapdh水平(内部对照)测量ctgfmrna水平。

具体实施方式

除非另外定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属领域技术人员通常理解相同的含义。本文中提及的所有专利和公布均以引用的方式整体并入本文中。

本公开提供用sirna增强基因沉默的组合物和方法，以及通过化合物筛选制备此类组合物的方法。如本文所公开，l-型钙通道阻断剂增强包括cp-asirna或lasirna的sirna的摄取。

一方面，本公开提供包含诸如细胞穿透不对称小干扰rna(cp-asirna)或长反义asirna(lasirna)的sirna；和l-型钙通道阻断剂的药物组合物。

如本文所使用，术语“rnai”(rna干扰)指的是将双链rna(dsrna)引入细胞中以诱发目标mrna降解的机制，所述双链rna(dsrna)包含具有与目标基因的mrna互补的序列的第一链和具有与第一链互补的序列的第二链。第一链可以为反义链，其指的是与目标mrna大体上，即约80％、约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或100％互补的多核苷酸。例如，反义链可以与mrna(信使rna)的分子、非mrna的rna序列(例如微rna、piwirna、trna、rrna和hnrna)或编码或非编码的dna序列完全或部分互补。术语“反义链”与“引导链”在本文中可互换使用。在各种实施方案中，第一链通常具有约16至约50个核苷酸，诸如约16、17、18、19、20、21、22、23、24和25个核苷酸的长度。在第一链中，与目标核酸互补的区域可以具有约16至约31个核苷酸、约19至约25个核苷酸或约19至约21个核苷酸的长度。另外，第二链可以为有义链，其指的是具有与目标核酸完全或部分相同的核苷酸序列的多核苷酸。第二链可以具有约13至约25个核苷酸、约13至约21个核苷酸或约16至约21个核苷酸的长度。在各种实施方案中，第二链可以具有约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个核苷酸。

不对称sirna(asirna)描述于us2012/0238017中，其以引用的方式整体并入本文中。在一些实施方案中，asirna包括“17+2a”、“16+3a”和“15+4a”的构造。17+2asirna结构指的是双链sirna分子，其包含19个核苷酸的反义链和具有与其互补的序列的17个核苷酸的有义链，其中反义链的5'端为钝端且反义链的3'端具有2个核苷酸的悬垂物。同样，术语16+3asirna结构是双链sirna分子，其包含19个核苷酸的反义链和具有与其互补的序列的16个核苷酸的有义链，其中反义链的5'端为钝端且反义链的3'端具有3个核苷酸的悬垂物。15+4asirna是双链sirna分子，其包含19个核苷酸的反义链和具有与其互补的序列的15个核苷酸的链，其中反义链的5'端为钝端且反义链的3'端具有4个核苷酸的悬垂物。asirna提供基因沉默效率方面的益处，同时由有义链减少偏离目标的作用。

在一些实施方案中，asirna的一端或两端包含3'端上的悬垂物。在一些实施方案中，悬垂物是二核苷酸悬垂物(例如dtdt)。

在各种实施方案中，asirna是细胞穿透不对称sirna或cp-asirna。cp-asirna例如描述于美国专利申请公布号2015/0111948中，其以引用的方式整体并入本文中。在一些实施方案中，cp-asirna可以在不使用任何转染试剂的情况下使目标基因内化和沉默。

在各种实施方案中，cp-asirna包含asirna，其中核酸分子中至少一个核苷酸的磷酸酯骨架被硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯取代，且还包含与其结合的亲脂性化合物以有利于细胞进入。在各种实施方案中，核酸分子的区域中而非与目标核酸互补的区域中的核苷酸的磷酸酯骨架可以被硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯取代。在一些实施方案中，核酸分子中至少一个核苷酸的磷酸酯骨架可以被硫代磷酸酯取代。在一些实施方案中，亲脂性化合物选自脂质、亲脂性肽和亲脂性蛋白质。脂质可以为选自胆甾醇、生育酚和具有10个或更多个碳原子的长链脂肪酸中的至少一种。在一些实施方案中，亲脂性化合物为胆甾醇、胆甾烯、胆甾烷、胆甾二烯、胆汁酸、胆酸、脱氧胆酸或脱氢胆酸。在一个实施方案中，亲脂性化合物为胆甾醇。亲脂性化合物可以与核酸分子的第一或第二链的末端结合。

