蛋白质表达增强子序列及其用途的制作方法

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背景技术：
：：以下对本发明背景的论述仅为帮助读者理解本发明而提供，而不是承认其描述或构成本发明的现有技术。根据定义，病原性生物能够在受感染宿主中引起疾病。为在临床上使用此类生物体，通常会设计减毒疫苗株，虽然其表现出毒力减小或消除，但仍然保持足以刺激针对一种或多种目标病原体或异种抗原的所需免疫应答的活力。在包括感染性疾病和恶性疾病在内的许多实验模型中已证实减毒载体平台会引起对编码的异种抗原具有特异性的保护性应答。尽管大多数减毒疫苗载体是病毒性的，但已开发了细菌疫苗载体平台，用于预防与治疗应用。现可获得许多另外病原性细菌的减毒菌株，并且容易对产生重组菌株进行操纵提供一种使用细菌作为许多外源蛋白(诸如与感染性疾病和癌症相关的抗原)的有效递送媒介物的方式。尤其已由李斯特菌属(listeria)菌种、埃希氏菌属(escherichia)菌种、沙门氏菌属(salmonella)菌种、志贺氏菌属(shigella)菌种、乳杆菌属(lactobacillus)菌种及耶尔森氏菌属(yersinia)菌种开发了活的减毒细菌疫苗株。调节异种抗原表达水平可对疫苗的免疫原性具有重要影响。在细菌疫苗载体中，编码疫苗抗原的异种基因可整合到细菌染色体中或者从质粒表达。染色体整合允许最大限度的遗传稳定性。然而，染色体整合通常每种细菌产生单拷贝异种抗原，并且确保表达足够抗原以赋予保护性免疫具有挑战性。在基于质粒的表达中，质粒的自发损失可产生质粒较少的细菌，这些细菌快速生长超过带有质粒的细菌且变成组织中的优势群体。本领域中仍然需要提供可提供具有有利异种抗原表达水平的细菌疫苗株以用于治疗或预防疾病的系统和方法。技术实现要素：本发明提供增强宿主细胞且特别是细菌菌种对融合蛋白的表达的核酸和蛋白质序列，及其使用方法。虽然在下文中是根据单核细胞增多性李斯特菌对融合蛋白的表达进行描述，但本发明可通用于融合蛋白的表达。在第一方面中，本发明涉及融合蛋白、编码所述融合蛋白的核酸分子以及由核酸分子表达所述融合蛋白的方法，其中所述融合蛋白具有以下结构：a-(b)n-c或a-c-(b)n，其中：a为包含分泌信号序列的氨基酸序列的第一多肽序列；各b独立地为第二多肽，该第二多肽的序列包含esnqsvedkhnefmltey(seqidno:1)或pasravddhhaqfllsek(seqidno:37)或与其具有至少90％同一性或同源性的序列，或其具有1-5个保守性氨基酸置换的序列；并且c为包含目标多肽的氨基酸序列，诸如抗原序列的第三多肽序列；并且n为介于1与10之间，并且优选介于2与5之间的数。在第一方面的一些实施方案中，a用肽键连接至(b)n或c，并且(b)n用肽键连接至c，或各连接独立地为一个或多个氨基酸。在一些实施方案中，其中融合蛋白为a-(b)n-c，a的羧基末端用肽键或用一个或多个氨基酸，例如1-100个、1-50个、1-20个、1-10个、1-9个、1-8个、1-7个、1-6个、1-5个、1-4个、1-3个、1-2个或1个氨基酸连接至(b)n的氨基末端，并且(b)n的羧基末端用肽键或用一个或多个氨基酸，例如1-100个、1-50个、1-20个、1-10个、1-9个、1-8个、1-7个、1-6个、1-5个、1-4个、1-3个、1-2个或1个氨基酸连接至c的氨基末端。在一些实施方案中，其中融合蛋白为a-c-(b)n，a的羧基末端用肽键或用一个或多个氨基酸，例如1-100个、1-50个、1-20个、1-10个、1-9个、1-8个、1-7个、1-6个、1-5个、1-4个、1-3个、1-2个或1个氨基酸连接至c的氨基末端，并且c的羧基末端用肽键或用一个或多个氨基酸，例如1-100个、1-50个、1-20个、1-10个、1-9个、1-8个、1-7个、1-6个、1-5个、1-4个、1-3个、1-2个或1个氨基酸连接至(b)n的氨基末端。在第一方面的一些实施方案中，n为1、2、3、4或5，优选为5，并且各b还包含连接至各b的氨基末端及羧基末端中的每一个的经独立选择的裂解氨基酸序列(例如seqidno:1或seqidno:37)。举例而言，连接至第一b(b1)的羧基末端(cv1’)的裂解氨基酸序列与连接至第二b(b2)的氨基末端(cv2)的裂解序列连接，使得连接为-b1-cv1’-cv2-b2-等等。因此，例如，其中n＝3的(b)n可表示为cv1-b1-cv1’-cv2-b2-cv2’-cv3-b3-cv3’，其中cv1、cv2和cv3分别表示经由其羧基末端连接至b1、b2和b3的氨基末端的裂解氨基酸序列，并且cv1’、cv2’和cv3’分别表示经由其氨基末端连接至b1、b2及b3的羧基末端的裂解氨基酸序列，其中例如cv1’的羧基末端连接至cv2的氨基末端。因此，当融合蛋白为a-(b)n-c时，cv1的氨基末端连接至a的羧基末端，并且cvn’的羧基末端(n表示增强子序列b的数目，即b的羧基末端序列)连接至c的氨基末端，并且当融合蛋白为a-c-(b)n时，cv1的氨基末端连接至c的羧基末端，并且cvn’的羧基末端为融合蛋白的羧基末端，或者可在融合蛋白的羧基末端包括额外的一个或多个氨基酸，例如1-100个、1-50个、1-20个、1-10个、1-9个、1-8个、1-7个、1-6个、1-5个、1-4个、1-3个、1-2个或1个氨基酸。各b1、b2...bn独立地为seqidno:1或seqidno:37，或与其具有至少90％同一性或同源性的序列，或其具有1-5个保守性氨基酸置换的序列，并且各cv1、cv1’、cv2、cv2’...cvn、cvn’独立地选自由以下组成的组：adgsvk(seqidno:2)、askva(seqidno:3)、lskvl(seqidno:4)、askvl(seqidno:5)、gdgsik(seqidno:6)、adgsv(seqidno:7)、laksl(seqidno:8)、adlavk(seqidno:9)、asvva(seqidno:10)、gigsia(seqidno:11)、gveki(seqidno:12)、naankg(seqidno:13)、dgskka(seqidno:14)、gdgnkk(seqidno:15)、klskvl(seqidno:75)和gdgnk(seqidno:76)。在一些实施方案中，各cv1、cv1’、cv2、cv2’...cvn、cvn’独立地选自由以下组成的组：seqidno:2、seqidno:3、seqidno:4、seqidno:5和seqidno:6。在一些实施方案中，各cv1、cv2...cvn独立地为seqidno:3、seqidno:4或seqidno:5，并且各cv1’、cv2’...cvn’独立地为seqidno:2或seqidno:6。在一些实施方案中，cv1’、cv2’...cv(n-1)’的各羧基末端分别独立地用肽键或一个或多个氨基酸，例如1-100个、1-50个、1-20个、1-10个、1-9个、1-8个、1-7个、1-6个、1-5个、1-4个、1-3个、1-2个或1个氨基酸连接至cv2、cv3...cvn的各氨基末端。在一些实施方案中，cv1’、cv2’...cv(n-1)’的各羧基末端分别独立地用肽键或1、2、3、4或5个氨基酸连接至cv2、cv3...cvn的各氨基末端。在一些实施方案中，cv1’、cv2’...cv(n-1)’的各羧基末端分别独立地用肽键或1、2或3个氨基酸连接至cv2、cv3...cvn的各氨基末端。在一个优选实施方案中，各cv1’、cv2’...cvn’的氨基末端分别用三个氨基酸的序列gsc连接至b1、b2...bn的羧基末端。在一些实施方案中，各b1、b2...bn为seqidno:1，或与其具有至少90％同一性或同源性的序列，或其具有1-5个保守性氨基酸置换的序列。在一些实施方案中，各b1、b2...bn为seqidno:37，或与其具有至少90％同一性或同源性的序列，或其具有1-5个保守性氨基酸置换的序列。在一些实施方案中，除非另有说明，否则如本段落中所用，连接是用肽键，或用一个或多个氨基酸，例如1-100个、1-50个、1-20个、1-10个、1-9个、1-8个、1-7个、1-6个、1-5个、1-4个、1-3个、1-2个或1个氨基酸连接。在第一方面的一些实施方案中，第三多肽序列c包含一个以上独立抗原序列。在一些实施方案中，c包含一个或多个独立抗原序列，例如1-50个、1-25个、1-20个、1-19个、1-18个、1-17个、1-16个、1-15个、1-14个、1-13个、1-12个、1-11个、1-10个、1-9个、1-8个、1-7个、1-6个、1-5个、1-4个、1-3个、1-2个或1个独立抗原序列。在一些实施方案中，各c还包含连接至所述一个或多个抗原序列中的每一个的氨基末端和羧基末端中的每一个的经独立选择的裂解氨基酸序列。因此，例如，在c包含3个抗原序列的情况下，c可表示为cv1-c1-cv1’-cv2-c2-cv2’-cv3-c3-cv3’，其中cv1、cv2和cv3分别表示经由羧基末端连接至c1、c2和c3的氨基末端的裂解氨基酸序列，并且cv1’、cv2’和cv3’分别表示经由氨基末端连接至c1、c2和c3的羧基末端的裂解氨基酸序列，其中例如cv1’的羧基末端连接至cv2的氨基末端。在一些实施方案中，各cv1、cv1’、cv2、cv2’...cvx、cvx’(其中x表示抗原序列总数)独立地选自由以下组成的组：seqidno:2、seqidno:3、seqidno:4、seqidno:5、seqidno:6、seqidno:7、seqidno:8、seqidno:9、seqidno:10、seqidno:11、seqidno:12、seqidno:13、seqidno:14、seqidno:15、seqidno:75和seqidno:76。在一些实施方案中，各cv1、cv1’、cv2、cv2’...cvx、cvx’独立地选自由以下组成的组：seqidno:2、seqidno:4、seqidno:7、seqidno:14、seqidno:15、seqidno:75和seqidno:76。在一些实施方案中，各cv1、cv2...cvx独立地为seqidno:4、seqidno:14或seqidno:75，并且各cv1’、cv2’...cvx’独立地为seqidno:2、seqidno:7、seqidno:15或seqidno:76。在一些实施方案中，cv1’、cv2’...cv(x-1)’的各羧基末端分别独立地用肽键，或一个或多个氨基酸，例如1-100个、1-50个、1-20个、1-10个、1-9个、1-8个、1-7个、1-6个、1-5个、1-4个、1-3个、1-2个或1个氨基酸，连接至cv2、cv3...cvx的各氨基末端。在一些实施方案中，cv1’、cv2’...cv(x-1)’的各羧基末端分别独立地用肽键，或由1、2、3、4或5个氨基酸连接至cv2、cv3...cvx的各氨基末端。在一些实施方案中，cv1’、cv2’...cv(x-1)’的各羧基末端分别独立地用肽键，或由1、2或3个氨基酸连接至cv2、cv3...cvx的各氨基末端。在一些实施方案中，c内的各抗原序列长度独立地为10-1,000个、10-500个、10-400个、10-300个、10-200个、10-100个、10-90个、10-80个、10-70个、10-60个、10-50个、10-40个或10-30个氨基酸。