本发明涉及化合物，含有所述化合物的组合物、组合产品和药物及其制备方法。本发明还涉及所述化合物、组合产品、组合物和药物，例如作为靶蛋白活性抑制剂，包括降解靶蛋白和治疗由靶蛋白介导的病症的用途。
发明背景
一个重要的大型酶家族是蛋白激酶酶家族。目前，有大约500种不同的已知蛋白激酶。蛋白激酶通过将atp-mg2+复合物的γ-磷酸酯转移至氨基酸侧链而用于催化各种蛋白中所述氨基酸侧链的磷酸化。这些酶控制细胞内的大部分信号传导过程，从而通过蛋白中丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸残基的羟基的可逆磷酸化来控制细胞功能、生长、分化和破坏(细胞凋亡)。研究已显示，蛋白激酶是许多细胞功能(包括信号转导、转录调节、细胞运动和细胞分裂)的关键调节因子。几种致癌基因也已显示编码蛋白激酶，这表明激酶在肿瘤发生中起作用。这些过程通常受到复杂的相互交错的途径高度调节，其中每种激酶本身受一种或多种激酶的调节。因此，异常或不适当的蛋白激酶活性可能导致与这种异常激酶活性相关的疾病状态的产生。由于其生理相关性、多样性和普遍性，蛋白激酶已成为生物化学和医学研究中最重要和广泛研究的酶家族之一。
酶的蛋白激酶家族通常基于它们磷酸化的氨基酸残基而分为两个主要亚家族：蛋白酪氨酸激酶(ptk)和蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶。丝氨酸/苏氨酸激酶(pstk)包括环状amp-和环状gmp-依赖性蛋白激酶，钙-和磷脂-依赖性蛋白激酶，钙-和钙调蛋白-依赖性蛋白激酶，酪蛋白激酶，细胞分裂周期蛋白激酶等。这些激酶通常是细胞质的或与细胞的颗粒部分相关，可能通过锚定蛋白。在许多病理(如类风湿性关节炎、牛皮癣、脓毒性休克、骨质流失、许多癌症和其它增殖性疾病)中已经涉及或怀疑有异常的蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶活性。因此，丝氨酸/苏氨酸激酶和它们是其部分的信号转导途径是药物设计的重要靶标。酪氨酸激酶使酪氨酸残基磷酸化。酪氨酸激酶在细胞调节中起着同样重要的作用。这些激酶包括分子如生长因子和激素的几种受体，包括表皮生长因子受体、胰岛素受体、血小板衍生生长因子受体等。研究已表明，许多酪氨酸激酶是跨膜蛋白，其受体结构域位于细胞外部，并且其激酶结构域位于细胞内部。大量鉴定激酶调节剂的工作也在进行中。
期望鉴定激酶活性的抑制剂作为与异常激酶活性相关的病症的潜在疗法。
使用小分子选择性降解靶蛋白是治疗各种疾病的新方法。蛋白水解靶向嵌合分子(protacs)是双功能分子，它可以同时结合靶蛋白和e3泛素连接酶，从而使连接酶和靶标紧密接近。这些双功能分子允许从连接酶复合物到靶蛋白的有效泛素转移，随后靶蛋白被蛋白酶体识别并降解。靶蛋白的这种降解通过有效降低患者细胞中所述靶蛋白的水平来提供对通过靶蛋白调节的疾病或病况的治疗。protacs的一个优点是广泛的药理活性是可能的，与来自几乎任何类别或家族的靶向蛋白的降解/抑制一致。
e3泛素连接酶(其中数百种在人中已知)赋予泛素化的底物特异性，且因此由于其对某些蛋白底物的特异性而是比一般蛋白酶体抑制剂更具吸引力的治疗靶标。e3连接酶的配体的开发已证明具有挑战性。
沙利度胺在几乎60年前首次在临床环境中使用，但仅仅最近用精巧的工作更加充分地表征其作用机制，显示其主要靶标是cereblon(crl4e3ringcullin连接酶复合物的一部分)(j.b.bartlett,k.dredge和a.g.dalgleish,nat.rev.cancer,2004,4,314-322)。在结合cereblon时，沙利度胺及其类似物泊马度胺和来那度胺(统称为imid：免疫调节药物)产生新形的表面，允许转录因子ikaros和aiolos的募集、泛素化和随后的降解。这导致il-2分泌和t细胞的刺激，并且通过该机制，imid在多发性骨髓瘤中表现出临床效力。
因此已经提出用于将靶蛋白募集至e3连接酶cereblon的protacs，参见例如wo2015/160845。
本发明人已经鉴定了激酶靶标，其能够被包含结合作为e3连接酶的cereblon的部分的protacs降解，特别是靶标：适配子-相关蛋白激酶1(aak1)、abelson鼠白血病病毒致癌基因同源物1(abl1)、auorora激酶a(aurka)、auorora激酶b(aurkb)、布鲁顿氏酪氨酸激酶(btk)、细胞周期蛋白g-相关激酶(gak)、白介素-1受体-相关激酶3(irak3)、大肿瘤抑制因子1激酶(lats1)、丝裂原-活化的蛋白激酶9(mapk9)、蛋白激酶amp-活化的α-1(prkaa1)、粘着斑激酶(ptk2)、蛋白酪氨酸激酶2β(ptk2b)、核糖体蛋白s6激酶α-1(rps6ka1)、核糖体蛋白s6激酶α-3(rps6ka3)、酪氨酸-蛋白激酶tec(tec)。
发明概述
在本发明的一个方面，提供了治疗与异常激酶活性相关的病症的方法，其中所述激酶是适配子-相关蛋白激酶1(aak1)、abelson鼠白血病病毒致癌基因同源物1(abl1)、auorora激酶a(aurka)、auorora激酶b(aurkb)、布鲁顿氏酪氨酸激酶(btk)、细胞周期蛋白g-相关激酶(gak)、白介素-1受体-相关激酶3(irak3)、大肿瘤抑制因子1激酶(lats1)、丝裂原-活化的蛋白激酶9(mapk9)、蛋白激酶amp-活化的α-1(prkaa1)、粘着斑激酶(ptk2)、蛋白酪氨酸激酶2β(ptk2b)、核糖体蛋白s6激酶α-1(rps6ka1)、核糖体蛋白s6激酶α-3(rps6ka3)、酪氨酸-蛋白激酶tec(tec)，所述方法包括降解所述激酶。
在本发明的另一个方面，提供了通过构建protac化合物或其药学上可接受的盐来降解选自以下的靶蛋白的方法：适配子-相关蛋白激酶1(aak1)、abelson鼠白血病病毒致癌基因同源物1(abl1)、auorora激酶a(aurka)、auorora激酶b(aurkb)、布鲁顿氏酪氨酸激酶(btk)、细胞周期蛋白g-相关激酶(gak)、白介素-1受体-相关激酶3(irak3)、大肿瘤抑制因子1激酶(lats1)、丝裂原-活化的蛋白激酶9(mapk9)、蛋白激酶amp-活化的α-1(prkaa1)、粘着斑激酶(ptk2)、蛋白酪氨酸激酶2β(ptk2b)、核糖体蛋白s6激酶α-1(rps6ka1)、核糖体蛋白s6激酶α-3(rps6ka3)、酪氨酸-蛋白激酶tec(tec)，其中所述protac化合物或其药学上可接受的盐包含直接或通过连接部分连接的e3连接酶结合部分和靶蛋白结合部分，因此将靶蛋白募集至e3连接酶，允许从连接酶至靶蛋白的泛素转移，使其能够被蛋白酶体识别并降解。