在各种实施方案中，asirna为长反义asirna或lasirna。lasirna例如描述于美国专利号9,637,742中，其以引用的方式整体并入本文中。

在各种实施方案中，lasirna包含asirna，其具有约21至约121nt长度(例如约20至约125nt，或约20至约115nt，或约20至约105nt，或约20至约100nt，或约20至约90nt，或约20至约80nt，或约20至约70nt，或约20至约60nt，或约20至约50nt，或约20至约40nt，或约20至约30nt，或约30至约125nt，或约40至约125nt，或约50至约125nt，或约60至约125nt，或约70至约125nt，或约80至约125nt，或约90至约125nt，或约100至约125nt，或约24至约119nt长度，或约26至31nt长度，或约26，或约27，或约28，或约29，或约30，或约31nt长度)的第一链，所述第一链包含与目标核酸100％互补的区域，其中与目标核酸100％互补的区域包含至多19个5'核酸的第一链；和16nt长度的第二链，所述第二链互补结合于与目标核酸100％互补的第一链的区域，其中第二链结合于第一链使得第一链具有第二链结合的双链区及第二链不结合的单链区，并且其中第一链的5'端和第二链的3'端形成钝端。

在各种实施方案中，本文所述的sirna可以由核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸或两者构成，并且可以包括多种提供保护免受核酸酶的作用或增强碱基配对相互作用的修饰。例如，核酸分子可以包含一个或多个由硫代磷酸酯键连接的核苷酸，在2'位具有修饰的核苷酸，或多环或锁定核苷酸。

在一些实施方案中，本文所述的sirna可以采用多种寡核苷酸化学成分。寡核苷酸化学成分的实例包括但不限于2'o-me-修饰的寡核苷酸、肽核酸(pna)、锁定核酸(lna)、硫代磷酸酯和吗啉代化学成分，以及任一前述的组合。

在一些实施方案中，在诱发rnai的双链核酸分子(例如asirna或cp-asirna)中所包括的至少一种核苷酸的核糖2'位的羟基选自氢原子、氟原子、-o-烷基、-o-酰基和氨基中的至少一种取代。在一些实施方案中，核酸分子中所包括的至少一种核苷酸的磷酸酯骨架可以用选自烷基膦酸酯形式、氨基磷酸酯形式和硼烷磷酸酯形式中的至少一种取代。

在一些实施方案中，核酸分子中所包括的至少一种核苷酸可以用选自lna(锁定核酸)、una(未锁定核酸)、吗啉代和pna(肽核酸)中的至少一种取代。在一些实施方案中，第一链中的单链区的核苷酸中的至少一种可以包含大体积碱基类似物。

例如，在一个实施方案中，核酸分子可以包含一种或多种多环或锁定核酸(lna)。锁定核酸是经过修饰的rna核苷酸。锁定核酸核苷酸的核糖部分用连接2'氧和4'碳的额外桥修饰。桥“锁定”3'-内(北)构象中的核糖，其通常可见于a-型双链体(duplex)中。锁定核酸核苷酸可以在无论何时需要时与多核苷酸中的dna或rna残基混合，并且根据沃森-克里克(watson-crick)碱基配对规则与dna或rna杂交。锁定核糖构型加强碱基堆叠和骨架预组织。此显著增加多核苷酸的杂交特性(溶解温度)。包含锁定核酸核苷酸的多核苷酸是核酸酶抗性的，增加其化学稳定性。

在一些实施方案中，核酸分子可以包括一种或多种修饰核苷酸。示例性修饰核苷酸描述于美国专利号8,278,036中，其以引用的方式整体并入本文中。例如，修饰核苷酸可以选自以下中的一种或多种：假尿苷、n1-甲基假尿苷、5-甲基胞苷、或n6-甲基腺苷、5-羟基胞苷、5-羟基甲基胞苷、5-羧基胞苷、5-甲酰基胞苷、5-羟基尿苷、5-羟基甲基尿苷、5-羧基尿苷、5-甲酰基尿苷、假尿苷、2-硫代尿苷、4-硫代尿苷、5-氮杂尿苷、5-氨基尿苷、5-甲基尿苷、2-硫代假尿苷、4-硫代假尿苷、5-羟基假尿苷、5-甲基假尿苷、5-氨基假尿苷、假异胞苷、n4-甲基胞苷、2-硫代胞苷、5-氮杂胞苷、5-氨基胞苷、n4-甲基假异胞苷、2-硫代假异胞苷、5-羟基假异胞苷、5-氨基假异胞苷、5-甲基假异胞苷、7-脱氮腺苷、6-硫代鸟苷、7-脱氮鸟苷、8-氮杂鸟苷、6-硫代-7-脱氮鸟苷、6-硫代-8-氮杂鸟苷、7-脱氮-8-氮杂鸟苷和6-硫代-7-脱氮-8-氮杂鸟苷。在一些实施方案中，可以选择和放置经过修饰的寡核苷酸使得其不在核酸分子的两条链之间干扰碱基配对。