在一些实施方案中，融合蛋白a-(b)n-c或a-c-(b)n少于3,000个氨基酸、少于2,000个氨基酸、200至3,000个氨基酸、200至2,000个氨基酸、300至2,000个氨基酸、300至1,500个氨基酸或300至1,000个氨基酸。在本发明的第二方面中，本发明涉及编码融合蛋白的核酸分子，其中所述融合蛋白包含(i)第一氨基酸序列，该第一氨基酸序列包含增强子氨基酸序列的一个或多个拷贝，各增强子氨基酸序列独立地选自由以下组成的组：esnqsvedkhnefmltey(seqidno:1)和pasravddhhaqfllsek(seqidno:37)，或与其具有至少90％同一性或同源性的序列，或其具有1-5个保守性氨基酸置换的序列；以及(ii)编码目标多肽的第二氨基酸序列。在一些实施方案中，第二氨基酸序列连接至第一氨基酸序列的氨基或羧基末端。在一些实施方案中，目标多肽包含一个或多个独立抗原序列。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含一个或多个裂解氨基酸序列，其中各裂解序列经独立地选择且连接至所述一个或多个独立抗原序列中的至少一个。在一些实施方案中，各独立抗原序列在其氨基末端连接至经独立选择的裂解序列且在其羧基末端连接至经独立选择的裂解序列。在一些实施方案中，增强子氨基酸序列的所述一个或多个拷贝为seqidno:1的一个或多个拷贝。在一些实施方案中，增强子氨基酸序列的所述一个或多个拷贝为seqidno:37的一个或多个拷贝。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含seqidno:1的1个拷贝、2个拷贝、3个拷贝、4个拷贝或5个拷贝。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含seqidno:37的1个拷贝、2个拷贝、3个拷贝、4个拷贝或5个拷贝。在一个优选实施方案中，第一氨基酸包含seqidno:1的5个拷贝或seqidno:37的5个拷贝，更优选seqidno:1的5个拷贝。在第二方面的一些实施方案中，增强子氨基酸序列的一个或多个拷贝为seqidno:1的一个或多个拷贝。在一些实施方案中，增强子氨基酸序列的所述一个或多个拷贝为seqidno:37的一个或多个拷贝。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含增强子氨基酸序列的1-5个拷贝、2-5个拷贝、3-5个拷贝、4-5个拷贝，优选5个拷贝。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含seqidno:1的1个拷贝、2个拷贝、3个拷贝、4个拷贝或5个拷贝。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含seqidno:37的1个拷贝、2个拷贝、3个拷贝、4个拷贝或5个拷贝。在一个优选实施方案中，第一氨基酸包含seqidno:1的5个拷贝或seqidno:37的5个拷贝，更优选seqidno:1的5个拷贝。在第二方面的一些实施方案中，增强子氨基酸序列的各拷贝通过肽键，或通过一个或多个氨基酸，例如1-100个、1-50个、1-20个、1-10个、1-9个、1-8个、1-7个、1-6个、1-5个、1-4个、1-3个、1-2个或1个氨基酸，连接至增强子氨基酸序列的下一拷贝。在一些实施方案中，第一氨基酸序列通过肽键，或通过一个或多个氨基酸，例如1-100个、1-50个、1-20个、1-10个、1-9个、1-8个、1-7个、1-6个、1-5个、1-4个、1-3个、1-2个或1个氨基酸，连接至第二氨基酸序列。在一些实施方案中，融合蛋白包含框内分泌信号序列。在一些实施方案中，所述分泌信号序列的羧基末端连接至第一氨基酸序列的氨基末端，并且第一氨基酸序列的羧基末端连接至第二氨基酸序列的氨基末端。在一些实施方案中，所述分泌信号序列的羧基末端连接至第二氨基酸序列的氨基末端，并且第二氨基酸序列的羧基末端连接至第一氨基酸序列的氨基末端。在这些实施方案中，分泌信号序列的羧基末端通过肽键，或通过一个或多个氨基酸，例如1-100个、1-50个、1-20个、1-10个、1-9个、1-8个、1-7个、1-6个、1-5个、1-4个、1-3个、1-2个或1个氨基酸，连接至第一或第二氨基酸序列的氨基末端，并且第一氨基酸序列通过肽键，或通过一个或多个氨基酸，例如1-100个、1-50个、1-20个、1-10个、1-9个、1-8个、1-7个、1-6个、1-5个、1-4个、1-3个、1-2个或1个氨基酸，连接至第二氨基酸序列。在一些实施方案中，分泌信号序列为单核细胞增多性李斯特菌信号序列，在一些实施方案中，为acta信号序列。在一些实施方案中，本发明的融合蛋白包含选自由以下组成的组的框内acta信号序列：seqidno:25、seqidno:26、seqidno:27和seqidno:28，或与所述序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。在第二方面的某些实施方案中，第一氨基酸序列包含一个或多个裂解氨基酸序列，其中各裂解序列经独立地选择且连接至所述一个或多个增强子氨基酸序列中的至少一个。在一些实施方案中，各增强子氨基酸序列在其氨基末端连接至经独立选择的裂解序列且在其羧基末端连接至经独立选择的裂解序列。在一些实施方案中，所述一个或多个裂解序列中的每一个均独立地选自由以下组成的组：seqidno:2、seqidno:3、seqidno:4、seqidno:5、seqidno:6、seqidno:7、seqidno:8、seqidno:9、seqidno:10、seqidno:11、seqidno:12、seqidno:13、seqidno:14、seqidno:15、seqidno:75和seqidno:76。在一些实施方案中，所述一个或多个裂解序列中的每一个均独立地选自由以下组成的组：seqidno:2、seqidno:3、seqidno:4、seqidno:5和seqidno:6。在一些实施方案中，各增强子序列的氨基末端连接至选自由seqidno:3、seqidno:4和seqidno:5组成的组的裂解序列的羧基末端，并且各增强子序列的羧基末端连接至选自由seqidno:2和seqidno:6组成的组的裂解序列的氨基末端。在一些实施方案中，在本发明的融合蛋白内，增强子序列的氨基末端连接至seqidno:4或seqidno:5的羧基末端，并且增强子序列的羧基末端连接至seqidno:2的氨基末端；或增强子序列的氨基末端连接至seqidno:3的羧基末端，并且增强子序列的羧基末端连接至seqidno:6的氨基末端。在一些实施方案中，连接至增强子序列的各裂解序列通过肽键，或通过一个或多个氨基酸，例如1-100个、1-50个、1-20个、1-10个、1-9个、1-8个、1-7个、1-6个、1-5个、1-4个、1-3个、1-2个或1个氨基酸连接。在一些实施方案中，连接至增强子序列的各裂解序列通过肽键，或通过1、2、3、4或5个氨基酸连接。在一些实施方案中，连接至增强子序列的各裂解序列通过肽键，或通过1、2或3个氨基酸连接。在一些实施方案中，通过其氨基末端连接至增强子序列的羧基末端的各裂解序列通过其羧基末端连接至相邻裂解序列(即裂解序列通过其羧基末端连接至下一增强子序列)。在一些实施方案中，通过其羧基末端连接至下一裂解序列的氨基末端的各裂解序列通过肽键，或通过一个或多个氨基酸，例如1-100个、1-50个、1-20个、1-10个、1-9个、1-8个、1-7个、1-6个、1-5个、1-4个、1-3个、1-2个或1个氨基酸连接。在一些实施方案中，通过其羧基末端连接至下一裂解序列的氨基末端的各裂解序列通过肽键，或通过1、2、3、4或5个氨基酸连接。在一些实施方案中，通过其羧基末端连接至下一裂解序列的氨基末端的各裂解序列通过肽键，或通过1、2或3个氨基酸连接。在第二方面的一些实施方案中，第二氨基酸序列包含一个以上独立抗原序列。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含一个或多个独立抗原序列，例如1-50个、1-25个、1-20个、1-19个、1-18个、1-17个、1-16个、1-15个、1-14个、1-13个、1-12个、1-11个、1-10个、1-9个、1-8个、1-7个、1-6个、1-5个、1-4个、1-3个、1-2个或1个独立抗原序列。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含一个或多个裂解氨基酸序列，其中各裂解序列经独立地选择且连接至所述一个或多个抗原序列中的至少一个。在一些实施方案中，一个或多个独立抗原序列各自在其氨基末端连接至经独立选择的裂解序列且在其羧基末端连接至经独立选择的裂解序列。在一些实施方案中，所述一个或多个裂解序列中的每一个均独立地选自由以下组成的组：seqidno:2、seqidno:3、seqidno:4、seqidno:5、seqidno:6、seqidno:7、seqidno:8、seqidno:9、seqidno:10、seqidno:11、seqidno:12、seqidno:13、seqidno:14、seqidno:15、seqidno:75和seqidno:76。在一些实施方案中，所述一个或多个裂解序列中的每一个均独立地选自由以下组成的组：seqidno:2、seqidno:4、seqidno:7、seqidno:14、seqidno:15、seqidno:75和seqidno:76。在一些实施方案中，各抗原序列的氨基末端连接至选自由seqidno:4、seqidno:14和seqidno:75组成的组的裂解序列的羧基末端，并且各抗原序列的羧基末端连接至选自由seqidno:2、seqidno:7、seqidno:15和seqidno:76组成的组的裂解序列的氨基末端。在一些实施方案中，在本发明的融合蛋白内，抗原序列的氨基末端连接至seqidno:4的羧基末端且抗原序列的羧基末端连接至seqidno:7的氨基末端；或抗原序列的氨基末端连接至seqidno:14的羧基末端且抗原序列的羧基末端连接至seqidno:2、seqidno:15或seqidno:76的氨基末端；或抗原序列的氨基末端连接至seqidno:75的羧基末端且抗原序列的羧基末端连接至seqidno:2或seqidno:76的氨基末端。在一些实施方案中，连接至抗原序列的各裂解序列通过肽键，或通过一个或多个氨基酸，例如1-100个、1-50个、1-20个、1-10个、1-9个、1-8个、1-7个、1-6个、1-5个、1-4个、1-3个、1-2个或1个氨基酸连接。在一些实施方案中，连接至抗原序列的各裂解序列通过肽键，或通过1、2、3、4或5个氨基酸连接。在一些实施方案中，连接至抗原序列的各裂解序列通过肽键，或通过1、2或3个氨基酸连接。在一些实施方案中，通过其氨基末端连接至抗原序列的羧基末端的各裂解序列通过其羧基末端连接至相邻裂解序列(即裂解序列通过其羧基末端连接至下一抗原序列)。在一些实施方案中，通过其羧基末端连接至下一裂解序列的氨基末端的各裂解序列通过肽键，或通过一个或多个氨基酸，例如1-100个、1-50个、1-20个、1-10个、1-9个、1-8个、1-7个、1-6个、1-5个、1-4个、1-3个、1-2个或1个氨基酸连接。