在本发明的另一个方面，提供了protac化合物或其药学上可接受的盐，其包含直接或通过连接部分连接的结合cereblon的部分和结合靶蛋白的部分，所述靶蛋白选自：适配子-相关蛋白激酶1(aak1)、abelson鼠白血病病毒致癌基因同源物1(abl1)、auorora激酶a(aurka)、auorora激酶b(aurkb)、布鲁顿氏酪氨酸激酶(btk)、细胞周期蛋白g-相关激酶(gak)、白介素-1受体-相关激酶3(irak3)、大肿瘤抑制因子1激酶(lats1)、丝裂原-活化的蛋白激酶9(mapk9)、蛋白激酶amp-活化的α-1(prkaa1)、粘着斑激酶(ptk2)、蛋白酪氨酸激酶2β(ptk2b)、核糖体蛋白s6激酶α-1(rps6ka1)、核糖体蛋白s6激酶α-3(rps6ka3)、酪氨酸-蛋白激酶tec(tec)。
在一个方面，提供了式(i)的化合物；
靶蛋白结合剂–接头–cereblon结合剂
(i)
或其药学上可接受的盐，其中所述靶蛋白是适配子-相关蛋白激酶1(aak1)、abelson鼠白血病病毒致癌基因同源物1(abl1)、auorora激酶a(aurka)、auorora激酶b(aurkb)、布鲁顿氏酪氨酸激酶(btk)、细胞周期蛋白g-相关激酶(gak)、白介素-1受体-相关激酶3(irak3)、大肿瘤抑制因子1激酶(lats1)、丝裂原-活化的蛋白激酶9(mapk9)、蛋白激酶amp-活化的α-1(prkaa1)、粘着斑激酶(ptk2)、蛋白酪氨酸激酶2β(ptk2b)、核糖体蛋白s6激酶α-1(rps6ka1)、核糖体蛋白s6激酶α-3(rps6ka3)、酪氨酸-蛋白激酶tec(tec)。
在本发明的另一个方面，提供了式(i)的化合物或其药学上可接受的盐，其用于疗法中。
在另一个方面，提供了式(i)的化合物或其药学上可接受的盐，其用于治疗由靶蛋白介导的病症。
在本发明的另一个方面，提供了包含式(i)的化合物或其药学上可接受的盐和一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂和赋形剂的药物组合物。
在本发明的另一个方面，提供了治疗个体中由靶蛋白介导的病症的方法，其包括施用治疗有效量的式(i)的化合物或其药学上可接受的盐。
在本发明的另一个方面，提供了式(i)的化合物或其药学上可接受的盐在制备用于治疗由靶蛋白介导的病症的药物中的用途。
在另一个方面，提供了包含式(i)的化合物或其药学上可接受的盐和至少一种其它治疗剂的组合产品。
在另一个方面，提供了包含式(i)的化合物或其药学上可接受的盐和至少一种其它治疗剂的组合产品，其用于疗法中。
在本发明的另一个方面，提供了包含组合产品和一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂和赋形剂的药物组合物，所述组合产品包含式(i)的化合物或其药学上可接受的盐和至少一种其它治疗剂。
在本发明的另一个方面，提供了包含式(i)的化合物或其药学上可接受的盐和至少一种其它治疗剂的组合产品，其用于治疗由靶蛋白介导的病症。
在另一个方面，提供了治疗由靶蛋白介导的病症的方法，其包括向需要其的人施用治疗有效量的包含式(i)的化合物或其药学上可接受的盐和至少一种其它治疗剂的组合产品。
在另一个方面，提供了包含式(i)的化合物或其药学上可接受的盐和至少一种其它治疗剂的组合产品在制备用于治疗由靶蛋白介导的病症的药物中的用途。
在另一个方面，提供了降解靶蛋白的方法，其包括向需要其的人施用治疗有效量的式(i)的化合物或其药学上可接受的盐。
发明详述
如本文所用的“本发明化合物”包括式(i)的化合物及其盐的所有溶剂化物、复合物、多晶型物、放射性标记衍生物、立体异构体、互变异构体和光学异构体。
如本文所用的术语“有效量”是指引起例如由研究人员或临床医师寻求的组织、系统、动物或人的生物学或医学反应的药物或药剂的量。此外，术语“治疗有效量”是指与未接受此类量的相应个体相比，导致疾病、病症或副作用的改进的治疗、愈合、预防或改善或疾病或病症的进展速度降低的任何量。该术语在其范围内还包括有效增强正常生理功能的量。
如本文所用的术语“药学上可接受的”是指在合理的医学判断范围内适用于与人和动物的组织接触而无过度的毒性、刺激或其它问题或并发症，与合理的利益/风险比相称的那些化合物、材料、组合物和剂型。
本发明化合物可以以固体或液体形式存在。在固体形式中，本发明化合物可以以完全无定形至完全结晶的连续固态存在。术语“无定形”是指其中该材料在分子水平上缺乏长程有序的状态，并且根据温度可以表现出固体或液体的物理性质。通常此类材料不会给出独特的x射线衍射图案，并且虽然表现出固体的性质，但更正式地被描述为液体。在加热时，发生由固体向液体性质的改变，这通过状态的改变来表征，通常为二阶(“玻璃化转变”)。术语“结晶”是指其中该材料在分子水平上具有规则的有序内部结构并给出具有限定峰的独特的x射线衍射图案的固相。此类材料在充分加热时也将表现出液体的性质，但是固体向液体的改变通过相变来表征，通常为一阶(“熔点”)。
式(i)的化合物可以以溶剂化和非溶剂化的形式存在。如本文所用的术语“溶剂化物”是指由溶质(在本发明中是式(i)的化合物或盐)和溶剂形成的可变化学计量的复合物。用于本发明目的的此类溶剂不会干扰溶质的生物活性。本领域技术人员将认识到，对于结晶化合物可以形成药学上可接受的溶剂化物，其中溶剂分子在结晶过程中并入晶格。并入的溶剂分子可以是水分子或非水性的，如乙醇、异丙醇、dmso、乙酸、乙醇胺和乙酸乙酯分子。并入水分子的晶格通常被称为“水合物”。水合物包括化学计量的水合物以及含有不同量的水的组合物。本发明包括所有此类溶剂化物。
本发明化合物可具有以超过一种形式结晶的能力，该特征被称为多晶型现象，并且要理解的是此类多晶型形式(“多晶型物”)在本发明的范围内。多晶型现象通常可响应温度或压力或二者的变化而发生，并且还可能由结晶过程的变化导致。多晶型物可以通过本领域已知的各种物理特征(如x射线衍射图案、溶解度和熔点)来区分。
还要注意的是，式(i)的化合物可以形成互变异构体。要理解的是，本发明化合物的所有互变异构体和互变异构体的混合物包括在本发明化合物的范围内。
结合靶激酶适配子-相关蛋白激酶1(aak1)、abelson鼠白血病病毒致癌基因同源物1(abl1)、auorora激酶a(aurka)、auorora激酶b(aurkb)、布鲁顿氏酪氨酸激酶(btk)、细胞周期蛋白g-相关激酶(gak)、白介素-1受体-相关激酶3(irak3)、大肿瘤抑制因子1激酶(lats1)、丝裂原-活化的蛋白激酶9(mapk9)、蛋白激酶amp-活化的α-1(prkaa1)、粘着斑激酶(ptk2)、蛋白酪氨酸激酶2β(ptk2b)、核糖体蛋白s6激酶α-1(rps6ka1)、核糖体蛋白s6激酶α-3(rps6ka3)、酪氨酸-蛋白激酶tec(tec)的化合物是本领域已知的。
在本发明的一个方面，接头是化学接头基团。
在一个方面，接头基团的最短长度为4-20个原子。
在一个方面，接头基团是4-20个碳原子的直链亚烷基，其中一个或多个碳原子被独立地选自-o-、-nh-、-n(ch3)-、-co-、哌啶、哌嗪、嘧啶、吡啶的基团替换。
在一个方面，所述接头是(在激酶结合剂-cereblon结合剂的方向上)：
其中x是-o(ch2ch2)0-4,-
且y是-conh-、-o-或-co-。