在各种实施方案中，本发明提供药物组合物，其包含诸如细胞穿透不对称小干扰rna(cp-asirna)或长反义asirna(lasirna)的sirna,；和可以加强sirna的细胞穿透，引起更有效的基因沉默的l-型钙通道阻断剂。

在各种实施方案中，l-型钙通道阻断剂为二氢吡啶l-型钙通道阻断剂。示例性二氢吡啶l-型钙通道阻断剂包括但不限于氨氯地平、阿雷地平(aranidipine)、阿折地平(azelnidipine)、巴尼地平(barnidipine)、贝尼地平(benidipine)、西尼地平(cilnidipine)、氯维地平(clevidipine)、伊拉地平(isradipine)、依福地平(efonidipine)、非洛地平(felodipine)、拉西地平(lacidipine)、乐卡地平(lercanidipine)、马尼地平(manidipine)、尼卡地平(nicardipine)、硝苯地平(nifedipine)、尼伐地平(nilvadipine)、尼莫地平(nimodipine)、尼索地平(nisoldipine)、尼群地平(nitrendipine)和普拉地平(pranidipine)。在一些实施方案中，l-型钙通道阻断剂可以选自：

在其他实施方案中，所述l-型钙通道阻断剂为非二氢吡啶l-型钙通道阻断剂。示例性非二氢吡啶l-型钙通道阻断剂包括但不限于(i)苯基烷胺钙通道阻断剂和苯并硫氮杂钙通道阻断剂，包括维拉帕米(verapamil)、地尔硫(diltiazem)、加洛帕米(gallopamil)和芬地林(fluspirilene)；(ii)加巴喷丁类似物(gabapentinoid)，包括加巴喷丁(gabapentin)和普瑞巴林(pregabalin)；(iii)齐考诺肽(zixonotide)；以及(iv)米贝拉地尔(mibefradil)、苄普地尔(bepridil)、氟桂利嗪(flunarizine)和氟司必林(fluspirilene)。

在其他方面，本发明提供一种在受试者中基因沉默的方法，其中所述方法包括向所述受试者施用有效量的小干扰rna(sirna)；和l-型钙通道阻断剂。所述sirna和所述l-型钙通道阻断剂可以作为单一药物组合物被施用，或在一些实施方案中，所述sirna和所述l-型钙通道阻断剂作为单独的药物组合物被施用。在一些实施方案中，sirna是不对称sirna(asirna)，诸如细胞穿透asirna(cp-asirna)或长反义asirna(lasirna)。所述l-型钙通道阻断剂可以为二氢吡啶l-型钙通道阻断剂或非二氢吡啶l-型钙通道阻断剂。

可以结合本发明使用的示例性asirna列于下表1至3中。

[表1]

[表2]

[表3]

在各种实施方案中，本发明提供用于使目标基因基因沉默的方法。在各种实施方案中，所述目标基因可以选自mrna(信使rna)、微rna、pirna(piwi-相互作用rna)、编码dna序列和非编码dna序列。在一些实施方案中，所述目标基因是mrna。在其他实施方案中，所述目标基因是编码结缔组织生长因子(ctgf)的mrna。

另一方面，本公开进一步提供筛选化合物以改良、增加或加强sirna(例如asi-rna或cp-asirna或lasirna)的活性的方法，其包括使sirna与细胞接触；使候选化合物与细胞和/或sirna接触；以及检测穿透进入细胞中的sirna。在一些实施方案中，所述方法还包括使一定量的穿透进入细胞中的sirna(例如asi-rna或cp-asirna或lasirna)与对照进行比较以判定与不含有候选化合物的细胞相比穿透进入含有候选化合物的细胞中的sirna是否增加。在一些实施方案中，对照可以是没有任何改良、增加或加强sirna的细胞穿透活性的次级化合物的实验、已知或估计量的穿透的sirna(例如asi-rna或cp-asirna或lasirna)。对照可以是来自先前实验的已知值或预定值。所述方法可以还包括选择增加sirna(例如asi-rna或cp-asirna或lasirna)穿透进入细胞中的候选化合物作为改良sirna活性的化合物。