在一些实施方案中，通过其羧基末端连接至下一裂解序列的氨基末端的各裂解序列通过肽键，或通过1、2、3、4或5个氨基酸连接。在一些实施方案中，通过其羧基末端连接至下一裂解序列的氨基末端的各裂解序列通过肽键，或通过1、2或3个氨基酸连接。在一些实施方案中，第二氨基酸内的各抗原序列长度独立地为10-1,000个、10-500个、10-400个、10-300个、10-200个、10-100个、10-90个、10-80个、10-70个、10-60个、10-50个、10-40个或10-30个氨基酸。在第二方面的一些实施方案中，本发明的融合蛋白包含分泌信号序列，其中分泌序列的氨基末端连接至第一氨基酸的羧基末端，并且第一氨基酸的羧基末端连接至第二氨基酸的羧基末端。在一些实施方案中，本发明的融合蛋白包含分泌信号序列，其中分泌序列的氨基末端通过肽键，或通过一个或多个氨基酸，例如1-100个、1-50个、1-20个、1-10个、1-9个、1-8个、1-7个、1-6个、1-5个、1-4个、1-3个、1-2个或1个氨基酸，连接至第一氨基酸序列的羧基末端，并且第一氨基酸的氨基末端通过肽键，或通过一个或多个氨基酸，例如1-100个、1-50个、1-20个、1-10个、1-9个、1-8个、1-7个、1-6个、1-5个、1-4个、1-3个、1-2个或1个氨基酸，连接至第二氨基酸的羧基末端。在一些实施方案中，本发明的融合蛋白包含分泌信号序列，其中分泌序列的氨基末端通过肽键或通过1、2、3、4或5个氨基酸连接至第一氨基酸的羧基末端，并且第一氨基酸的氨基末端通过肽键或通过1、2、3、4或5个氨基酸连接至第二氨基酸的羧基末端。在一些实施方案中，本发明的融合蛋白包含分泌信号序列，其中分泌序列的氨基末端通过肽键或通过1、2或3个氨基酸连接至第一氨基酸的羧基末端，并且第一氨基酸的氨基末端通过肽键或通过1、2或3个氨基酸连接至第二氨基酸的羧基末端。在第二方面的一些实施方案中，本发明的融合蛋白包含分泌信号序列，其中分泌序列的氨基末端连接至第二氨基酸的羧基末端，并且第二氨基酸的氨基末端连接至第一氨基酸的羧基末端。在一些实施方案中，本发明的融合蛋白包含分泌信号序列，其中分泌序列的氨基末端通过肽键，或通过一个或多个氨基酸，例如1-100个、1-50个、1-20个、1-10个、1-9个、1-8个、1-7个、1-6个、1-5个、1-4个、1-3个、1-2个或1个氨基酸，连接至第二氨基酸序列的羧基末端，并且第二氨基酸的氨基末端通过肽键，或通过一个或多个氨基酸，例如1-100个、1-50个、1-20个、1-10个、1-9个、1-8个、1-7个、1-6个、1-5个、1-4个、1-3个、1-2个或1个氨基酸，连接至第一氨基酸的羧基末端。在一些实施方案中，本发明的融合蛋白包含分泌信号序列，其中分泌序列的氨基末端通过肽键，或通过1、2、3、4或5个氨基酸连接至第二氨基酸的羧基末端，并且第二氨基酸的氨基末端通过肽键或通过1、2、3、4或5个氨基酸连接至第一氨基酸的羧基末端。在一些实施方案中，本发明的融合蛋白包含分泌信号序列，其中分泌序列的氨基末端通过肽键或通过1、2或3个氨基酸连接至第二氨基酸的羧基末端，并且第二氨基酸的氨基末端通过肽键或通过1、2或3个氨基酸连接至第一氨基酸的羧基末端。在第二方面的一些实施方案中，融合蛋白少于3,000个氨基酸、少于2,000个氨基酸、200至3,000个氨基酸、200至2,000个氨基酸、300至2,000个氨基酸、300至1,500个氨基酸或300至1,000个氨基酸。在相关第三方面中，本发明涉及从宿主细胞表达目标多肽的方法，所述方法包括：将包含编码融合蛋白的核酸序列的表达构建体引入宿主细胞，其中融合蛋白如本发明的第一方面和第二方面，包括其所有实施方案中所述。在第三方面的一些实施方案中，融合蛋白包含(i)第一氨基酸序列，第一氨基酸序列包含增强子氨基酸序列的一个或多个拷贝，各增强子氨基酸序列独立地选自由以下组成的组：esnqsvedkhnefmltey(seqidno:1)及pasravddhhaqfllsek(seqidno:37)，或与其具有至少90％同一性或同源性的序列或其具有1-5个保守性氨基酸置换的序列，其中各拷贝任选在各末端由包含如下所述的裂解氨基酸序列的氨基酸序列侧接，以及(ii)连接至第一氨基酸序列的氨基或羧基末端的第二目标氨基酸序列，其中融合蛋白可操作地连接至一个或多个介导融合蛋白在宿主细胞中的表达以及任选分泌的调控元件。在又一相关方面中，本发明涉及一种组合物，所述组合物包含含有本发明的核酸分子的宿主细胞，其中所述宿主细胞表达且任选地分泌融合蛋白。在某些实施方案中，这些核酸分子可包含介导融合蛋白在宿主细胞中的表达的一个或多个调控元件。此类核酸分子在本文中称为“融合蛋白表达构建体。”术语“调控元件”旨在包括启动子、增强子、内部核糖体进入位点(ires)和其他表达控制组件(例如转录终止信号，诸如聚腺苷酸化信号及聚u序列)。此类调控元件描述于例如goeddel,geneexpressiontechnology:methodsinenzymology185,academicpress,sandiego,calif.(1990)中。调控元件包括指导核苷酸序列在许多类型宿主细胞中组成性表达的元件及指导核苷酸序列仅在某些宿主细胞中表达的元件(例如组织特异性调控序列)。组织特异性启动子可指导主要在所需目标组织中，诸如肌肉、神经元、骨、皮肤、血液、特定器官(例如肝、胰脏)或特定细胞类型(例如淋巴细胞)中的表达。调控元件也包括可诱导型元件。仅仅举例而言，在李斯特菌属的acta启动子下的基因表达依赖于称为prfa的用于翻译活化的调控因子。相对于肉汤生长的李斯特菌属，在acta/prfa调控下的基因表达经诱导为李斯特菌属存在于宿主细胞中时的大约200倍。因此，在某些实施方案中，调控序列包含prfa依赖性单核细胞增多性李斯特菌启动子。prfa依赖性启动子可选自由以下组成的组：inla启动子、inlb启动子、inlc启动子、hpt启动子、hly启动子、plca启动子、mpl启动子及acta启动子。下文描述诱导其他细菌菌种的宿主生物体中的基因表达的类似系统。如上所述，本发明的核酸分子包含第一氨基酸序列，该第一氨基酸序列包含增强子氨基酸序列的一个或多个拷贝，其中各增强子氨基酸序列独立地选自由以下组成的组：esnqsvedkhnefmltey(seqidno:1)和pasravddhhaqfllsek(seqidno:37)，或与其具有至少90％同一性或同源性的序列，或其具有1-5个保守性氨基酸置换的序列。在各种实施方案中，第一氨基酸序列包含呈单个连续阵列排列的增强子氨基酸序列的2、3、4、5个或更多个拷贝，并且编码目标多肽的第二氨基酸序列连接在第一氨基酸序列之前或之后。在各种实施方案中，第一氨基酸序列为askvlesnqsvedkhnefmlteygscadgsvk(seqidno:31)；或第一氨基酸序列为askvlpasravddhhaqfllsekgscadgsvk(seqidno:29)；或第一氨基酸序列为askvlesnqsvedkhnefmlteygscadgsvktsaskvaesnqsvedkhnefmlteygscgdgsik(seqidno:69)；或第一氨基酸序列为askvlpasravddhhaqfllsekgscadgsvktsaskvapasravddhhaqfllsekgscgdgsik(seqidno:70)；或第一氨基酸序列为askvlesnqsvedkhnefmlteygscadgsvktsaskvaesnqsvedkhnefmlteygscgdgsiklskvlesnqsvedkhnefmlteygscadgsvk(seqidno:71)；或第一氨基酸序列为askvlpasravddhhaqfllsekgscadgsvktsaskvapasravddhhaqfllsekgscgdgsiklskvlpasravddhhaqfllsekgscadgsvk(seqidno:72)；或第一氨基酸序列为askvlesnqsvedkhnefmlteygscadgsvktsaskvaesnqsvedkhnefmlteygscgdgsiklskvlesnqsvedkhnefmlteygscadgsvkaskvaesnqsvedkhnefmlteygscgdgsik(seqidno:73)；或第一氨基酸序列为askvlpasravddhhaqfllsekgscadgsvktsaskvapasravddhhaqfllsekgscgdgsiklskvlpasravddhhaqfllsekgscadgsvkaskvapasravddhhaqfllsekgscgdgsik(seqidno:74)；或第一氨基酸序列为seqidno:35；或第一氨基酸序列为seqidno:33。在一个实施方案中，第一氨基酸序列选自由以下组成的组：seqidno:31、seqidno:29、seqidno:69、seqidno:70、seqidno:71、seqidno:72、seqidno:73、seqidno:74、seqidno:35和seqidno:33。在一个实施方案中，第一氨基酸为seqidno:35。在本发明的第四方面中，提供了具有seqidno:1或seqidno:37的氨基酸序列或在seqidno:1或seqidno:37内具有1-5个保守性氨基酸置换的氨基酸序列的多肽。在一些实施方案中，所述多肽具有seqidno:1或seqidno:37的氨基酸序列或在seqidno:1或seqidno:37内具有1-3个保守性氨基酸置换的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述多肽具有seqidno:1或seqidno:37的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述多肽具有seqidno:1的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述多肽具有seqidno:37的氨基酸序列。在本发明的第五方面中，提供了一种多肽，其中所述多肽包含seqidno:1或seqidno:37的氨基酸序列或在seqidno:1或seqidno:37内具有1-5个保守性氨基酸置换的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述多肽包含seqidno:1或seqidno:37的氨基酸序列或在seqidno:1或seqidno:37内包含1-3个保守性氨基酸置换的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述多肽包含seqidno:1或seqidno:37的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述多肽包含seqidno:1的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述多肽包含seqidno:37的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述多肽为融合蛋白，该融合蛋白包含seqidno:1或seqidno:37的氨基酸序列或在seqidno:1或seqidno:37内具有1-5个保守性氨基酸置换的氨基酸序列。