在本发明的另一个方面，所述cereblon结合部分是化合物
沙利度胺(7)、泊马度胺(8)和来那度胺(9)：
在本发明的另一个方面，提供了protac化合物，其包含通过接头与结合靶蛋白的化合物连接的式(i)的化合物，其中所述靶蛋白是适配子-相关蛋白激酶1(aak1)。
在另一个方面，所述靶蛋白是abelson鼠白血病病毒致癌基因同源物1(abl1)。
在另一个方面，所述靶蛋白是auorora激酶a(aurka)。
在另一个方面，所述靶蛋白是auorora激酶b(aurkb)。
在另一个方面，所述靶蛋白是布鲁顿氏酪氨酸激酶(btk)。
在另一个方面，所述靶蛋白是白介素-1受体-相关激酶3(irak3)。
在另一个方面，所述靶蛋白是蛋白酪氨酸激酶2β(ptk2b)。
在另一个方面，所述靶蛋白是酪氨酸-蛋白激酶tec(tec)。
在另一个方面，所述靶蛋白是细胞周期蛋白g-相关激酶(gak)。
在另一个方面，所述靶蛋白是大肿瘤抑制因子1激酶(lats1)。
在另一个方面，所述靶蛋白是粘着斑激酶(ptk2)。
在另一个方面，所述靶蛋白是核糖体蛋白s6激酶α-1(rps6ka1)。
在另一个方面，所述靶蛋白是丝裂原-活化的蛋白激酶9(mapk9)。
在另一个方面，所述靶蛋白是蛋白激酶amp-活化的α-1(prkaa1)。
在另一个方面，所述靶蛋白是核糖体蛋白s6激酶α-3(rps6ka3)。
式(i)的化合物可以为盐的形式。
通常，本发明的盐是药学上可接受的盐。涵盖在术语“药学上可接受的盐”内的盐是指本发明化合物的无毒盐。关于合适的盐的综述，参见berge等人，j.pharm.sci.1977,66,1-19。
合适的药学上可接受的盐可以包括酸加成盐。药学上可接受的酸加成盐可以通过如下方式来形成：使式(i)的化合物与合适的无机或有机酸(如氢溴酸、盐酸、硫酸、硝酸、磷酸、对甲苯磺酸、苯磺酸、甲磺酸、乙磺酸、萘磺酸如2-萘磺酸)任选在合适的溶剂如有机溶剂中反应，以得到通常例如通过结晶和过滤来分离的盐。式(i)的化合物的药学上可接受的酸加成盐可包含或是例如氢溴酸盐、盐酸盐、硫酸盐、硝酸盐、磷酸盐、对甲苯磺酸盐、苯磺酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐、萘磺酸盐(例如2-萘磺酸盐)。
其它非药学上可接受的盐，例如三氟乙酸盐，可用于例如本发明化合物的分离，并包括在本发明的范围内。
本发明在其范围内包括式(i)的化合物的所有可能的化学计量和非化学计量形式。
虽然对用于疗法而言，本发明化合物可以以原料化学品形式施用，但是本发明化合物可以以药物组合物的活性成分的形式存在。此类组合物可以以药物领域公知的方式制备，并包含至少一种活性化合物。因此，本发明进一步提供了包含本发明化合物和一种或多种药学上可接受的赋形剂的药物组合物。赋形剂(一种或多种)在与该组合物的其它成分相容的意义上必须是可接受的，并且必须对其接受者无害。根据本发明的另一个方面，还提供了制备药物组合物的方法，所述药物组合物包含药剂或其药学上可接受的盐，以及一种或多种药学上可接受的赋形剂。该药物组合物可用于治疗和/或预防本文中描述的任何病况。
通常，本发明化合物以药物有效量施用。实际施用的化合物的量通常由医师根据相关情况来确定，包括待治疗的病况、选择的施用途径、施用的实际化合物、个体患者的年龄、体重和反应、患者症状的严重程度等等。
药物组合物可以以每单位剂量含有预定量的活性成分的单位剂型存在。术语“单位剂型”是指适合作为用于人个体和其它哺乳动物的单位剂量的物理离散单位，各单位含有计算以产生所需治疗效果的预定量的活性材料，连同合适的药物赋形剂、媒介物或载体。典型的单位剂型包括预先填充、预先测量的液体组合物的安瓿或注射器，或在固体组合物的情况下的丸剂、片剂、胶囊剂等等。
优选的单位剂量组合物是含有活性成分的每日剂量或亚剂量、或其适当级分的那些组合物。此类单位剂量因此可以每天施用一次或超过一次。此类药物组合物可以通过药学领域公知的任何方法来制备。
药物组合物可以适于通过任何合适的途径施用，例如通过口服(包括颊或舌下)、直肠、吸入、鼻内、局部(包括颊、舌下或经皮)、阴道或胃肠外(包括皮下、肌内、静脉内或皮内)途径。此类组合物可以通过药学领域已知的任何方法来制备，例如使活性成分与载体(一种或多种)或赋形剂(一种或多种)结合。
适于口服施用的药物组合物可以以离散单位形式存在，如胶囊剂或片剂；粉剂或颗粒剂；在水性和非水性液体中的溶液剂或混悬剂；可食用的泡沫或搅打泡沫(whip)；或水包油液体乳剂或油包水液体乳剂。
例如，对于片剂或胶囊剂形式的口服施用，活性药物组分可以与口服无毒药学上可接受的惰性赋形剂如乙醇、甘油、水等等组合。粉剂通过将该化合物减小至合适的微细尺寸并与类似制备的药物赋形剂如可食用的碳水化合物(例如淀粉或甘露糖醇)混合来制备。也可以存在调味剂、防腐剂、分散剂和着色剂。
胶囊剂通过如上所述制备粉末混合物并填充成形的明胶鞘来制得。在填充操作之前，可以向粉末混合物中添加赋形剂，包括助流剂和润滑剂如胶体二氧化硅、滑石、硬脂酸镁、硬脂酸钙或固体聚乙二醇。也可以添加崩解剂或增溶剂如琼脂、碳酸钙或碳酸钠，以便改善胶囊剂被摄取时药物的可用性。
此外，当需要或必要时，还可以向混合物中并入赋形剂，包括合适的粘合剂、助流剂、润滑剂、甜味剂、调味剂、崩解剂和着色剂。合适的粘合剂包括淀粉、明胶、天然糖类(如葡萄糖或β-乳糖)、玉米甜味剂、天然和合成树胶(如阿拉伯树胶、黄蓍胶或藻酸钠)、羧甲基纤维素、聚乙二醇、蜡等等。这些剂型中使用的润滑剂包括油酸钠、硬脂酸钠、硬脂酸镁、苯甲酸钠、乙酸钠、氯化钠等等。崩解剂包括但不限于淀粉、甲基纤维素、琼脂、膨润土、黄原胶等等。片剂例如通过以下配制：制备粉末混合物，造粒或压块，添加润滑剂和崩解剂，和压制成片剂。粉末混合物通过以下制备：将适当粉碎的所述化合物与如上所述的稀释剂或基质和任选与粘合剂(如羧甲基纤维素、藻酸盐、明胶或聚乙烯基吡咯烷酮)、溶解阻滞剂(solutionretardant)(如石蜡)、再吸收促进剂(如季盐)和/或吸收剂(如膨润土、高岭土或磷酸二钙)混合。该粉末混合物可以通过以下造粒：用粘合剂如糖浆、淀粉糊、阿卡迪亚胶浆(acadiamucilage)或纤维素或聚合材料的溶液润湿并加压过筛。作为造粒的替代方案，该粉末混合物可以运行穿过压片机，并得到不完全形成的团块，将其打碎成颗粒。该颗粒可以通过添加硬脂酸、硬脂酸盐、滑石或矿物油来润滑以防止粘到片剂成型模具上。随后将润滑的混合物压制成片剂。本发明化合物还可以与自由流动的惰性载体混合并直接压制成片剂而不经过造粒或压块步骤。可以提供由虫胶的密封包衣、糖或聚合材料的包衣以及蜡的上光包衣组成的透明或不透明的保护包衣。可以向这些包衣中添加染料以区分不同的单位剂量。
口服流体如溶液剂、混悬剂、糖浆剂和酏剂可以以单位剂型制备，以便所给量含有预定量的化合物。糖浆剂可以通过在适当调味的水溶液中溶解化合物来制备，而酏剂通过使用无毒酒精媒介物来制备。混悬剂可以通过在无毒媒介物中分散化合物来配制。还可以添加增溶剂和乳化剂(如乙氧基化异硬脂醇和聚氧乙烯山梨糖醇醚)、防腐剂、调味添加剂(如薄荷油)或天然甜味剂或糖精或其它人造甜味剂等等。