在额外实施方案中，本文所述的方法还包括检测细胞中的sirna(例如asi-rna或cp-asirna或lasirna)的基因沉默活性。可以选择增加细胞中sirna(例如asi-rna或cp-asirna或lasirna)的基因沉默活性的候选化合物作为改良sirna的活性的化合物。在其他实施方案中，所述方法还包括将sirna(例如asi-rna或cp-asirna或lasirna)的基因沉默活性与对照进行比较以判定含有候选化合物的sirna的基因沉默活性与不含有候选化合物的活性相比是否增加。对照可以是不含有任何改良、增加或加强sirna的基因沉默活性的次级化合物的sirna(例如asi-rna或cp-asirna或lasirna)的实验、已知或估计的基因沉默活性。对照可以是来自先前实验的已知值或预定值。

在各种实施方案中，所述方法还包括制备在底物上包含细胞的细胞培养物。在一些实施方案中，所述方法包括制备在多个离散底物上包含细胞的细胞培养物。在一些实施方案中，底物上的细胞与sirna(例如asi-rna或cp-asirna或lasirna)或sirna的组合接触。例如，底物上的细胞可以接触第一sirna(例如asi-rna或cp-asirna或lasirna)或sirna(例如asi-rna或cp-asirna或lasirna)的第一组合和第二sirna(例如asi-rna或cp-asirna或lasirna)或sirna(例如asi-rna或cp-asirna或lasirna)的第二组合。在一些实施方案中，在多个离散底物中的一个上接触细胞的第一sirna或sirna的第一组合可以不同于在多个离散底物中的另一个上接触细胞的第二sirna或sirna的第二组合。多个离散底物中的每一个上的细胞可以接触不同的sirna或sirna的组合。在一些实施方案中，所述方法包括使多种候选化合物与多个底物上的细胞接触，并且同时孵育含有所述细胞的多种候选化合物。在额外实施方案中，所述方法包括同时使多种候选化合物与多个底物上的细胞接触。在一些实施方案中，所述底物为孔。在一些实施方案中，细胞为人类细胞。

在一些实施方案中，sirna(例如asi-rna或cp-asirna或lasirna)例如用荧光染料标记。sirna(例如asi-rna或cp-asirna或lasirna)可以例如通过检测标记来检测。sirna(例如asi-rna或cp-asirna或lasirna)的量可以例如通过测量标记的量来确定。

在各种实施方案中，本发明提供药物组合物，其被配制用于各种递送途径，包括经直肠、经颊、鼻内和经皮途径，动脉内注射、静脉内、腹膜内、肠胃外、肌肉内、皮下、口服、局部或以吸入剂形式。在一些实施方案中，递送途径为局部、经肺或肠胃外以用于如本文别处所述的各种治疗方法。在一些实施方案中，sirna和l-型钙通道阻断剂中的一者或两者被配制用于局部递送、肺部递送或肠胃外递送。在一些实施方案中，所述药物组合物被配制用于施加至皮肤、眼睛、肺或全身递送。在各种实施方案中，所述药物组合物与诸如但不限于脂质体、阳离子聚合物、抗体、适体或纳米颗粒的各种递送媒介物一起用于体外和/或体内递送。

在一些实施方案中，本文所述的药物组合物可以为用于口服施用的药物组合物，其含有sirna(例如asi-rna或cp-asirna或lasirna)和l-型钙通道阻断剂，以及任选的适于口服施用的药物赋形剂。在一些实施方案中，药物组合物可以排除sirna(例如asi-rna或cp-asirna或lasirna)的单独递送媒介物。在各种实施方案中，药物组合物以适于口服施用的形式，即固体或液体制剂形式进行配制。适合的固体口服配制物包括片剂、胶囊、丸剂、颗粒、药丸等。适合的液体口服配制物包括溶液、混悬液、分散液、乳剂、油等。

在一些实施方案中，本文所述的药物组合物可以为用于注射的药物组合物，其含有本文所述的sirna(例如asi-rna或cp-asirna或lasirna)和l-型钙通道阻断剂，以及任选的适于注射的药物赋形剂。在一些实施方案中，药物组合物可以排除用于sirna(例如asi-rna或cp-asirna或lasirna)的单独递送媒介物。

在一些实施方案中，本发明的药物组合物的通过注射施用的合并形式包括水性或油性混悬液或乳剂(使用芝麻油、玉米油、棉籽油或花生油)，以及酏剂、甘露糖醇、右旋糖或无菌水溶液和类似的药物媒介物。在一些实施方案中，使用盐水中的水溶液用于注射。也可使用乙醇、甘油、丙二醇和液体聚乙二醇(以及其合适的混合物)、环糊精衍生物和植物油。可以例如通过使用诸如卵磷脂的涂层并且在分散液的情况下通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。药物组合物可以还包含各种抗细菌和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸和硫柳汞。