在一些实施方案中，融合蛋白包含seqidno:1或seqidno:37的氨基酸序列或在seqidno:1或seqidno:37内具有1-3个保守性氨基酸置换的氨基酸序列。在一些实施方案中，融合蛋白包含seqidno:1或seqidno:37的氨基酸序列。在一些实施方案中，融合蛋白包含seqidno:1的氨基酸序列。在一些实施方案中，融合蛋白包含seqidno:37的氨基酸序列。在第六方面中，提供了一种宿主细胞，其中所述宿主细胞包含本发明的核酸分子，即编码如本文所述的融合蛋白的核酸分子，并且其中所述宿主细胞表达融合蛋白。在一些实施方案中，宿主细胞表达且分泌融合蛋白。在一些实施方案中，核酸分子整合到宿主细胞的基因组中。在一些实施方案中，宿主细胞为细菌。在一些实施方案中，细菌为单核细胞增多性李斯特菌。在一些实施方案中，细菌为单核细胞增多性李斯特菌且核酸分子整合到单核细胞增多性李斯特菌的毒力基因中，其中所述核酸分子的整合破坏毒力基因的表达或破坏毒力基因的编码序列。在一些实施方案中，毒力基因为acta或inlb。在第七方面中，提供了一种从宿主细胞表达目标多肽的方法，所述方法包括：将包含本发明的核酸分子(即编码如本文所述的融合蛋白的核酸分子)的表达构建体引入宿主细胞，其中融合蛋白可操作地连接至一个或多个介导融合蛋白在宿主细胞中的表达以及任选分泌的调控元件。在一些实施方案中，核酸分子整合到宿主细胞的基因组中。在一些实施方案中，宿主细胞为细菌。在一些实施方案中，细菌为单核细胞增多性李斯特菌。在一些实施方案中，细菌为单核细胞增多性李斯特菌且核酸分子整合到单核细胞增多性李斯特菌的毒力基因中，其中所述核酸分子的整合破坏毒力基因的表达或破坏毒力基因的编码序列。在一些实施方案中，毒力基因为acta或inlb。已开发了许多细菌菌种用作疫苗，或用作癌症免疫治疗剂，并且本发明的核酸分子可用于融合蛋白在此等菌种中的表达。举例而言，优选细菌的属是选自由以下成的组：李斯特菌属、埃希氏菌属、奈瑟氏菌属(neisseria)、分枝杆菌属(mycobacterium)、弗朗西斯菌属(francisella)、杆菌属(bacillus)、沙门氏菌属、志贺氏菌属、耶尔森氏菌属、伯克霍尔德菌属(burkholderia)、布鲁氏菌属(brucella)、军团菌属(legionella)、立克次体属(rickettsia)及衣原体属(chlamydia)。该清单并非意欲限制。最优选地，细菌为兼性胞内细菌，诸如李斯特菌属、沙门氏菌属、志贺氏菌属、弗朗西斯菌属、分枝杆菌属、军团菌属、伯克霍尔德菌属及布鲁氏菌属。在下文描述的某些示例性实施方案中，细菌为单核细胞增多性李斯特菌，包括例如经修饰的单核细胞增多性李斯特菌△acta/△inlb(其中天然acta和inlb基因已缺失或因突变而在功能上缺失的单核细胞增多性李斯特菌)。该清单并非意欲限制。参见例如wo04/006837；wo04/084936；wo04/110481；wo05/037233；wo05/092372；wo06/036550；wo07/103225；wo07/117371；wo08/109155；wo08/130551；wo08/140812；wo09/143085；wo09/143167；wo10/040135；wo11/060260；以及wo14/074635，其各自据此通过引用整体并入，包括所有表格、附图和权利要求。细菌菌种可为兼性胞内细菌载体。细菌可用于递送作为融合蛋白的一部分的目标多肽(例如抗原)，以在治疗上或预防上用作例如疫苗或用作癌症免疫治疗剂。细菌可用于在宿主生物体中将此类目标多肽递送至抗原呈递细胞。在各种实施方案中，本发明的核酸分子可在载体上提供至宿主细胞。一般而言，并且在本说明书全篇，术语“载体”是指能够运输与之连接的另一核酸的核酸分子。载体包括(但不限于)单链、双链或部分双链的核酸分子；包含一个或多个自由端、无自由端(例如环状)的核酸分子；包含dna、rna或两者的核酸分子；以及本领域中已知的其他种类的多聚核苷酸。一种类型的载体为“质粒”，其是指额外dna区段可诸如通过标准分子克隆技术插入其中的环状双链dna环。另一种类型的载体为病毒载体，其中病毒来源的dna或rna序列存在于载体中以包装成病毒(例如反转录病毒、复制缺陷型反转录病毒、腺病毒、复制缺陷型腺病毒及腺相关病毒)。病毒载体还包括通过病毒携带以转染至宿主细胞的多聚核苷酸。某些载体能够在其引入的宿主细胞中自主复制(例如具有细菌复制起点的细菌载体及附加型哺乳动物载体)。可替代地，本发明的核酸分子可在引入宿主细胞后整合到宿主细胞的基因组中，从而与宿主基因组一起复制。此类核酸分子可整合到细菌的毒力基因中，并且所述核酸序列的整合破坏毒力基因的表达或破坏毒力基因的编码序列。仅仅举例而言，此类毒力基因可为单核细胞增多性李斯特菌acta或inlb。在某些实施方案中，本发明的核酸分子表达为包含框内分泌信号序列的融合蛋白，从而使得融合蛋白由细菌分泌成一种或多种可溶性多肽。本领域中已知许多示例性信号序列用于细菌、哺乳动物及植物表达系统中。在细菌为单核细胞增多性李斯特菌的情况下，分泌信号序列优选为单核细胞增多性李斯特菌信号序列，最优选为acta信号序列。额外的acta或其他接头氨基酸也可与免疫原性多肽融合表达。在优选实施方案中，本发明的融合蛋白包含选自由seqidno:25、seqidno:26、seqidno:27和seqidno:28组成的组的框内acta信号序列或与所述序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。在优选实施方案中，本发明提供一种编码融合蛋白的核酸序列，该融合蛋白包含：(a)选自由seqidno:25、seqidno:26、seqidno:27和seqidno:28组成的组的acta信号序列或与所述序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；(b)第一氨基酸序列，其包含(i)多个(2、3、4、5个或更多个拷贝)蛋白质表达增强子氨基酸序列，所述增强子氨基酸序列独立地为esnqsvedkhnefmltey(seqidno:1)或pasravddhhaqfllsek(seqidno:37)，或与其具有至少90％同一性或同源性的序列，或其具有1-5个保守性氨基酸置换的序列；以及(ii)侧接各蛋白质表达增强子氨基酸序列的接头氨基酸序列，其中各接头氨基酸序列经独立地选择且经构造以进行蛋白酶体裂解；以及(c)目标多肽序列，诸如编码抗原序列的多肽序列，并且最优选包含一种或多种肿瘤抗原或感染性疾病抗原；其中融合蛋白由可操作地连接至单核细胞增多性李斯特菌acta启动子的核酸序列表达。在某些实施方案中，编码抗原多肽的核酸序列针对由细菌(例如单核细胞增多性李斯特菌)表达进行密码子优化。如下文所述，不同生物体常常显示出“密码子偏好”；即，编码特定氨基酸的给定密码子在遗传密码中出现的程度在生物体之间显著不同。一般而言，基因含有的密码子越稀有，异源蛋白在特定宿主系统内以合理水平表达的可能性越低。如果稀有密码子成簇出现或出现在蛋白质的n端部分，则这些水平变得更低。在不修饰氨基酸序列的情况下用更严密地反映宿主系统密码子偏好的密码子置换稀有密码子可提高功能蛋白表达的水平。下文描述用于密码子优化的方法。在一些实施方案中，目标多肽序列，诸如编码如本文所述的抗原序列的多肽序列，包含一个或多个独立抗原序列。术语“独立抗原序列”是指包含抗原表位(例如预测t细胞抗原表位)并且在序列上与较长多肽中存在的其他多肽序列不同的多肽序列。仅仅举例而言，目标多肽序列可包含50个独立抗原序列、25个独立抗原序列、20个独立抗原序列、19个独立抗原序列、18个独立抗原序列、17个独立抗原序列、16个独立抗原序列、15个独立抗原序列、14个独立抗原序列、13个独立抗原序列、12个独立抗原序列、11个独立抗原序列、10个独立抗原序列、9个独立抗原序列、8个独立抗原序列、7个独立抗原序列、6个独立抗原序列、5个独立抗原序列、4个独立抗原序列、3个独立抗原序列、2个独立抗原序列或1个抗原序列。在一些实施方案中，所述一个或多个独立抗原序列包含一个或多个新抗原序列。在一些实施方案中，所述一个或多个新抗原序列是由患癌症的个体中的一个或多个肿瘤细胞表达的一个或多个新抗原序列。在一些实施方案中，所述一个或多个新抗原序列由患结直肠癌的个体中的一个或多个结直肠癌细胞表达。在一个方面中，本发明的核酸序列，即编码如本文所述的融合蛋白的核酸序列，用于基于个性化的减毒、双重缺失的活单核细胞增多性李斯特菌(pladd)的免疫疗法中。在该方面的一个实施方案中，单核细胞增多性李斯特菌为包含编码融合蛋白的核酸序列的△acta/△inlb菌株，其包含如本文所述的目标多肽。在一些实施方案中，向患有癌症的个体施用pladd，其中目标多肽包含由个体中一个或多个肿瘤细胞表达的一个或多个肿瘤相关抗原。在一些实施方案中，个体患有结直肠癌。应理解本发明的应用不限于在以下描述中阐述的或图中说明的构建细节及部件布置。本发明能够执行除所述实施方案之外的实施方案且以多种方式实践和进行。同样，应理解本文中采用的短语和术语以及摘要是用于描述的目的且不应视为限制。因而，本领域技术人员将了解，本公开所基于的概念可容易地用作设计实现本发明的若干目的的其他结构、方法及系统的基础。因此重要的是只要不脱离本发明的精神和范围，认为权利要求包括此类同等构造。附图说明图1示意性描绘单核细胞增多性李斯特菌菌株bh2869、bh4703、bh5144、bh5150和bh5337的融合蛋白构建体。图2描绘单核细胞增多性李斯特菌菌株bh2869、bh4703、bh5144、bh5150和bh5337的融合蛋白表达的胞内蛋白质印迹(westernblot)结果。图3描绘单核细胞增多性李斯特菌菌株bh4203、bh4215、bh5128、bh5132和bh5333的融合蛋白表达的胞内蛋白质印迹结果。图4示意性描绘单核细胞增多性李斯特菌菌株bh2869、bh5624、bh5626、bh5628、bh5630和bh5144的融合蛋白构建体。图5描绘单核细胞增多性李斯特菌菌株bh2869、bh5624、bh5626、bh5628、bh5630和bh5144的融合蛋白表达的胞内蛋白质印迹结果。图6示意性描绘单核细胞增多性李斯特菌菌株bh2869、bh5632、bh5634、bh5636、bh5843和bh5337的融合蛋白构建体。图7描绘单核细胞增多性李斯特菌菌株bh2869、bh5632、bh5634、bh5636、bh5843和bh5337的融合蛋白表达的胞内蛋白质印迹结果。图8示意性描绘单核细胞增多性李斯特菌菌株bh5687、bh4017、bh5689、bh5691、bh5693和bh5695的融合蛋白构建体。图9示意性描绘单核细胞增多性李斯特菌菌株bh5687、bh4017、bh5689、bh5691、bh5693和bh5695的融合蛋白表达的胞内蛋白质印迹结果。图10描绘pap特异性cd8+t细胞在用bh2869(仅actan100-pap)、bh4703(actan100*-egfrviii-pap)、bh5144(actan100*-syn1-pap)和bh5337(actan100*-syn18-pap)免疫接种后的elispot细胞因子染色结果。