在适当的情况下，用于口服施用的剂量单位组合物可以微胶囊化。还可以例如通过在聚合物、蜡等等中包衣或包埋颗粒材料来制备组合物以延长或维持释放。
本发明化合物还可以以脂质体递送体系的形式施用，如小单层囊泡、大单层囊泡和多层囊泡。脂质体可以由多种磷脂，如胆固醇、硬脂胺或磷脂酰胆碱来形成。
适于经皮施用的药物组合物可以以离散的贴剂形式存在，所述贴剂意在与接受者的表皮保持紧密接触达延长的时段。
适于局部施用的药物组合物可以配制成软膏、乳膏、混悬剂、洗剂、粉剂、溶液剂、糊剂、凝胶剂、喷雾剂、气雾剂或油剂。
为了治疗眼睛或其它外部组织，例如口腔和皮肤，组合物优选以局部软膏或乳膏形式施加。当配制成软膏时，活性成分可以与石蜡或水混溶性软膏基质一起使用。或者，活性成分可以与水包油乳膏基质或油包水基质一起配制成乳膏。
适于局部施用于眼睛的药物组合物包括滴眼剂，其中活性成分溶解或悬浮在合适的载体(尤其是水性溶剂)中。
适于在口腔中局部施用的药物组合物包括含片、锭剂和漱口水。
适于直肠施用的药物组合物可以栓剂、直肠泡沫、直肠凝胶剂或灌肠剂形式存在。
用于鼻或吸入施用的剂型可以方便地配制成气雾剂、溶液剂、混悬剂、滴剂、凝胶剂或干粉剂。
适于阴道施用的药物组合物可以阴道栓、卫生棉条、乳膏、凝胶剂、糊剂、泡沫或喷雾制剂形式存在。
适于胃肠外施用的药物组合物包括水性和非水性无菌注射溶液，其可以含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂以及使该组合物与预期接受者的血液等渗的溶质；以及水性和非水性无菌混悬剂，其可以包含悬浮剂和增稠剂。该组合物可以存在于单位剂量或多剂量容器中，例如密封的安瓿和小瓶，并可以在冷冻干燥(冻干)条件储存，在临使用前仅需要添加无菌液体载体(例如注射用水)。即时注射溶液和混悬剂可以由无菌粉末、颗粒和片剂来制备。
要理解的是，除了上文特别提及的成分之外，该组合物可以包含就相关制剂类型而言在本领域中常规的其它试剂，例如适于口服施用的那些可以包含调味剂。
在一个方面，该药物组合物适于口服或直肠施用，以便非全身性或局部递送至胃肠道，或配制用于皮下递送。
药剂的治疗有效量将取决于许多因素，包括例如，个体的年龄和体重，需要治疗的确切病况及其严重程度，制剂的性质，以及施用途径，并最终将由监护医师或兽医自主决定。特别地，待治疗的个体是哺乳动物，特别是人。
式(i)的化合物及其药学上可接受的盐可以单独使用，或与其它治疗剂组合使用。式(i)的化合物及其药学上可接受的盐和其它药物活性剂(一种或多种)可以一起或单独施用，并且当单独施用时，可以同时施用或以任意次序顺序施用，通过任何方便的途径以单独或组合的药物组合物的形式施用。
对式(i)的化合物(一种或多种)或其药学上可接受的盐(一种或多种)和其它药物活性剂(一种或多种)的量和施用的相对时间安排进行选择以实现所需组合治疗效果。本发明化合物和其它治疗剂(一种或多种)可以通过在包含两种化合物的单一药物组合物中同时施用来组合使用。或者，组合产品可以在单独的药物组合物(各药物组合物包含化合物之一)中以顺序方式单独施用，其中，例如首先施用本发明化合物并接着施用另一化合物，并且反之亦然。此类顺序施用可以在时间上接近(例如同时)或在时间上远离。此外，无所谓该化合物是否以相同的剂型施用，例如一种化合物可以局部施用，而另一种化合物可以口服施用。适宜地，两种化合物均口服施用。
组合产品可以作为组合试剂盒存在。如本文所用的术语“组合试剂盒”或“多部分试剂盒”是指用于施用本发明的组合产品的一种或多种药物组合物。当两种化合物同时施用时，该组合试剂盒可以含有在单一药物组合物(如片剂)中或在单独的药物组合物中的两种化合物。当化合物并非同时施用时，该组合试剂盒将含有在单一包装中的单独药物组合物中或在单独包装中的单独药物组合物中的各化合物。
该组合试剂盒还可以通过说明书提供，如剂量和施用说明书。此类剂量和施用说明书可以是提供给医生的类型，例如通过药品标签，或者它们可以是由医生提供的类型，例如给患者的说明书。
当组合产品以顺序方式单独施用时(其中首先施用一种并接着施用另一种，或反之亦然)，此类顺序施用可以在时间上接近或在时间上远离。例如，包括在第一种药剂施用后几分钟至几十分钟施用另一药剂，以及在第一种药剂施用后几小时至几天施用另一药剂，其中时间间隔不受限制，例如，一种药剂可以每天施用一次，而另一种药剂可以每天施用2或3次，或者一种药剂可以每周施用一次，而另一种药剂可以每天施用一次等等。
本领域技术人员将清楚，在适当的情况下，其它治疗成分(一种或多种)可以以盐的形式(例如作为碱金属或胺盐或作为酸加成盐)、或前药的形式、或作为酯(例如低级烷基酯)、或作为溶剂化物(例如水合物)来使用，以优化该治疗成分的活性和/或稳定性和/或物理特征(如溶解度)。还将清楚的是，在适当的情况下，该治疗成分可以以光学纯的形式使用。
当在同一组合物中组合时，要理解的是两种化合物必须是稳定的，并且彼此相容且与该组合物的其它组分相容，并可以配制用于施用。当单独配制时，它们可以以任何方便的组合物形式提供，方便地以本领域中对此类化合物已知的方式提供。
当式(i)的化合物与针对相同的疾病、病况或病症有活性的第二治疗剂组合使用时，各化合物的剂量可以不同于单独使用该化合物时的剂量。本领域技术人员将容易了解适当的剂量。
在一个实施方案中，本发明的方法和用途中的哺乳动物是人。
我们已发现含有cereblon的本发明的protac化合物或其药学上可接受的盐或含有它们的药物组合物能够降解靶蛋白。
因此，预期本发明化合物是治疗由靶蛋白单独或部分介导的疾病或医学病况的潜在有用药剂。
本文提供了治疗或预防由靶蛋白介导的疾病、病症和病况的方法。一种方法可以包括向个体例如需要其的个体施用治疗有效量的本发明化合物。
因此，在一个方面，提供了用于疗法的本发明化合物。
因此，在一个方面，提供了用于治疗由靶蛋白介导的病症的本发明化合物。
因此，在一个方面，提供了本发明化合物在制备用于治疗由靶蛋白介导的病症的药物中的用途。
在另一个方面，提供了治疗哺乳动物中由靶蛋白介导的病症的方法，其包括施用治疗有效量的本发明化合物。
如本文所用的由靶蛋白介导的病症表示可通过调节个体中靶蛋白的功能或活性来治疗的病况或病症，其中治疗包括预防、部分缓解或治愈病况或病症。调节可以局部发生，例如发生在个体的某些组织内，或者更广泛地发生在正针对这种病况或病症进行治疗的整个个体中。
药剂的治疗有效量将取决于许多因素，包括例如，个体的年龄和体重，需要治疗的确切病况及其严重程度，制剂的性质，以及施用途径，并最终将由监护医师或兽医自主决定。特别地，待治疗的个体是哺乳动物，特别是人。
该药剂可以以每日剂量施用。该量可以以每天单一剂量给予，或更通常以每天多个(如两个、三个、四个、五个或六个)分剂量给予，以使得每日总剂量相同。
适宜地，根据本发明施用的本发明的化合物的量将是选自每天0.01mg至1g的量(作为游离或未盐化化合物计算)。