通过在适宜溶剂中将必需量的活性药物成分或活性药物成分的组合与上文所列举的各种其他成分合并，随后过滤灭菌来制备无菌可注射溶液。通常，通过将各种灭菌活性成分合并到含有基本分散介质和来自以上列举的所需其他成分的无菌媒介物中来制备分散液。在用于制备无菌注射液的无菌粉末的情况下，某些期望的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，其从其先前无菌过滤的溶液中得到所述活性成分加任何另外希望的成分的粉末。

在一些实施方案中，药物组合物局部施用至体表，因此以适于局部施用的形式进行配制。适合的局部配制物包括但不限于凝胶、油膏、霜剂、洗剂、滴剂等。

在各种实施方案中，本发明的药物组合物还包括药学上可接受的载体或稀释剂。药学上可接受的载体或稀释剂为所属领域的技术人员广泛熟知。载体或稀释剂在各个实施方案中可以为用于固体配制物的固体载体或稀释剂、用于液体配制物的液体载体或稀释剂，或其混合物。在另一实施方案中，固体载体/稀释剂包括但不限于树胶、淀粉(例如玉米淀粉、预胶凝化淀粉)、糖(例如乳糖、甘露糖醇、蔗糖、右旋糖)、纤维素材料(例如微晶纤维素)、丙烯酸酯(例如聚丙烯酸甲酯)、碳酸钙、氧化镁、滑石或其混合物。

在一些实施方案中，药物组合物是控制释放组合物，即活性剂在施用后经一段时期释放的组合物。控制释放或持续释放组合物包括在亲脂性储库(例如脂肪酸、蜡、油)中的配制物。在另一实施方案中，药物组合物是立即释放组合物，即活性剂在施用后立即释放的组合物。

在各种实施方案中，本文所描述的sirna(例如asi-rna或cp-asirna或lasirna)和l-型钙通道阻断剂以药物组合物形式共同施用。如本文所用的术语“共同施用(co-administration)”、“共同施用(co-administering)”、“与……组合共同施用(administeredincombinationwith)”、“与……组合共同施用(administeringincombinationwith)”、“同时(simultaneous)”和“同时(concurrent)”涵盖向人类受试者施用两种或更多种活性药物成分使得两种活性药物成分和/或其代谢物同时存在于人类受试者中。共同施用可以包括以不同组合物同时或分时施用，以单独的组合物不同时施用，或以存在两种或更多种活性药物成分的药物组合物施用。以单独的组合物同时施用和以存在两种药剂的药物组合物施用也涵盖在本发明的方法中。

在一些实施方案中，以单一剂量施用药物组合物或活性药物成分。此类施用可以通过例如静脉内注射的注射来进行以快速引入活性药物成分。然而，适当时还可以使用包括口服途径的其他途径。药物组合物的单一剂量也可用于治疗急性病状。在一些实施方案中，药物组合物或活性药物成分以分次剂量施用。在一个实施方案中，药物组合物以多次剂量施用。给药可以为每天一次、两次、三次、四次、五次、六次或六次以上。给药可以为每月一次、每两周一次、每周一次或每隔一天一次。在其他实施方案中，药物组合物每天施用约一次至每天施用约6次。在一些实施方案中，药物组合物每天施用一次，而在其他实施方案中，药物组合物每天施用两次，且在其他实施方案中，药物组合物每天施用三次。

另一方面，本公开涉及一种在受试者中基因沉默的方法，其包括向所述受试者施用有效量的本文所述的药物组合物。使用sirna(例如asi-rna或cp-asirna或lasirna)基因沉默的方法至少描述于美国专利申请公布号2017/0137828和2017/0027837中，所有所述美国专利申请公布以引用的方式整体并入本文。