图11描绘hbv-pol特异性cd8+t细胞在用bh5687(actan100*-hbvpol1-300-hbxag)、bh5689(actan100*-syn1x1-hbvpol1-300-hbxag)、bh5691(actan100*-syn1x5-hbvpol1-300-hbxag)、bh5693(actan100*-syn18x1-hbvpol1-300-hbxag)和bh5695(actan100*-syn18x5-hbvpol1-300-hbxag)免疫接种后的elispot细胞因子染色结果。图12示意性描绘单核细胞增多性李斯特菌菌株cr782、cr784、cr789和cr794的融合蛋白构建体。图13描绘单核细胞增多性李斯特菌菌株cr782、cr784、cr789和cr794的融合蛋白表达的胞内蛋白质印迹结果。图14示意性描绘单核细胞增多性李斯特菌菌株crs-207、cr876、cr866、cr788、cr791和cr796的融合蛋白构建体。图15描绘单核细胞增多性李斯特菌菌株crs-207、cr876、cr866、cr788、cr791和cr796的融合蛋白表达的肉汤培养蛋白质印迹结果。图16示意性描绘表达6xhis标记的fopc、与sumo融合的6xhis标记的fopc及与syn18x5融合的6xhis标记的fopc的大肠杆菌(escherichiacoli)菌株的融合蛋白构建体。图17描绘大肠杆菌对6xhis标记的fopc、与sumo融合的6xhis标记的fopc及与syn18x5融合的6xhis标记的fopc的融合蛋白表达的胞内蛋白质印迹结果。图18示意性描绘在有或者无syn18x5时九个独立新抗原序列的融合蛋白构建体。图19示意性描绘在有syn18x5时具有不同数目的独立新抗原序列的融合蛋白构建体。具体实施方式本发明涉及用于制备和使用经修饰以增加一种或多种异种抗原表达的减毒细菌菌种的组合物和方法。本发明可提供用作癌症免疫治疗剂的减毒细菌疫苗株或减毒细菌菌株，其在治疗或预防风险-益处特性不适用于活的未减毒疫苗的疾病方面具有有利的安全特性。应理解本发明的应用不限于在以下描述中阐述的或图中说明的构建细节及部件布置。本发明能够执行除所述实施方案之外的实施方案且以多种方式实践和进行。同样，应理解本文中采用的短语和术语以及摘要是用于描述的目的且不应视为限制。因而，本领域技术人员将了解，本公开所基于的概念可容易地用作设计实现本发明的若干目的的其他结构、方法及系统的基础。因此重要的是只要不脱离本发明的精神和范围，认为权利要求包括此类同等构造。1.定义用于指示基因突变或包含基因的细菌突变的缩写如下。举例而言，缩写“单核细胞增多性李斯特菌△acta”意指acta基因部分或全部缺失。△符号(△)意指缺失。包括上标减号的缩写(李斯特菌属acta-)意指例如藉助于缺失、点突变或移码突变，但不限于这些类型的突变使acta基因突变。“施用”在应用于人、哺乳动物、哺乳类受试者、动物、兽医学受试者、安慰剂受试者、研究受试者、实验受试者、细胞、组织、器官或生物流体时，是指(不限于)外源性配体、试剂、安慰剂、小分子、药剂、治疗剂、诊断剂或组合物与受试者、细胞、组织、器官或生物流体等接触。“施用”可指例如治疗、药代动力学、诊断、研究、安慰剂和实验方法。细胞处理包括试剂与细胞接触以及试剂与流体接触，其中流体与细胞接触。“施用”还包括例如细胞用试剂、诊断剂、结合组合物或另一细胞进行体外和离体处理。“激动剂”在涉及配体和受体时，包含刺激受体的分子、分子组合、复合物或试剂组合。例如，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(gm-csf)受体的激动剂可包括gm-csf、gm-csf的突变蛋白或衍生物、gm-csf的肽模拟物、模拟gm-csf生物功能的小分子或刺激gm-csf受体的抗体。“拮抗剂”在涉及配体及受体时，包含抑制、抵制、下调受体和/或使受体不敏感的分子、分子组合或复合物。“拮抗剂”包括抑制受体组成性活性的任何试剂。组成性活性是在缺乏配体/受体相互作用时表现的活性。“拮抗剂”还包括抑制或预防受体受刺激(或调节)的活性的任何试剂。举例而言，gm-csf受体的拮抗剂包括(不暗含任何限制)结合配体(gm-csf)且防止其与受体结合的抗体，或结合受体且防止配体与受体结合的抗体，或其中所述抗体将受体锁定呈非活性构象。如本文所用，关于肽、多肽或蛋白质的“类似物”或“衍生物”是指具有与原始肽、多肽或蛋白质相似或一致的功能，但不一定包含原始肽、多肽或蛋白质的相似或一致氨基酸序列或结构的另一肽、多肽或蛋白质。类似物优选满足以下至少一项：(a)氨基酸序列与原始氨基酸序列至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％同一的蛋白剂；(b)由在严格条件下与编码原始氨基酸序列的核苷酸序列杂交的核苷酸序列编码的蛋白剂；以及(c)由与编码原始氨基酸序列的核苷酸序列至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％同一的核苷酸序列编码的蛋白剂。如本文所用的“抗原序列”是指至少包含最小肽(例如当侧接如本文所述的裂解序列时预测具有免疫原性且结合受试者mhc分子的肽)的氨基酸序列，最小肽旨在例如通过施用经工程化为表达及分泌融合蛋白的细菌而将本发明的融合蛋白递送至受试者时诱导免疫应答。抗原序列可包含肿瘤抗原或感染性疾病抗原。抗原序列包括如本文所述的已知抗原，包括其任何抗原片段。在抗原序列包含肿瘤抗原的情况下，序列包括新抗原序列，例如通过使用本领域中已知的方法(例如对来自个体的一种或多种癌细胞的活检进行测序)评估癌细胞所表达的抗原，针对特定个体测定的序列。一般而言，抗原序列可包括全长基因序列或其任何抗原片段，包括最小肽。通常抗原序列长度为至少约8个氨基酸，例如8-1,000个、8-500个、8-400个、8-300个、8-200个、8-100个、8-90个、8-80个、8-70个、8-60个、8-50个、8-40个、8-30个、10-1,000个、10-500个、10-400个、10-300个、10-200个、10-100个、10-90个、10-80个、10-70个、10-60个、10-50个、10-40个或10-30个氨基酸。在一些情况下，融合蛋白可包括一个以上来自全长序列的抗原序列片段，例如来自全长抗原内的一个或多个表位。在一些情况下，融合蛋白可包括一个以上来自不同全长序列的抗原序列片段，例如来自不同全长抗原内的一个或多个表位。在一些情况下，抗原序列包含额外氨基酸以改变肽的亲水性或增强包括cd4与cd8t细胞应答在内的t细胞应答。用于提高抗原序列的mhc结合的方法可见于例如andreatta和nielsen,(2016)bioinformatics32(4):511-7；以及nielsen等(2003)proteinsci.,12:1007-17。在一些情况下，抗原序列包含最小肽序列且在其氨基和羧基末端中任一处或两处还包含额外氨基酸，例如旨在改变抗原序列的亲水性以提高抗原序列的预测mhc结合或提高对抗原序列的整体应答以诱导cd4与cd8应答的氨基酸。“抗原呈递细胞”(apc)是用于将抗原呈递至t细胞的免疫系统细胞。apc包括树突状细胞、单核细胞、巨噬细胞、边缘区库普弗细胞(marginalzonekupffercell)、小神经胶质细胞、朗格汉斯细胞(langerhanscell)、t细胞和b细胞。树突状细胞以至少两个谱系存在。第一谱系包括前体dc1、脊髓dc1和成熟dc1。第二谱系包括cd34+cd45ra-早期多能祖细胞、cd34+cd45ra+细胞、cd34+cd45ra+cd4+il-3rα+前dc2细胞、cd4+cd11c-类浆细胞前体dc2细胞、人淋巴dc2类浆细胞来源的dc2和成熟dc2。“减毒(attenuation)”和“减毒的(attenuated)”包括经修饰以降低对宿主的毒性的细菌、病毒、寄生虫、感染生物体、朊病毒、肿瘤细胞、感染生物体中的基因等。宿主可为人或动物宿主，或器官、组织或细胞。以非限制实例而言，细菌可减毒以减少与宿主细胞的结合，减少自一种宿主细胞至另一宿主细胞的传播，减少细胞外生长或减少在宿主细胞中的胞内生长。减毒可通过测量例如毒性的标记或指标ld50、从器官的清除率或竞争指数来评估(参见例如auerbuch等(2001)infect.immunity69：5953-5957)。一般地，减毒导致ld50增加和/或清除率增加至少25％；更一般至少50％；最一般至少100％(2倍)；正常至少5倍；更正常至少10倍；最正常至少50倍；经常至少100倍；更经常至少500倍；并且最经常至少1000倍；通常至少5000倍；更通常至少10,000倍；并且最通常至少50,000倍；并且最通常至少100,000倍。“减毒基因”包括介导对宿主的毒性、病理或毒力，在宿主内的生长或在宿主内的存活的基因，其中基因以减轻、减少或消除毒性、病理或毒力的方式突变。减少或消除可通过比较突变基因介导的毒力或毒性与通过未突变(或亲本)基因介导的毒力或毒性来评估。“突变基因”包括基因调控区、基因编码区、基因非编码区或其任何组合中的缺失、点突变和移码突变。“裂解序列”或“裂解氨基酸序列”是指被构造为通过宿主细胞蛋白酶体裂解的氨基酸序列。举例而言(不限于)，此类裂解序列可独立地选自由以下组成的组：adgsvk(seqidno:2)、askva(seqidno:3)、lskvl(seqidno:4)、askvl(seqidno:5)、gdgsik(seqidno:6)、adgsv(seqidno:7)、laksl(seqidno:8)、adlavk(seqidno:9)、asvva(seqidno:10)、gigsia(seqidno:11)、gveki(seqidno:12)、naankg(seqidno:13)、dgskka(seqidno:14)、gdgnkk(seqidno:15)、klskvl(seqidno:75)和gdgnk(seqidno:76)。在一些实施方案中，本发明的融合蛋白包含增强子序列，在增强子序列的氨基与羧基末端连接至裂解序列，例如融合蛋白可包含例如以下中的一个或多个：seqidno:5↓seqidno:2；seqidno:3↓seqidno:6；seqidno:4↓seqidno:2；seqidno:8↓seqidno:9；seqidno:10↓seqidno:11；seqidno:12↓seqidno:13；以及seqidno:14↓seqidno:15，其中↓表示与所示裂解序列连接的seqidno:1或seqidno:37的增强子序列，或与其具有至少90％同一性或同源性的序列，或其具有1-5个保守性氨基酸置换的序列。该清单并非意欲限制。在一些实施方案中，本发明的融合蛋白包含多个抗原序列，在抗原序列的氨基与羧基末端连接至裂解序列，例如融合蛋白可包含例如以下中的一个或多个：以及其中表示与所示裂解序列连接的抗原序列。该清单并非意欲限制。“保守修饰的变体”适用于氨基酸序列与核酸序列。关于特定核酸序列，保守修饰的变体是指编码一致氨基酸序列或具有一个或多个保守性置换的氨基酸序列的核酸。在一些实施方案中，如本文所述的增强子序列包括具有1-5个、1-4个、1-3个、1-2个或1个保守性氨基酸置换的所述序列。保守性置换的一个实例为以下类别之一的氨基酸交换成同一类别的另一氨基酸(颁发给lee等的美国专利第5,767,063号；kyte和doolittle(1982)j.mol.biol.157:105-132)。(1)疏水性：正亮氨酸、ile、val、leu、phe、cys、met；(2)中性亲水性：cys、ser、thr；(3)酸性：asp、glu；(4)碱性：asn、gln、his、lys、arg；(5)影响链取向的残基：gly、pro；(6)芳族：trp、tyr、phe；以及(7)小氨基酸：gly、ala、ser。