式(i)的化合物及其药学上可接受的盐可以单独使用，或与其它治疗剂组合使用。式(i)的化合物及其药学上可接受的盐和其它药物活性剂(一种或多种)可以一起或单独施用，并且当单独施用时，可以同时施用或以任意次序顺序施用，通过任何方便的途径以单独或组合的药物组合物的形式施用。
对式(i)的化合物(一种或多种)或其药学上可接受的盐(一种或多种)和其它药物活性剂(一种或多种)的量和施用的相对时间安排进行选择以实现所需组合治疗效果。本发明化合物和其它治疗剂(一种或多种)可以通过在包含两种化合物的单一药物组合物中同时施用来组合使用。或者，组合产品可以在单独的药物组合物(各药物组合物包含化合物之一)中以顺序方式单独施用，其中，例如首先施用本发明化合物并接着施用另一化合物，并且反之亦然。此类顺序施用可以在时间上接近(例如同时)或在时间上远离。此外，无所谓该化合物是否以相同的剂型施用，例如一种化合物可以局部施用，而另一种化合物可以口服施用。适宜地，两种化合物均口服施用。
组合产品可以作为组合试剂盒存在。如本文所用的术语“组合试剂盒”或“多部分试剂盒”是指用于施用本发明的组合产品的一种或多种药物组合物。当两种化合物同时施用时，该组合试剂盒可以含有在单一药物组合物(如片剂)中或在单独的药物组合物中的两种化合物。当化合物并非同时施用时，该组合试剂盒将含有在单一包装中的单独药物组合物中或在单独包装中的单独药物组合物中的各化合物。
该组合试剂盒还可以通过说明书提供，如剂量和施用说明书。此类剂量和施用说明书可以是提供给医生的类型，例如通过药品标签，或者它们可以是由医生提供的类型，例如给患者的说明书。
当组合产品以顺序方式单独施用时(其中首先施用一种并接着施用另一种，或反之亦然)，此类顺序施用可以在时间上接近或在时间上远离。例如，包括在第一种药剂施用后几分钟至几十分钟施用另一药剂，以及在第一种药剂施用后几小时至几天施用另一药剂，其中时间间隔不受限制，例如，一种药剂可以每天施用一次，而另一种药剂可以每天施用2或3次，或者一种药剂可以每周施用一次，而另一种药剂可以每天施用一次等等。
本领域技术人员将清楚，在适当的情况下，其它治疗成分(一种或多种)可以以盐的形式(例如作为碱金属或胺盐或作为酸加成盐)、或前药的形式、或作为酯(例如低级烷基酯)、或作为溶剂化物(例如水合物)来使用，以优化该治疗成分的活性和/或稳定性和/或物理特征(如溶解度)。还将清楚的是，在适当的情况下，该治疗成分可以以光学纯的形式使用。
当在同一组合物中组合时，要理解的是两种化合物必须是稳定的，并且彼此相容且与该组合物的其它组分相容，并可以配制用于施用。当单独配制时，它们可以以任何方便的组合物形式提供，方便地以本领域中对此类化合物已知的方式提供。
当式(i)的化合物与针对相同的疾病、病况或病症有活性的第二治疗剂组合使用时，各化合物的剂量可以不同于单独使用该化合物时的剂量。本领域技术人员将容易了解适当的剂量。
在一个实施方案中，本发明的方法和用途中的哺乳动物是人。
本发明化合物可特别用于治疗激酶介导的病症，特别是炎性病症、许多癌症和其它增殖性疾病。
在一个方面，该病症是炎症。
炎症代表一组对创伤的血管、细胞和神经反应。炎症的特征可以为炎性细胞如单核细胞、中性粒细胞和粒细胞向组织中的移动。这通常与降低的内皮屏障功能和水肿进入组织相关。炎症可以分类为急性或慢性。急性炎症是机体对有害刺激的最初反应，并通过提高的血浆和白细胞从血液进入损伤组织的移动来实现。生化事件的级联传播并使该炎性反应成熟，涉及局部血管系统、免疫系统和损伤组织内的各种细胞。持续的炎症(称为慢性炎症)导致炎症部位处存在的细胞类型的逐渐改变，并且特征在于来自炎症过程的组织的同时破坏和愈合。
当作为对感染的免疫反应的一部分或作为对创伤的急性反应发生时，炎症可能是有益的，并通常是自限性的。但是，炎症在各种的条件下可能是有害的。这包括响应感染病原体而产生过度的炎症，这会导致显著的器官损伤和死亡(例如在败血症的情况下)。此外，慢性炎症通常是有害的，并且是许多慢性疾病的根源，对组织造成严重和不可逆的损伤。在此类情况下，免疫反应通常针对自身组织(自身免疫)，尽管对外来实体的慢性反应也可能导致对自身组织的旁观者损伤(bystanderdamage)。
抗炎疗法的目的因此是减轻这种炎症，当存在时抑制自身免疫并允许生理过程或愈合和组织修复得以进展。
式(i)的化合物可用于治疗下文例举的身体的任何组织和器官的炎症，包括肌肉骨骼炎症、血管炎症、神经炎症、消化系统炎症、眼部炎症、生殖系统炎症和其它炎症。
肌肉骨骼炎症是指肌肉骨骼系统的任何炎性病况，特别是影响骨骼关节(包括手、腕、肘、肩、颚、脊柱、颈、髋、膝、踝和脚的关节)的那些病况，以及影响将肌肉连接到骨的组织(如肌腱)的病况。可以用式(i)的化合物治疗的肌肉骨骼炎症的实例包括关节炎(包括例如骨关节炎、类风湿性关节炎、牛皮癣性关节炎、强直性脊柱炎、急性和慢性感染性关节炎、与痛风和假性痛风相关的关节炎，以及幼年特发性关节炎)、肌腱炎、滑膜炎、腱鞘炎、粘液囊炎、纤维组织炎(纤维肌痛)、上髁炎、肌炎和骨炎(包括例如佩吉特氏病、耻骨骨炎和囊性纤维性骨炎)。
眼部炎症是指任何眼睛结构(包括眼睑)的炎症。可以用式(i)的化合物治疗的眼部炎症的实例包括睑炎、睑皮松弛症、结膜炎、泪腺炎、角膜炎、干燥性角膜结膜炎(干眼)、巩膜炎、倒睫症和葡萄膜炎。
可以用式(i)的化合物治疗的神经系统炎症的实例包括脑炎、格林-巴利综合征、脑膜炎、神经性肌强直、昏睡病、多发性硬化症、脊髓炎和精神分裂症。
可以用式(i)的化合物治疗的脉管系统或淋巴系统的炎症的实例包括关节硬化、关节炎、静脉炎、血管炎和淋巴管炎。
可以用式(i)的化合物治疗的消化系统的炎性病况的实例包括胆管炎、胆囊炎、肠炎、小肠结肠炎、胃炎、胃肠炎、炎性肠病(如克罗恩病和溃疡性结肠炎)、回肠炎和直肠炎。
可以用式(i)的化合物治疗的生殖系统的炎性病况的实例包括宫颈炎、绒毛膜羊膜炎、子宫内膜炎、附睾炎、脐炎、卵巢炎、睾丸炎、输卵管炎、输卵管卵巢脓肿、尿道炎、阴道炎、外阴炎和外阴痛。
式(i)的化合物可用于治疗具有炎性组分的自身免疫病况。此类病况包括急性播散性广泛性脱发、贝切特氏病、恰加斯氏病、慢性疲乏综合征、自主神经机能异常、脑脊髓炎、强直性脊柱炎、再生障碍性贫血、化脓性汗腺炎、自身免疫性肝炎、自身免疫性卵巢炎、乳糜泻、克罗恩病、i型糖尿病、巨细胞动脉炎、古德帕斯彻氏综合征、格雷夫斯病、格林-巴利综合征、桥本氏病、过敏性紫癜、川畸氏病、红斑狼疮、显微镜下结肠炎、显微镜下多发性血管炎、混合性结缔组织病、多发性硬化症、重症肌无力、眼阵挛-肌阵挛综合征、视神经炎、奥德氏甲状腺炎、天疱疮、结节性多动脉炎、多肌痛、类风湿性关节炎、莱特尔氏综合征、斯耶格伦氏综合征、颞动脉炎、韦格纳氏肉芽肿病、温热自身免疫性溶血性贫血、间质性膀胱炎、莱姆病、硬斑病、牛皮癣、肉样瘤病、硬皮病、溃疡性结肠炎和白癫风。
式(i)的化合物可用于治疗具有炎性组分的t细胞介导的超敏反应疾病。此类病况包括接触性超敏反应、接触性皮炎(包括毒葛造成的接触性皮炎)、荨麻疹、皮肤过敏、呼吸系统过敏(花粉热、过敏性鼻炎)和谷蛋白敏感性肠病(乳糜泻)。