在一些实施方案中，本公开涉及一种在受试者中治疗或预防结缔组织生长因子(ctgf)相关疾病或紊乱的方法，其包括向所述受试者施用有效量的包含如本文所述的sirna(例如asi-rna或cp-asirna或lasirna)和/或l-型钙通道阻断剂的药物组合物。在一些实施方案中，sirna(例如asi-rna或cp-asirna或lasirna)包含具有与编码ctgf的mrna的序列互补性的长度为至少19个核苷酸的反义链，和具有与所述反义链的序列互补性的长度为15至17个核苷酸的有义链。在各种实施方案中，ctgf相关疾病或紊乱可以选自瘢痕疙瘩、肾纤维化、皮肥厚病、肺纤维化、肝纤维化、关节炎、高血压、肾衰竭、血管生成相关紊乱、皮肤纤维变性和心血管系统紊乱。在一些实施方案中，sirna(例如asi-rna或cp-asirna或lasirna)可以与亲脂性化合物结合并且具有选自以下的核酸序列对：seqidno:1和2的核苷酸序列对、seqidno:3和4的核苷酸序列对以及核苷酸序列seqidno:5和6的核苷酸序列对。可以用以治疗或预防ctgf相关疾病或紊乱的额外sirna(例如asi-rna或cp-asirna或lasirna)公开于美国专利公布号20150111948中，其全部公开内容以引用的方式整体并入本文。

在一些实施方案中，本公开涉及一种治疗有需要的受试者的诸如年龄相关黄斑变性(amd；例如干或湿amd)的眼睛病状的方法，其包括向所述受试者施用有效量的如本文所述的药物组合物，其中sirna(例如asi-rna或cp-asirna或lasirna)包含具有与myd88mrna序列或tlr3mrna序列的序列互补性的长度为至少19个核苷酸的反义链，和具有与所述反义链的序列互补性的长度为15至17个核苷酸的有义链，其中所述反义链和所述有义链形成复合体，其中反义链的5'端和有义链的3'端形成钝端。可以用以治疗或预防amd的示例性sirna(例如asi-rna或cp-asirna或lasirna)公开于美国专利公布号20170137828中，其全部公开内容以引用的方式整体并入本文。

在一些实施方案中，本公开涉及一种抑制和/或减少受试者的黑色素产生的方法，其包括向所述受试者施用有效量的如本文所述的药物组合物，其中sirna(例如asi-rna或cp-asirna)包含具有与酪氨酸酶mrna序列的序列互补性的长度为至少19个核苷酸的反义链，和具有与所述反义链的序列互补性的长度为15至17个核苷酸的有义链，其中所述反义链和所述有义链形成复合体，其中反义链的5'端和有义链的3'端形成钝端。可以用以抑制和/或减少黑色素产生的示例性sirna(例如asi-rna或cp-asirna或lasirna)公开于美国专利公布号20170027837中，其全部公开内容以引用的方式整体并入本文。在一些实施方案中，本发明进一步提供治疗皮肤疾病或病状的方法，所述皮肤疾病或病状包括但不限于皮肤变白、变黑或结疤，异位性皮肤炎，牛皮癣，硬皮病，脱发或皮肤起皱。

在各种实施方案中，通过本发明的方法治疗的受试者是人类。

发明模式

现参考以下实施例描述本文所涵盖的实施方案。这些实施例仅出于说明的目的而提供，并且本公开绝不应解释为限于这些实施方案，而应解释为涵盖由于本文所提供的教义而变得显而易见的任何和所有变化形式。

实施例1.用于改良cp-asirna基因沉默活性的高通量筛选。

dmso毒性测试后，在蒸馏水中稀释来自韩国化学银行(koreachemicalbank)的化学库的2354种临床活性候选化合物，并且贮藏在96孔密封板中。在孵育cp-asigfp和化学品之前，将希拉/gfp稳定细胞系的4,000个细胞接种于96孔板中。24小时接种后，转染cp-asirna。在没有用任何诸如脂质体或脂质体2000的转染试剂24小时转染后，将培养基从opti-mem(gibco)变为具有10％fbs(gibco)的dmem(gibco)。使用多孔板读数器测量具有化学品的cp-asirna的相对荧光强度(图1)。在第一次筛选时，每种化学品测量两次相对荧光强度。基于第一次筛选，选择五种在各板中具有最高强度的候选化学品，并且进行第二次筛选。第二次筛选产生10种命中化合物。在分析10种化合物的结构后，命中化合物中的3种共享核结构并且充当l-型钙通道阻断剂。