“有效量”包括(不限于)可改善、逆转、减轻、预防或诊断医学病状或病症的症状或体征的量。除非明确地或上下文另外规定，否则“有效量”不限于足够改善病状的最小量。术语“增强子序列”或“增强子氨基酸序列”用于描述如本文所述的独特氨基酸序列(例如独立地选自由esnqsvedkhnefmltey(seqidno:1)和pasravddhhaqfllsek(seqidno:37)组成的组的序列或与其具有至少90％同一性或同源性的序列或其具有1-5个保守性氨基酸置换的序列)，已发现所述序列显著增强包含一个或多个这些增强子氨基酸序列的融合蛋白自细菌或其他生物体的表达和/或分泌。此类增强子序列对提高融合蛋白内所含的抗原序列的表达和/或分泌特别有用。例如，当包含本发明的核酸序列的细菌用作疫苗或癌症免疫治疗剂时，与缺乏此类增强子氨基酸序列的融合蛋白相比，由于增强子序列而提高的表达/分泌提高了对抗原序列的免疫应答。“胞外液”包括例如血清、血浆、血液、间质液、脑脊髓液、分泌流体、淋巴、胆汁、汗、粪便物及尿。“胞外液”可包含胶体或悬浮液，例如全血或凝固的血液。在多肽上下文中术语“片段”包括所含氨基酸序列为较大多肽的氨基酸序列的至少5个邻接氨基酸残基、至少10个邻接氨基酸残基、至少15个邻接氨基酸残基、至少20个邻接氨基酸残基、至少25个邻接氨基酸残基、至少40个邻接氨基酸残基、至少50个邻接氨基酸残基、至少60个邻接氨基酸残基、至少70个邻接氨基酸残基、至少80个邻接氨基酸残基、至少90个邻接氨基酸残基、至少100个邻接氨基酸残基、至少125个邻接氨基酸残基、至少150个邻接氨基酸残基、至少175个邻接氨基酸残基、至少200个邻接氨基酸残基或至少250个邻接氨基酸残基的肽或多肽。“基因”是指编码寡肽或多肽的核酸序列。寡肽或多肽可为生物学活性、抗原活性、生物学惰性或抗原惰性等。术语基因包括例如编码特定寡肽或多肽的开放阅读框(orf)的总和；orf加上编码内含子的核酸的总和；orf与可操作连接的启动子的总和；orf与可操作连接的启动子及任何内含子的总和；orf与可操作连接的启动子、内含子和启动子及诸如增强子的其他调控元件的总和。在某些实施方案中，“基因”包括调控基因表达所需的呈顺式的任何序列。术语基因也可指编码包括抗原的肽或肽、寡肽、多肽或蛋白质的抗原活性片段的核酸。术语基因不一定暗示所编码的肽或蛋白质具有任何生物活性，或甚至肽或蛋白质为抗原活性的。编码不可表达的序列的核酸序列通常视为假基因。术语基因也包括编码诸如rrna、trna的核糖核酸或核酶的核酸序列。诸如李斯特菌属的细菌的“生长”包括(不限于)细菌生理及与定殖、复制、蛋白质含量增加和/或脂质含量增加相关的基因功能。除非明确地或上下文另外说明，否则李斯特菌属的生长包括细菌在宿主细胞外的生长，以及在宿主细胞内的生长。生长相关的基因包括(不暗示任何限制)介导能量产生(例如糖酵解、克氏循环(krebscycle)、细胞色素)，氨基酸、糖、脂质、矿物质、嘌呤和嘧啶的合成代谢和/或分解代谢，营养运输、转录、翻译和/或复制的基因。在一些实施方案中，李斯特菌属细菌的“生长”是指李斯特菌属细菌的胞内生长，即在诸如哺乳动物细胞的宿主细胞内的生长。虽然李斯特菌属细菌的胞内生长可通过光学显微镜术或集落形成单位(cfu)测定来测量，但生长不受任何测量技术限制。诸如李斯特菌属抗原数量、李斯特菌属核酸序列或李斯特菌属细菌的特定脂质的生化参数可用于评估生长。在一些实施方案中，介导生长的基因为特异性介导胞内生长的基因。在一些实施方案中，特异性介导胞内生长的基因包括(但不限于)其中基因失活降低胞内生长速率但不可检测地、大幅或明显地降低胞外生长(例如在肉汤中生长)速率的基因，或其中基因失活降低胞内生长速率的程度高于其降低胞外生长速率的程度的基因。为提供非限制性实例，在一些实施方案中，其中失活降低胞内生长速率的程度高于胞外生长的基因包括其中失活降低胞内生长达不足正常或最大值的50％，但降低胞外生长仅达最大值的1-5％、5-10％或10-15％的情况。在某些方面中，本发明包括胞内生长减弱但胞外生长未减弱的李斯特菌属，胞内生长未减弱且胞外生长未减弱的李斯特菌属以及胞内生长未减弱但胞外生长减弱的李斯特菌属。“亲水性分析”是指通过kyte和doolittle的方法分析多肽序列："asimplemethodfordisplayingthehydropathiccharacterofaprotein".j.mol.biol.157(1982)105-132。在这种方法中，给予各氨基酸介于4.6至-4.6之间的疏水性评分。4.6的评分为疏水性最大，并且-4.6的评分为亲水性最大。然后设定窗口大小。窗口大小为对疏水性评分求平均值且分配给窗口中第一氨基酸的氨基酸数目。计算自氨基酸的第一窗口开始并计算该窗口中所有疏水性评分的平均值。然后窗口往下移一个氨基酸并计算第二窗口中所有疏水性评分的平均值。该模式继续至蛋白质末端，计算各窗口的平均评分，并将其分配给窗口中的第一氨基酸。然后将平均值绘在图上。y轴表示疏水性评分而x轴表示窗口数目。以下疏水性评分用于20种常见氨基酸。“经标记的”组合物可通过光谱法、光化学法、生物化学法、免疫化学法、同位素法或化学法直接或间接检测。例如，可用标记包括32p、33p、35s、14c、3h、125i、稳定同位素、表位标签、荧光染料、电子致密试剂、底物或的酶(例如，如酶联免疫测定中所用)，或仿氟(fluorette)(参见例如rozinov和nolan(1998)chem.biol.5:713-728)。关于融合蛋白产物，“连接”在其用于本文中时是指融合蛋白内本发明的两个氨基酸序列(例如，如本文所述的分泌信号序列和第一氨基酸序列)经由一个序列的羧基末端与另一个序列的氨基末端的肽键直接连接，或者可经由一个或多个氨基酸(例如1-100个、1-50个、1-20个、1-10个、1-9个、1-8个、1-7个、1-6个、1-5个、1-4个、1-3个、1-2个或1个氨基酸)的“接头序列”的肽键连接。本领域的技术人员可容易地提供产生目标融合蛋白所必需的核酸序列，例如其中所述一个或多个氨基酸序列将例如信号序列连接至如本文所述的包含增强子序列的第一氨基酸序列。在一些情况下，连接本发明的两个氨基酸序列的所述一个或多个氨基酸序列是用于制备本发明的核酸的限制位点的结果。在限制酶产物接合后，所得核酸序列将残余氨基酸序列翻译成融合蛋白，此类序列在本文中可称为“限制片段残基”。此类限制片段残基为本领域中所熟知，并且通常为2个氨基酸。例如，在使用bamhi限制序列的情况下，核酸的所得ggatcc序列在表达为蛋白质融合序列的两个氨基酸组分之间产生残余gs连接。类似地，spei限制序列actagt产生残余ts连接。“配体”是指作为受体的激动剂或拮抗剂的小分子、肽、多肽或膜相关或膜结合分子。“配体”还包括并非为激动剂或拮抗剂，并且不具有激动剂或拮抗剂性质的结合剂。按照惯例，在配体经膜结合于第一细胞上的情况下，受体通常存在于第二细胞上。第二细胞可与第一细胞具有相同身份(相同名称)，或其可具有不同身份(不同名称)。配体或受体可完全在胞内，即，其可存在于胞液、细胞核或一些其他胞内隔室内。配体或受体可改变其位置，例如从胞内隔室到质膜外面。配体与受体的复合物称为“配体受体复合物”。在配体和受体与信号传导途径相关的情况下，配体存在于信号传导途径的上游位置且受体存在于下游位置。“核酸”是指呈单链、双链形式或者多链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合体。核酸的非限制性实例为例如cdna、mrna、寡核苷酸和多聚核苷酸。特定核酸序列也可暗含“等位基因变体”和“剪接变体”。“新抗原”或“新抗原序列”是指其中形成了新抗原的个体的免疫系统先前未曾识别出的新形成的抗原。新抗原常常与致癌或病毒感染细胞有关。当蛋白质经历生物化学途径内进一步修饰，诸如糖基化、磷酸化或蛋白水解或在核酸水平上的突变时，可形成新抗原。通过改变其他方面正常的蛋白质的结构，随着产生新的抗原决定簇，该过程可产生新表位(称为“新抗原决定簇”)。此类抗原是新的且对个体中的肿瘤细胞或病毒感染细胞可具特异性(例如由于肿瘤细胞中基因内突变的结果)，并且为针对肿瘤或病毒的免疫疗法提供标靶。在本发明的上下文中，患癌症的个体将优选在癌细胞上表达一种或多种新抗原。个体的癌症，即肿瘤细胞，可进行活检和测定，以确定任何新抗原的身份，新抗原可经工程化成本发明的融合蛋白构建体以达成免疫疗法的目的。因此，如本文所述的融合蛋白可包含一种或多种独立选择的新抗原，例如1-50种、1-25种、1-20种、1-19种、1-18种、1-17种、1-16种、1-15种、1-14种、1-13种、1-12种、1-11种、1-10种、1-9种、1-8种、1-7种、1-6种、1-5种、1-4种、1-3种、1-2种或1种独立选择的新抗原序列。在启动子及编码mrna的核酸的上下文中，“可操作地连接”意指启动子可用于引发该核酸的转录。术语“序列同一性百分比”和“序列同一性％”是指通过比较或比对两个或更多个氨基酸或核酸序列所发现的序列相似性百分比。可通过比对序列而直接比较两个分子之间的序列信息，计算两个比对序列之间的精确匹配数，除以较短序列的长度并将结果乘以100来确定同一性百分比。用于计算同一性百分比的算法为smith-waterman同源性搜寻算法(参见例如kann和goldstein(2002)proteins48:367-376；arslan等(2001)bioinformatics17:327-337)。“药学上可接受的赋形剂”或“诊断学上可接受的赋形剂”是指可与例如包含如本文所述的核酸的细菌一起(即，以调配物的形式)用于治疗或诊断用途的赋形剂。此类赋形剂包括(但不限于)无菌蒸馏水、盐水、磷酸盐缓冲溶液、基于氨基酸的缓冲液或碳酸氢盐缓冲溶液。所选赋形剂及所用赋形剂的量将视用途而定，例如用于治疗或诊断用途的施用模式(例如经口、静脉内、皮下、经皮、皮内、肌内、粘膜、肠胃外、器官内、病灶内、鼻内、吸入、眼内、肌内、血管内、结内、经划痕、直肠、腹膜内或多种熟知施用途径的任一种或组合)。在提及多肽或核酸时，“纯化”和“分离”意指多肽中基本上不存在其在自然界中相关联的其他生物大分子。在一些实施方案中，如本文所述的本发明的核酸分子和融合蛋白是经分离的核酸分子或融合蛋白。如本文所用的术语“纯化”意指所鉴定的多肽或核酸常常按重量计占所存在的多肽的至少50％，更经常占至少60％，典型地占至少70％，更典型地占至少75％，最典型地占至少80％，通常占至少85％，更通常占至少90％，最通常占至少95％，并且常规地占至少98％或更高。水、缓冲剂、盐、清洁剂、还原剂、蛋白酶抑制剂、稳定剂(包括诸如白蛋白的附加蛋白质)和赋形剂以及分子量小于1000的分子的重量一般不用于确定多肽纯度。参见例如颁发给covacci等的美国专利第6,090,611号中纯度的讨论。“肽”是指短氨基酸序列，其中氨基酸通过肽键彼此连接。肽可游离存在或结合于另一部分，诸如大分子、脂质、寡糖或多糖和/或多肽。在肽并入多肽链中的情况下，术语“肽”仍然可用于特指短氨基酸序列。“肽”可通过肽键或一些其他类型的连键连接至另一部分。肽长度为至少两个氨基酸且长度一般小于约25个氨基酸，其中最大长度随惯例或上下文而变。术语“肽”和“寡肽”可互换使用。“蛋白质”一般是指包含多肽链的氨基酸序列。蛋白质也可指多肽的三维结构。