可以用该药剂治疗的其它炎性病况包括例如阑尾炎、皮炎、皮肌炎、心内膜炎、纤维组织炎、齿龈炎、舌炎、肝炎、化脓性汗腺炎、虹膜炎、喉炎、乳腺炎、心肌炎、肾炎、耳炎、胰腺炎、腮腺炎、心包炎、腹膜炎、咽炎、胸膜炎、肺炎、前列腺炎、肾盂肾炎和口腔炎、移植排斥(涉及器官如肾、肝、心、肺、胰腺(例如胰岛细胞)、骨髓、角膜、小肠、皮肤同种异体移植物、皮肤同种移植物和心脏瓣膜异种移植物、血清病以及移植物抗宿主病)、急性胰腺炎、慢性胰腺炎、急性呼吸窘迫综合征、塞扎里综合征、先天性肾上腺增生、非化脓性甲状腺炎、与癌症相关的高钙血症、天疱疮、大疱疱疹性皮炎、重症多形红斑、剥脱性皮炎、脂溢性皮炎、季节性或常年过敏性鼻炎、支气管哮喘、接触性皮炎、特异性皮炎、药物超敏反应、过敏性结膜炎、角膜炎、眼部带状疱疹、虹膜炎和虹膜睫状体炎、脉络膜视网膜炎、视神经炎、症状性结节病、暴发性或播散性肺结核化疗、成人特发性血小板减少性紫癜、成人继发性血小板减少症、获得性(自身免疫性)溶血性贫血、成人白血病和淋巴瘤、儿童急性白血病、局限性回肠炎、自身免疫性血管炎、多发性硬化症、慢性阻塞性肺病、实体器官移植排斥反应、败血症。优选的治疗包括治疗移植排斥、类风湿性关节炎、牛皮癣性关节炎、多发性硬化症、i型糖尿病、哮喘、炎性肠病、系统性红斑狼疮、牛皮癣、慢性阻塞性肺病和伴随感染病况的炎症(例如败血症)。
治疗激酶介导的疾病或病症，或者更广泛而言，治疗免疫介导的疾病，包括但不限于过敏性疾病，自身免疫疾病，预防移植排斥等等可以使用本发明的化合物作为单一疗法，或在采用或包含一种或多种其它治疗剂(例如选自nsaids、皮质类固醇、cox-2抑制剂、细胞因子抑制剂、抗tnf剂、抑制剂制瘤素m、抗疟疾剂、免疫抑制剂和细胞抑制剂)的双重或多重组合疗法中实现。
在一个方面，该病症是癌症。
其中式(i)的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物可具有潜在有益抗肿瘤作用的癌症疾病和病况的实例包括但不限于肺、骨、胰腺、皮肤、头、颈、子宫、卵巢、胃、结肠、乳腺、食道、小肠、肠、内分泌系统、甲状腺、甲状旁腺、肾上腺、尿道、前列腺、阴茎、睾丸、输尿管、膀胱、肾或肝的癌症；直肠癌；肛门癌；输卵管、子宫内膜、宫颈、阴道、外阴、肾盂、肾细胞的癌；软组织肉瘤；粘液瘤；横纹肌瘤；纤维瘤；脂肪瘤；畸胎瘤；胆管癌；肝母细胞瘤；血管肉瘤；血管瘤；肝细胞瘤；纤维肉瘤；软骨肉瘤；骨髓瘤；慢性或急性白血病；淋巴细胞淋巴瘤；原发性cns淋巴瘤；cns瘤；脊柱轴肿瘤(spinalaxistumour)；鳞状细胞癌；滑膜肉瘤；恶性胸膜间皮瘤；脑干胶质瘤；垂体腺瘤；支气管腺瘤；软骨瘤性错构瘤；内皮瘤；霍奇金病或一种或多种前述癌症的组合。在一个方面，癌症是乳腺癌。
本发明化合物还可用于治疗一种或多种哺乳动物患有的疾病，其特征在于与新血管形成和/或血管通透性有关的病症区域中的细胞增殖，包括血管增殖性病症，包括关节炎(类风湿性关节炎)和再狭窄；纤维化病症，包括肝硬化和动脉粥样硬化；系膜细胞增殖性病症，包括肾小球肾炎、糖尿病性肾病、恶性肾硬化、血栓性微血管病综合征、增殖性视网膜病、器官移植排斥和肾小球病；和代谢病症，包括牛皮癣、糖尿病、慢性伤口愈合、炎症和神经退行性疾病。
在一个实施方案中，式(i)的化合物或其药学上可接受的盐可以与癌症治疗的其它治疗方法一起使用。特别地，在抗肿瘤疗法中，设想了与除上述那些之外的其它化学治疗剂、激素、抗体药剂以及手术和/或放射治疗的组合疗法。
在一个实施方案中，其它抗癌疗法是手术和/或放射疗法。
在一个实施方案中，其它抗癌疗法是至少一种另外的抗肿瘤剂。
可以在组合产品中使用任何对正在治疗的敏感肿瘤具有活性的抗肿瘤剂。可用的典型抗肿瘤剂包括但不限于抗微管剂，如二萜类化合物和长春花生物碱；铂配位络合物；烷化剂，如氮芥、氧氮磷杂环己烷、烷基磺酸酯、亚硝基脲和三氮烯；抗生素药剂，如蒽环霉素、放线菌素和博来霉素；拓扑异构酶ii抑制剂，如表鬼臼毒素；抗代谢物，如嘌呤和嘧啶类似物和抗叶酸化合物；拓扑异构酶i抑制剂，如喜树碱；激素和激素类似物；信号转导途径抑制剂；非受体酪氨酸血管生成抑制剂；免疫治疗剂；促凋亡剂；和细胞周期信号传导抑制剂。
在另一个方面，提供了包含组合产品以及一种或多种药学上可接受的赋形剂的药物组合物，所述组合产品包含式(i)的化合物或其药学上可接受的盐和至少一种可用于治疗由靶蛋白抑制介导的疾病的其它治疗剂。
一般合成方法
通式(i)的化合物可以通过有机合成领域中已知的方法来制备。在所有方法中，充分理解的是根据一般化学原理，在必要的时候可以对敏感或反应性基团采用保护基团。根据有机合成的标准方法(t.w.green和p.g.m.wuts(1999)protectivegroupsinorganicsynthesis,第3版,johnwiley&sons)操作保护基团。在化合物合成的方便阶段，使用对本领域技术人员显而易见的方法除去这些基团。方法以及反应条件及其执行顺序的选择应当与式(i)的化合物的制备一致。
特别地，制备本发明中包括的cereblon化合物的方法可以在wo2016024286中找到或商业可得。
各种cereblonprotac合成
如wo2013/75167a1(或rscadv.,2015,5,93433–93437)所述制备各种激酶结合剂。
14-(4-(4-((5-氯-4-((2-(甲基氨基甲酰基)苯基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)哌嗪-1-基)-3,6,9,12-四氧杂十四烷-1-酸
将2-((5-氯-2-((4-(哌嗪-1-基)苯基)氨基)嘧啶-4-基)氨基)-n-甲基苯甲酰胺(150mg,0.343mmol)、14-氯-3,6,9,12-四氧杂十四烷酸甲酯(117mg,0.411mmol)、碘化钠(52mg,0.347mmol)和二异丙胺(0.179ml,1.03mmol)于dmf(2.5ml)中的溶液在100℃下加热24h。将混合物用n-buoh(15ml)和水(30ml)稀释，然后分离各相。将水溶液用n-buoh(15ml)反萃取，然后将有机层合并并在真空中蒸发。将残余物溶解于meoh(5ml)中，然后添加lioh(82mg,3.43mmol)于水(1ml)中的溶液，并将混合物在室温下搅拌2h。将反应混合物在真空中蒸发，然后溶解于最少的dmso中，并通过反相(c18)色谱法使用0-50％乙腈-水(+0.1%碳酸氢铵改性剂)梯度经12个柱体积进行纯化。将合适的级分合并并在真空中蒸发，以得到作为金色固体的所需产物(153mg，67%产率)。
lcms(高ph改性剂)(es+ve)m/z672.2(m+h)+rt0.78min(>95%纯)。
14-(4-(4-((5-氯-4-((2-(甲基氨基甲酰基)苯基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)哌嗪-1-基)-n-(2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-4-基)-3,6,9,12-四氧杂十四烷-1-酰胺甲酸盐