实施例2.通过筛选识别出的小分子改良cp-asirna的基因沉默。

再次测试通过筛选确认的三种命中化合物以验证对于cp-asirna的rna干扰作用。为设置不受细胞毒性影响的最佳范围，进行mtt测定。根据这个范围(致死剂量50)，选择3种命中化合物的浓度，并且在所选范围内再次测试所述化合物。用cp-asigfps(100nm)和3种候选化学品处理希拉/gfp细胞。孵育24小时后，将培养基从opti-mem(gibco)变为具有10％fbs(gibco)的dmem(gibco)。改变培养基24小时后，使用定量实时逆转录聚合酶链反应(qrt-pcr)测量相对gfpmrna水平(图2中的图a)。当用3种化学品处理时，与仅cp-asigfp相比观察到cp-asigfp活性的加强。为测试cp-asirna的基因沉默活性是否具有序列特异性，还测试另一种靶向cp-asirna的生存素(0.3μm)。将具有3种候选化学品的cp-asi生存素加入至希拉细胞中并且使用qrt-pcr分析目标mrna水平(图2中的图a)。通过除以作为内部对照的微管蛋白水平计算gfp和生存素mrna水平。这个结果显示cp-asi生存素的基因沉默活性通过用3种候选化合物处理得以加强。

选择显示对于cp-asirna具有最大基因沉默作用的西尼地平。将具有变化浓度的西尼地平的靶向cp-asirna的gfp(50nm和250nm)和靶向cp-asirna的生存素(0.5μm和1μm)加入至希拉/gfp和希拉细胞中。48小时后，使用定量实时逆转录聚合酶链反应(qrt-pcr)分析具有西尼地平的cp-asirna的活性。通过除以微管蛋白水平(内部对照)测量相对gfp和生存素mrna水平(图2中的图b)。观察到浓度依赖性cp-asirna活性的加强。这些结果展示通过筛选识别出的3种命中化合物加强cp-asirna的基因沉默活性。

实施例3.二氢吡啶(dhp)l-型钙通道阻断剂改良cp-asirna的基因沉默。

还测试不包含在化学库中的氨氯地平。此化合物具有与dhp共同的结构并且充当l-型钙通道阻断剂。用氨氯地平将cp-asigfp和cp-asi生存素处理进希拉/gfp和希拉细胞中。孵育48小时后通过qrt-pcr测量其基因沉默作用(图3中的图a)。通过除以微管蛋白水平(内部对照)来计算gfp和生存素mrna水平。通过将cp-asigfp(50nm、100nm、250nm)和cp-asi生存素(0.3μm、0.5μm、1μm)与变化浓度的氨氯地平一起孵育显示降低的gfp和生存素mrna表达水平。这些结果显示氨氯地平也降低相对目标mrna水平，并且以剂量依赖性方式加强cp-asirna基因沉默作用。结果支持不仅3种通过筛选识别出的化合物而且dhpl-型钙通道阻断剂都加强cp-asirna的rnai功效。不断地，使用标记cy3的cp-asigfp进行基于nucleocounter(nc3000)的技术以判定dhpl-型钙通道阻断剂是否影响细胞摄取(图3中的图b)。用100nm标记cy3的cp-asigfp与dhpl-型钙通道阻断剂一起处理希拉细胞。孵育8小时后，使用hoechst33342(biotium)来固定和活细胞荧光染色dna和核。与门控细胞群上的细胞内荧光强度相比定量相对荧光强度。通过基于细胞内cy3信号的nucleocounter方法定量荧光强度。如1所示相对于标记cy3的cp-asigfp表达计算标准化荧光强度。具有dhpl-型钙通道阻断剂的cp-asigfp的细胞摄取高于仅cp-asigfp的细胞摄取。结果支持dhpl-型钙通道阻断剂加强细胞摄取，导致增加cp-asirna的基因沉默功效。

实施例4.非二氢吡啶(非dhp)l-型钙通道阻断剂还改良cp-asirna的基因沉默

选择另一类型的钙通道阻断剂，如非dhpl-型钙通道阻断剂进行测试。将具有地尔硫和维拉帕米的cp-asigfp和cp-asi生存素处理进希拉/gfp和希拉细胞中。用具有地尔硫和维拉帕米的cp-asigfp(50nm、100nm)和cp-asi生存素(0.3μm、0.5μm、1μm)通过浓缩处理48小时后，使用定量实时逆转录聚合酶链反应(qrt-pcr)观察到减少的gfp和生存素mrna水平。通过除以作为内部对照的微管蛋白水平来计算gfp和生存素mrna水平。如图4可见，当用地尔硫和维拉帕米处理时，cp-asirna的基因沉默功效比仅用cp-asirna处理更有效。因此，这2种化合物还显示与dhpl-型钙通道阻断剂相比对于cp-asirna的类似的作用，证实加强的基因沉默作用受到l-型钙通道阻断剂的影响。