“变性蛋白”是指具有一些残余三维结构的部分变性多肽，或可替代地，是指基本上随机的三维结构，即全部变性。本发明包括多肽变体的试剂和使用多肽变体的方法，例如涉及糖基化、磷酸化、硫酸化、形成二硫键、去酰胺、异构化、信号或前导序列加工中的裂解点、共价和非共价结合的辅因子、氧化变体等。描述二硫化物连接的蛋白质的形成(参见例如woycechowsky和raines(2000)curr.opin.chem.biol.4:533-539；creighton等，(1995)trendsbiotechnol.13:18-23)。“重组”在提及例如核酸、细胞、动物、病毒、质粒、载体等使用时，指示通过引入外源性非天然核酸、改变天然核酸或通过由重组核酸、细胞、病毒、质粒或载体完全或部分衍生进行修饰。重组蛋白是指例如由重组核酸、病毒、质粒、载体等衍生的蛋白质。“重组细菌”包括其中基因组通过重组方法，例如经由突变、缺失、插入和/或重排进行工程化的细菌。“重组细菌”还包括经修饰为包括重组基因组外核酸，例如质粒或第二染色体的细菌，或其中存在的基因组外核酸改变的细菌。“样品”是指来自人、动物、安慰剂或研究样品的样品，例如细胞、组织、器官、流体、气体、气溶胶、浆液、胶体或凝结物质。“样品”可在体内测试，例如不从人或动物取出，或其可在体外测试。可在例如通过组织学方法加工之后，测试样品。“样品”也指例如包含流体或组织样品的细胞或与流体或组织样品分离的细胞。“样品”也可指自人或动物新鲜获取的细胞、组织、器官或流体，或经加工或储存的细胞、组织、器官或流体。“可选择标记物”包括允许选择或排除含有可选择标记物的细胞的核酸。可选择标记物的实例包括(不限于)例如：(1)编码对其他有毒化合物(例如抗生素)提供抗性的产物或编码对其他无害化合物(例如蔗糖)的敏感性的核酸；(2)编码在受体细胞中另外缺乏的产物的核酸(例如trna基因、营养缺陷型标记物)；(3)编码抑制基因产物活性的产物的核酸；(4)编码容易鉴定的产物的核酸(例如表型标记物，诸如β-半乳糖苷酶、绿色荧光蛋白(gfp)、细胞表面蛋白、表位标签、flag标签)；(5)可通过杂交技术，例如pcr或分子标志鉴定的核酸。在提及配体/受体、核酸/互补核酸、抗体/抗原或其他结合对(例如细胞因子与细胞因子受体)时，“特异性地”或“选择性地”结合指示确定蛋白质及其他生物制剂的异源群体中该蛋白质存在的结合反应。因此，在规定条件下，指定配体结合特定受体而不大量结合样品的存在的其他蛋白质。特异性结合也可意指，例如所考虑的方法的结合化合物、核酸配体、抗体或源自抗体的抗原结合位点的结合组合物以比任何其他结合化合物的亲和力经常高至少25％、更经常高至少50％、最经常高至少100％(2倍)、正常高至少10倍、更正常高至少20倍且最正常高至少100倍的亲和力结合其标靶。在一个典型实施方案中，抗体将具有高于约109l/mol的亲和力，如例如通过scatchard分析测定(munsen等(1980)analyt.biochem.107:220-239)。熟练技术人员认识到，一些结合化合物可特异性地结合于一个以上标靶，例如抗体特异性结合其抗原，经由抗体的寡糖结合凝集素，和/或经由抗体的fc区结合fc受体。细菌的“传播”包括“细胞至细胞传播”，即如例如通过囊泡介导，细菌从第一宿主细胞传输至第二宿主细胞。关于传播的功能包括(但不限于)例如形成肌动蛋白尾、形成伪足样延长及形成双膜空泡。如本文所用的术语“受试者”是指人或非人类生物体。因此，本文所述的方法和组合物适用于人类与兽医学疾病。在某些实施方案中，受试者为“患者”，即正在接受针对疾病或病状的医疗护理的活人。这包括正针对病理体征进行调查且未界定为患病的人。重组酶的“靶位点”是由重组酶识别、结合和/或起作用的核酸序列或区域(参见例如颁发给graham等的美国专利第6,379,943号；smith和thorpe(2002)mol.microbiol.44:299-307；groth和calos(2004)j.mol.biol.335:667-678；nunes-duby等(1998)nucleicacidsres.26:391-406)。“治疗有效量”被定义为试剂或药物组合物足够显示患者益处，即引起所治病状的症状减少、预防或改善的量。当药剂或药物组合物包含诊断剂时，“诊断有效量”被定义为足够产生信号、影像或其他诊断参数的量。药物制剂的有效量将根据诸如以下因素变化：个体的易感性程度、个体的年龄、性别和体重以及个体的特异性体质反应(参见例如颁发给netti等的美国专利第5,888,530号)。“治疗”(关于病状或疾病)是获得有益或所需结果，包括且优选为临床结果的方法。出于本发明的目的，关于疾病的有益或所需结果包括(但不限于)以下一个或多个：改善与疾病有关的病状、治愈疾病、减轻疾病严重程度、延迟疾病进展、延迟疾病复发、减轻与疾病有关的一种或多种症状、提高罹患疾病的人的生活质量和/或延长存活。同样，出于本发明的目的，关于病状的有益或所需结果包括(但不限于)以下一个或多个：改善病状、治愈病状、减轻病状严重程度、延迟病状进展、延迟病状复发、减轻与病状有关的一种或多种症状、提高罹患病状的人的生活质量和/或延长存活。“疫苗”包括预防性疫苗，包括用于预防疾病复发的疫苗。疫苗也包括治疗性疫苗，例如向包含与疫苗所提供的抗原或表位相关的病状或病症的哺乳动物施用的疫苗。“免疫原性”在该术语用于本文中时意指抗原能够引起抗原特异性体液或t细胞应答(cd4+和/或cd8+)。可用多种方式选择一种或多种抗原或其衍生物用于本发明的疫苗组合物中，所述方式包括评估所选细菌成功表达及分泌一种或多种重组抗原的能力；和/或一种或多种重组抗原引发抗原特异性cd4+和/或cd8+t细胞应答的能力。如下文所论述，为了最终选择随特定细菌递送媒介物使用的一种或多种抗原，一种或多种重组抗原的这些属性优选与完整疫苗平台的能力组合(意指针对一种或多种所选抗原选择的细菌表达系统)，以引发先天免疫应答以及针对一种或多种重组表达的抗原的抗原特异性t细胞应答。合适抗原的最初确定可通过选择由所选细菌宿主(例如李斯特菌属)成功重组表达且具免疫原性的一种或多种抗原或一个或多个抗原片段来进行。可通过蛋白质印迹，使用检测重组产生的抗原序列的抗体或使用检测所包括的与抗原一起表达为融合蛋白的序列(“标签”)的抗体，直接检测重组抗原的表达。例如，一种或多种抗原可与李斯特菌属acta蛋白质的n端部分一起表达为融合物，并且针对与acta的成熟n末端18个氨基酸对应的合成肽(atdsedsslntdeweeek(seqidno:77))产生的抗acta抗体可用于检测所表达的蛋白质产物。用于测试抗原免疫原性的测定在本文中予以描述且为本领域所熟知。举例而言，由所选细菌重组产生的抗原可任选地被构建为含有编码八氨基siinfekl(seqidno:38)肽(也称为sl8和卵白蛋白257-264)的核苷酸序列，其在抗原的羧基末端处定位在框内。诸如c端sl8表位的组合物充当替代品(i)以证明重组抗原正从n端至c端完全表达；以及(ii)使用体外抗原呈递分析法，证明抗原呈递细胞经由mhci类途径呈递重组抗原的能力。此类呈递测定可使用经克隆的c57bl/6衍生的树突状细胞系dc2.4以及b3zt细胞杂交瘤细胞系进行，如下所述。可替代地或另外地，可使用如下文所述的elispot测定来测试免疫原性。最初开发elispot测定用于列举分泌抗原特异性抗体的b细胞，但随后适于执行多种任务，尤其是在单细胞水平上鉴定和列举产生细胞因子的细胞。可从接种有适当细菌疫苗的动物收获脾，并且经分离的脾细胞用或不用源自细菌疫苗所表达的一种或多种抗原的肽一起孵育过夜。固定的抗体捕获任何分泌的ifn-γ，因此允许随后测量分泌的ifn-γ，并评估对疫苗的免疫应答。2.重组表达系统-“疫苗平台”已开发许多细菌菌种用作疫苗并且可用于本发明中，包括(但不限于)弗氏志贺菌(shigellaflexneri)、大肠杆菌、单核细胞增多性李斯特菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌(yersiniaenterocolitica)、鼠伤寒沙门氏菌(salmonellatyphimurium)、伤寒沙门氏菌(salmonellatyphi)或分枝杆菌菌种，优选为单核细胞增多性李斯特菌。该清单并非意欲限制。参见例如wo04/006837；wo07/103225；以及wo07/117371，其各自据此通过引用整体并入，包括所有表格、附图和权利要求。用于疫苗组合物中的细菌载体可为兼性胞内细菌载体。细菌可用于在宿主生物体中将本文所述的多肽递送至抗原呈递细胞。如本文所述，单核细胞增多性李斯特菌为表达本发明的抗原提供了优选疫苗平台。重组载体是使用本领域中已知的标准技术制备的，并且含有可操作地连接至编码靶抗原的核苷酸序列的合适控制元件。参见例如plotkin等(编辑)(2003)vaccines，第4版，w.b.saunders,co.,phila.,pa.；sikora等(编辑)(1996)tumorimmunologycambridgeuniversitypress,cambridge,uk；hackett和harn(编辑)vaccineadjuvants,humanapress,totowa,nj；isaacson(编辑)(1992)recombinantdnavaccines,marceldekker,ny,ny；morse等(编辑)(2004)handbookofcancervaccines,humanapress,totowa,nj；liao等(2005)cancerres.65:9089-9098；dean(2005)expertopin.drugdeliv.2:227-236；arlen等(2003)expertrev.vaccines2:483-493；delacruz等(2003)vaccine21:1317-1326；johansen等(2000)eur.j.pharm.biopharm.50:413-417；excler(1998)vaccine16:1439-1443；disis等(1996)j.immunol.156:3151-3158。描述了肽疫苗(参见例如mccabe等(1995)cancerres.55:1741-1747；minev等(1994)cancerres.54:4155-4161；snyder等(2004)j.virology78：7052-7060)。也可使用裸dna载体及裸rna载体提供抗原表达平台。这些含有核酸的疫苗可通过基因枪、电穿孔、细菌菌影(bacterialghost)、微球体、微粒、脂质粒、聚阳离子型纳米粒子等施用(参见例如donnelly等(1997)ann.rev.immunol.15:617-648；mincheff等(2001)crit.rev.oncol.hematol.39:125-132；song等(2005)j.virol.79:9854-9861；estcourt等(2004)immunol.rev.199:144-155)。可获得例如经由基因枪、皮内、肌内及电穿孔方法施用裸核酸的试剂和方法。核酸疫苗可包含锁核酸(lna)，其中lna允许功能部分附接至质粒dna，并且其中功能部分可为佐剂(参见例如fensterle等(1999)j.immunol.163:4510-4518；strugnell等(1997)immunol.cellbiol.75:364-369；heitoughs等(2003)nucleicacidsres.31:5817-5830；trimble等(2003)vaccine21:4036-4042；nishitani等(2000)mol.urol.4:47-50；tuting(1999)curr.opin.mol.ther.1:216-225)。