向14-(4-(4-((5-氯-4-((2-(甲基氨基甲酰基)苯基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)哌嗪-1-基)-3,6,9,12-四氧杂十四烷酸(109mg,0.162mmol)、3-(4-氨基-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮(46.2mg,0.178mmol)和二异丙胺(0.085ml,0.486mmol)于dmf(1.5ml)中的搅拌溶液中添加hatu(74.0mg,0.195mmol)，并将混合物在室温下搅拌1h。将反应混合物通过质量定向自动纯化(甲酸改性剂梯度)直接纯化，然后在氮气流下浓缩适当的级分以得到作为黄色固体的所需产物(57mg，37％产率)。
lcms(甲酸改性剂)(es+ve)m/z913.3(m–甲酸盐)+rt0.60min(>95%纯)
lcms(高ph改性剂)(es+ve)m/z1116.4(m+h)+rt1.35min(>95%)。
用于表达蛋白质组学实验的细胞处理
将thp-1细胞以3x106个细胞的浓度接种在含60ml生长培养基(rpmi1640+10%fbs)的t175烧瓶中。添加6μl在生长培养基中制备的10x化合物溶液(dmso),cereblon_protac)，并将细胞在37℃，5%co2下处理指定的时间点(6或24h)。为了收获，将细胞收集到冰上的falcon管中，离心并在冷pbs(lifetechnologies)中洗涤两次。在最后的洗涤步骤后，除去上清液，并将沉淀物在液氮中速冻并储存在-80℃，并在2%sds中在95℃下在恒温混匀仪(thermomixer,thermofisherscientific)中裂解3min，然后用benzonase在37℃消化dna1.5h。通过离心澄清裂解物，通过bca试验测定上清液中的蛋白浓度。将蛋白通过dtt还原并用碘乙酰胺烷基化，并在4-12%nupage(invitrogen)上分离，并用胶体考马斯染色(becher,i.等人chemoproteomicsrevealstime-dependentbindingofhistonedeacetylaseinhibitorstoendogenousrepressorcomplexes.acschem.biol.9,1736–1746(2014))，然后进行胰蛋白酶消化和质谱分析(参见下文)。
kinobeads试验
通过使用修饰的珠基质进行竞争结合试验。(bantscheff,m.等人quantitativechemicalproteomicsrevealsmechanismsofactionofclinicalablkinaseinhibitors.natbiotech25,1035–1044(2007)，werner,t.等人high-resolutionenabledtmt8-plexing.anal.chem.84,7188–7194(2012)，bergamini,g.等人aselectiveinhibitorrevealspi3kγdependenceofth17celldifferentiation.natchembiol8,576–582(2012))。
简言之，将1ml(5mg蛋白)细胞提取物与测试化合物或媒介物一起在4℃预温育45min，然后与kinobeads(每个样品35μl珠)一起在4℃温育1小时。通过用dp缓冲液(50mmtris-hcl，0.8%(v/v)igepal-ca630，5%(v/v)甘油，150mmnacl，1.5mmmgcl2，25mmnaf，1mm钒酸钠，1mm二硫苏糖醇，不含edta的完全蛋白酶抑制剂片剂(roche),ph7.5)洗涤珠除去未结合的级分。用50μl2×sds样品缓冲液洗脱保留的蛋白。将蛋白用200mg/ml碘乙酰胺烷基化30min，在4–12%nupage(invitrogen)上部分分离，并用胶体考马斯染色。在20、5、0.31、0.078、0.020、0.005μm测试cereblon_protac，并在10、2.5、0.63、0.16、0.04、0.01、0.0024µm测试各种激酶-结合剂。
用于ms的样品制备
将凝胶泳道切成三片，覆盖整个分离范围(~2cm)并进行胶内消化(bantscheff,m.等人quantitativechemicalproteomicsrevealsmechanismsofactionofclinicalablkinaseinhibitors.natbiotech25,1035–1044(2007))。用10-plextmt(tmt10,thermofisherscientific,waltham,ma)试剂标记肽样品，使得能够在单一实验中对宽范围的10种条件进行相对定量。标记反应在22℃在40mm三乙基碳酸氢铵，ph8.53中进行，并用羟胺淬灭。每个实验将标记的肽提取物合并成单一样品，并在ultimate3000(dionex,sunnyvale,ca)上通过使用反相色谱在ph12[1mmxbridge柱(waters,milford,ma)]进行另外的分级分离，如kruse,u.等人chemoproteomics-basedkinomeprofilingandtargetdeconvolutionofclinicalmulti-kinaseinhibitorsinprimarychroniclymphocyticleukemiacells.leukemia25,89–100(2011)中所述。
lc-ms/ms分析
将样品真空干燥并重悬于0.05%三氟乙酸/水中。样品中，将50%注射到与qexactivehf(thermofisherscientific)偶联的ultimate3000nanorlsc(dionex,sunnyvale,ca)中。在60℃下，在含0.05%tfa的水中，在5mmx300µmc18柱(pepmap100,5µm,300å,thermofisherscientific)上捕获肽。在55℃下在定制的50cm×100μm(id)反相柱(reprosil)上进行分离。经2小时，进行从2%乙腈至40%乙腈(于0.1%甲酸和3.5%dmso中)的梯度洗脱。将样品在线注射入用依赖于数据的前10方法操作的q-exactivehf质谱仪。通过使用60.000分辨率和3×106的离子靶获得ms谱。使用35%nce以30.000分辨率(m/z200)进行更高能量碰撞解离(hcd)扫描，并且将离子靶设置设定为2×105以避免聚结(werner,t.等人ioncoalescenceofneutronencodedtmt10-plexreporterions.anal.chem.86,3594–3601(2014)。
使用tune2.5和xcalibur3.0.63操作仪器。
肽和蛋白鉴定