实施例5.验证l-型钙通道阻断剂对于cp-asirna的作用

测试另一类型的钙通道阻断剂，诸如t-型钙通道阻断剂的作用。通过浓缩将具有五氟利多(penfluridol)和乙琥胺(ethosuximide)的cp-asigfp(50nm、100nm、250nm)和cp-asi生存素(0.3μm、0.5μm、1μm)加入至希拉/gfp和希拉细胞中。48小时后，使用定量实时逆转录聚合酶链反应(qrt-pcr)分析相对mrna水平。通过除以微管蛋白水平(内部对照)来测量gfp和生存素mrna水平(图5中的图a)。不同于l-型钙通道阻断剂，t-型钙通道阻断剂不改良cp-asirna的基因沉默功效。另外，使用基于nucleocounter(nc3000)的技术分析细胞摄取。将具有非dhpl-型和t-型钙通道阻断剂的标记cy3的cp-asigfp处理进希拉细胞中。希拉细胞与具有非dhpl-型钙通道阻断剂和t-型钙通道阻断剂的标记cy3的cp-asigfp(100nm)一起孵育。孵育8小时后，定量门控细胞群上的细胞内荧光强度。通过nc-3000测量细胞内cy3信号并且相对于标记cy3的cp-asigfp表达标准化。如图5中的图b可见，仅当用非dhpl-型钙通道阻断剂而非t-型钙通道阻断剂处理时检测到cp-asigfp的加强的细胞摄取。

实施例6.l-型钙通道阻断剂对各种形式的cp-asirna的作用

为识别l-型钙通道阻断剂对各种形式的cp-asirna的作用，对cp-asirna施加结构变化和若干化学修饰。称为细胞穿透长不对称sirna(cp-lasirna)的所得rna分子显示有效的目标基因沉默。将具有氨氯地平和西尼地平的靶向cp-lasirna的ctgf(cp-lasictgf)处理进希拉细胞中。通过qrt-pcr测量其基因沉默活性(图6)。诸如氨氯地平和西尼地平的l-型钙通道阻断剂以剂量依赖性方式帮助加强cp-lasirna的基因沉默作用。这些结果支持l-型钙通道阻断剂对各种形式的cp-asirna起作用以改良目标基因沉默功效。

cp-lasirna序列信息(seqidno:145和146，“m”：ome修饰，“*”：硫代磷酸酯(ps)修饰，和“chol”：胆甾醇修饰)。

ctgf和gapdh引物序列信息(seqidno:147-150)

序列表

<110>奥利克斯医药有限公司

d·李

d·s·孙

y·h·金

<120>用于增强基因沉默的药物组合物和方法

<130>olx-004pc

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<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(19)

<223>rna

<400>136

uuugcccuucuuaauguuctt21

<210>137

<211>16

<212>rna

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>137

cauuaagaagggcaaa16

<210>138

<211>31

<212>rna

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>138

uuugcccuucuuaauguucucuuccagguca31

<210>139

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(19)

<223>rna

<400>139

ggaagacacguuuggcccatt21

<210>140

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(19)

<223>rna

<400>140

ugggccaaacgugucuucctt21

<210>141

<211>16

<212>rna

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>141

agacacguuuggccca16

<210>142

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(19)

<223>rna

<400>142

ugggccaaacgugucuucctt21

<210>143

<211>16

<212>rna

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>143

agacacguuuggccca16

<210>144

<211>31

<212>rna

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>144

ugggccaaacgugucuuccagucgguaagcc31

<210>145

<211>16

<212>rna

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<220>

<221>ome修饰

<222>(1)..(1)

<220>

<221>ome修饰

<222>(3)..(3)

<220>

<221>ome修饰

<222>(5)..(5)

<220>

<221>ome修饰

<222>(7)..(7)

<220>

<221>ome修饰

<222>(9)..(9)

<220>

<221>ome修饰

<222>(11)..(11)

<220>

<221>ome修饰

<222>(13)..(13)

<220>

<221>硫代磷酸酯(ps)修饰

<222>(14)..(16)

<220>

<221>ome修饰

<222>(15)..(15)

<220>

<221>misc_binding

<222>(16)..(16)

<223>胆甾醇

<400>145

cuuaccgacuggaaga16

<210>146

<211>31

<212>rna

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<220>

<221>ome修饰

<222>(13)..(31)

<220>

<221>硫代磷酸酯(ps)修饰

<222>(28)..(31)

<400>146

ucuuccagucgguaagccgcgagggcaggcc31

<210>147

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>147

caagggcctcttctgtgact20

<210>148

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>148

ccgtcggtacatactccaca20

<210>149

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>149

gagtcaacggatttggtcgt20

<210>150

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>150

gacaagcttcccgttctcag20