基于cox等人cox,j.,michalski,a.&mann,m.softwarelockmassbytwo-dimensionalminimizationofpeptidemasserrors.journaloftheamericansocietyformassspectrometry22,1373–1380(2011)描述的方法，使用软件锁定质量，将mascot2.5.1(matrixscience,boston,ma)用于蛋白鉴定。
对肽前体(质量容差为30ppm)和碎片离子(质量容差为30md(hcd))进行第一次搜索，然后使用重新校准的数据对肽前体(质量容差为10ppm)和碎片离子(质量容差为20md(hcd))进行最终搜索。将半胱氨酸残基的脲甲基化和赖氨酸残基的tmt修饰设定为固定修饰，并将蛋白的甲硫氨酸氧化和n-末端乙酰化以及肽n-末端的tmt修饰设定为可变修饰。搜索数据库由国际蛋白索引(internationalproteinindex)蛋白序列数据库的定制版本与使用matrixscience提供的脚本创建的该数据库的诱饵版本的组合组成。除非另有说明，否则我们接受如下蛋白鉴定：(i)对于单谱至序列分配，我们要求此分配是最佳匹配，并且最小mascot得分为31，且10×该分配与下一个最佳分配的差异。基于这些标准，诱饵搜索结果表明<1%的错误发现率(fdr)。(ii)对于多重谱至序列分配并使用相同的参数，诱饵搜索结果表明<0.1%的fdr。
肽和蛋白定量
从原始数据中读取报告离子强度，并乘以离子累积时间(单位为毫秒)，以产生与离子数成正比的量度；bantscheff,m.等人chemoproteomicsprofilingofhdacinhibitorsrevealsselectivetargetingofhdaccomplexes.natbiotech29,255–265(2011)。该量度称为离子面积。savitski,m.m.等人delayedfragmentationandoptimizedisolationwidthsettingsforimprovementofproteinidentificationandaccuracyofisobaricmasstagquantificationonorbitrap-typemassspectrometers.analyticalchemistry83,8959–8967(2011)。根据以下标准过滤与肽匹配的谱：mascot离子得分>15，前体离子的信号背景比>4，并且信号干扰比>0.5。savitski,m.m.等人targeteddataacquisitionforimprovedreproducibilityandrobustnessofproteomicmassspectrometryassays.journaloftheamericansocietyformassspectrometry21,1668–1679(2010)。
如所述，对同位素纯度校正倍数变化，并如由信号干扰比量度所估计，针对共洗脱近同量异位素峰引起的干扰调整倍数变化。savitski,m.m.等人measuringandmanagingratiocompressionforaccurateitraq/tmtquantification.journalofproteomeresearch12,3586–3598(2013)。通过使用基于总和的自举算法，从与不同肽匹配的单个谱得到蛋白定量；计算用超过三个谱定量的所有蛋白倍数变化的95%置信区间，savitski,m.m.等人delayedfragmentationandoptimizedisolationwidthsettingsforimprovementofproteinidentificationandaccuracyofisobaricmasstagquantificationonorbitrap-typemassspectrometers.analyticalchemistry83,8959–8967(2011)。
仅对具有至少2个定量的独特肽匹配的蛋白报告了蛋白倍数变化。如前所述，使用r(http://www.r-project.org/)和drc套件包(http://www.bioassay.dk)拟合剂量-反应曲线。bantscheff,m.等人quantitativechemicalproteomicsrevealsmechanismsofactionofclinicalablkinaseinhibitors.natbiotech25,1035–1044(2007)。
使用cheng-prusoff关系，对固定化配体对结合平衡的影响校正所有测量的半数最大抑制浓度(ic50)值。sharma,k.等人proteomicsstrategyforquantitativeproteininteractionprofilingincellextracts.natmeth6,741–744(2009)。sharma,k.等人proteomicsstrategyforquantitativeproteininteractionprofilingincellextracts.natmeth6,741–744(2009)。
统计学分析
将定量蛋白分成箱。根据定量谱序列匹配的数量构建箱。每个箱由至少300个蛋白组成。每个箱一旦已完成，就计数剩余的蛋白数量；如果此数字低于300，则将剩余的蛋白添加到最后完成的箱中。这种依赖于数据质量的分箱策略类似于cox等人savitski,m.m.等人delayedfragmentationandoptimizedisolationwidthsettingsforimprovementofproteinidentificationandaccuracyofisobaricmasstagquantificationonorbitrap-typemassspectrometers.analyticalchemistry83,8959–8967(2011)描述的程序。蛋白倍数变化差异的统计学显著性如下计算：使用利用标准偏差的稳健估计(使用15.87、50和84.13百分位数)的z-检验，并计算具体箱的所有测量值的p值，正如先前所描述的cox,j.&mann,m.maxquantenableshighpeptideidentificationrates,individualizedp.p.b.-rangemassaccuraciesandproteome-wideproteinquantification.natbiotech26,1367–1372(2008)。随后，通过使用benjamini-hochberg(bh)校正对每个比较进行多重假设检验的调整。benjamini,y.&hochberg,y.controllingthefalsediscoveryrate:apracticalandpowerfulapproachtomultipletesting.journaloftheroyalstatisticalsociety.seriesb(methodological)57,289–300(1995)。最后，当具有≤0.05的p值，并且在至少1次重复中蛋白表达变化50%时，蛋白被计为受调节的。