核酸疫苗可与促进不成熟树突状细胞朝向疫苗迁移的试剂及促进成熟dc向其中可能发生初免的引流淋巴结迁移的试剂组合使用，其中这些试剂包括mip-1α和flt3l(参见例如kutzler和weiner(2004)j.clin.invest.114:1241-1244；sumida等(2004)j.clin.invest.114:1334-1342)。减毒与共生微生物已成功地用作疫苗抗原的载剂，但抗原的细菌载剂任选经减毒或杀伤但具代谢活性(kbma)。可调节用于调配物的载剂菌株的遗传背景、选择用于实现减毒的突变类型及免疫原的固有特性以优化所引起的免疫应答的程度及质量。认为使细菌载剂所刺激的免疫应答优化的一般因素包括：载剂的选择；特定背景菌株、减毒突变和减毒水平；减毒表型的稳定及最佳剂量的确定。其他考虑的抗原相关因素包括：抗原的固有特性；表达系统、抗原展示形式及重组表型的稳定；调节分子的共表达及疫苗接种时间表。疫苗平台的优选特征为引发先天免疫应答以及针对一种或多种重组表达的抗原的抗原特异性t细胞应答的能力。例如，表达一种或多种本文所述抗原的单核细胞增多性李斯特菌可诱导肝内1型干扰素(ifn-α/β)及趋化因子及细胞因子的下游级联。响应于这种肝内免疫刺激，nk细胞和抗原呈递细胞(apc)募集至肝脏。在某些实施方案中，本发明的疫苗平台在疫苗平台递送至受试者后24小时诱导选自由以下组成的组的细胞因子和趋化因子中的一种或多种并且优选全部的血清浓度的增加：il-12p70、ifn-γ、il-6、tnfα及mcp-1；并且诱导针对疫苗平台表达的一种或多种抗原的cd4+和/或cd8+抗原特异性t细胞应答。在其他实施方案中，本发明的疫苗平台还诱导驻留的不成熟肝nk细胞的成熟，如通过小鼠模型系统中诸如dx5、cd11b和cd43的活化标记物上调所证明，或通过使用用作靶细胞的经51cr标记的yac-1细胞测量的nk细胞介导的细胞溶解活性所证明。在各种实施方案中，本发明的疫苗及免疫原性组合物可包含经被造以表达本发明的融合蛋白的单核细胞增多性李斯特菌。单核细胞增多性李斯特菌用作疫苗载体的能力已在wesikirch等，immunol.rev.158:159-169(1997)中进行了综述。单核细胞增多性李斯特菌的许多自然生物学所需特征使其成为有吸引力的应用于治疗疫苗的平台。主要基本原理为单核细胞增多性李斯特菌的胞内生命周期能够有效刺激cd4+和cd8+t细胞免疫性。响应于感染后与单核细胞增多性李斯特菌大分子的相互作用，触发多种病原体相关分子模式(pamp)受体，包括tlr(tlr2、tlr5、tlr9)及核苷酸结合寡聚结构域(nod)，使先天免疫效应子全活化(pan-activation)且释放th-1极化细胞因子，从而对针对所表达的抗原发展cd4+和cd8+t细胞应答发挥深远影响。最近，已开发单核细胞增多性李斯特菌菌株作为异源蛋白质的有效胞内递送媒介物，将抗原递送至免疫系统以诱导针对不允许注射致病剂的临床病状(诸如癌症和hiv)的免疫应答。参见例如美国专利第6,051,237号；gunn等，j.immunol.,167:6471-6479(2001)；liau等，cancerresearch,62:2287-2293(2002)；美国专利第6,099,848号；wo99/25376；wo96/14087号；以及美国专利第5,830,702号，其各自据此通过引用整体并入，包括所有表格、附图和权利要求。表达淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(lcmv)抗原的重组单核细胞增多性李斯特菌疫苗也已显示会诱导针对抗原的保护性的细胞介导的免疫(shen等，proc.natl.acad.sci.usa,92:3987-3991(1995)。已产生可用于免疫原性组合物的单核细胞增多性李斯特菌的减毒且杀伤但具代谢活性的形式(wo04/006837；wo04/084936；wo04/110481；wo05/037233；wo05/092372；wo06/036550；wo07/103225；wo07/117371；wo08/109155；wo08/130551；wo08/140812；wo09/143085；wo09/143167；wo10/040135；wo11/060260；和wo14/074635)，其各自据此通过引用整体并入，包括所有表格、附图和权利要求。单核细胞增多性李斯特菌的acta蛋白质足以促进负责胞内运动的肌动蛋白募集和聚合事件。人类安全研究已报导，口服施用acta/plcb缺失的单核细胞增多性李斯特菌减毒形式未在成年人中引起严重后遗症(angelakopoulos等，infectionandimmunity,70:3592-3601(2002))。还已描述单核细胞增多性李斯特菌其他类型的减毒形式(参见例如wo99/25376及美国专利第6,099,848号，其描述表达异种抗原的李斯特菌属的营养缺陷型减毒菌株)。在某些实施方案中，用于本发明的疫苗组合物中的单核细胞增多性李斯特菌为活的减毒菌株，其包含acta和/或inlb的减毒突变，及优选acta和inlb全部或一部分缺失(本文中称为“lm△acta/△inlb”)，并且含有编码包含目标抗原的融合蛋白的表达的重组dna。含有抗原的融合蛋白优选处于细菌表达序列的控制下且稳定地整合到单核细胞增多性李斯特菌基因组中。因此此类单核细胞增多性李斯特菌疫苗株未采用真核转录或翻译元件。本发明还考虑到在至少一种调控因子，例如启动子或转录因子减弱的李斯特菌。以下关于启动子。acta表达受两种不同启动子调控(vazwuez-boland等(1992)infect.immun.60:219-230)。inla和inlb表达一起受五种启动子调控(lingnau等(1995)infect.immun.63:3896-3903)。转录因子prfa是许多单核细胞增多性李斯特菌基因例如hly、plca、acta、mpl、prfa和iap转录所需的。prfa的调控特性通过例如prfa依赖性启动子(pinlc)和prfa-盒介导。在某些实施方案中，本发明提供编码acta启动子、inlb启动子、prfa、pinlc、prfa盒等至少一种失活、突变或缺失的核酸(参见例如lalicmullthaler等(2001)mol.microbiol.42:111-120；shetron-rama等(2003)mol.microbiol.48:1537-1551；luo等(2004)mol.microbiol.52:39-52)。可通过gly145ser突变、gly155ser突变或glu77lys突变使prfa具组成性活性(参见例如mueller和freitag(2005)infect.immun.73:1917-1926；wong和freitag(2004)j.bacteriol.186:6265-6276；ripio等(1997)j.bacteriol.179:1533-1540)。减毒可通过例如热处理或化学修饰来实现。减毒也可通过对调节例如代谢、细胞外生长或胞内生长的核酸进行遗传修饰；对编码毒力因子(诸如李斯特菌属prfa、acta、李斯特菌属溶胞素(llo)、粘附介导因子(例如内化素，诸如inla或inlb)、mpl、磷脂酰胆碱磷脂酶c(pc-plc)、磷脂酰肌醇-特异性磷脂酶c(piplc；plca基因))的核酸，上述各者的任何组合等进行基因修饰来实现。可通过比较减毒李斯特菌的生物功能与适当母体李斯特菌属显示的对应生物功能来评估减毒。在其他实施方案中，本发明提供了通过用核酸靶向剂诸如交联剂、补骨脂素、氮芥、顺铂、大体积加合物、紫外光、γ辐射、其任何组合等处理来减毒的李斯特菌属。通常，由一个交联剂分子产生的损害涉及双螺旋的两条链的交联。本发明的李斯特菌属也可通过使例如uvra、uvrb、uvrab、uvrc、uvrd、uvrab、phra的至少一种核酸修复基因和/或例如reca的介导重组修复的基因发生突变来减毒。此外，本发明提供通过核酸靶向剂和通过使核酸修复基因发生突变两者来减毒的李斯特菌属。另外，本发明包括用诸如补骨脂素的光敏核酸靶向剂和/或诸如补骨脂素的光敏核酸交联剂进行处理，接着暴露于紫外光。可用于本发明的减毒李斯特菌属在例如美国专利公开第2004/0228877号和第2004/0197343号以及pct公开案wo04/006837；wo04/084936；wo04/110481；wo05/037233；wo05/092372；wo06/036550；wo07/103225；wo07/117371；wo08/109155；wo08/130551；wo08/140812；wo09/143085；wo09/143167；wo10/040135；wo11/060260；和wo14/074635中有描述，其各自通过引用整体并入本文。用于评估特定李斯特菌属菌株是否具有所需减毒的多种测定提供于例如美国专利公开第2004/0228877号、第2004/0197343号和第2005/0249748号中，其各自通过引用整体并入本文。在其他实施方案中，用于本发明的疫苗组合物中的单核细胞增多性李斯特菌是源自lm△acta/△inlb的被杀伤但具代谢活性(kbma)的平台，并且还缺失uvra与uvrb，即编码核苷酸切除修复(ner)途径的dna修复酶的基因，并且含有对融合蛋白的表达编码的重组dna。一种或多种目标抗原优选处于细菌表达序列的控制下，并且被稳定地整合到单核细胞增多性李斯特菌基因组中。kbma平台对通过合成补骨脂素、s-59和长波紫外光的组合处理进行的光化学失活极其敏感。尽管被杀伤，但kbma单核细胞增多性李斯特菌疫苗仍可短暂表达其基因产物，从而允许其逃脱吞噬溶酶体并诱导针对野生型wtlm和牛痘病毒攻击的功能性细胞免疫和保护。在某些实施方案中，减毒或kbma单核细胞增多性李斯特菌疫苗株包含组成性活性prfa基因(本文称为prfa*突变体)。prfa是一种在细胞内活化的转录因子，其诱导毒力基因和编码的异种抗原(ag)在经适当工程化的疫苗株中的表达。如上所述，acta基因的表达响应于prfa，并且acta启动子为prfa响应性调控元件。引入prfag155s等位基因可赋予活减毒或kbma疫苗显著增强的疫苗效价。优选prfa突变体在2009年5月18日提交的标题为compositionscomprisingprfa*mutantlisteriaandmethodsofusethereof的wo2009/143085中有描述，其据此整体并入，包括所有表格、附图和权利要求。3.抗原构建体本发明的融合蛋白的抗原部分优选包含编码用于支持分泌的在疫苗平台内可操作的分泌序列、本发明的一个或多个增强子序列以及待表达的一种或多种抗原的核酸。在细菌平台的情况下，所得融合蛋白可操作地连接至由细菌疫苗平台表达融合蛋白所必需的调控序列(例如启动子)。本发明不限于分泌的多肽和肽抗原，而且还包括从李斯特菌属或其他细菌不分泌或不能分泌的多肽和肽。但优选地，当细菌疫苗株被接种至接受者时，一种或多种抗原由该细菌疫苗株表达为可溶性分泌的形式。可用于本发明的抗原的实例(不限于)列于下表中。靶抗原也可为包含下表1中所列的若干抗原的免疫活性部分的片段或融合多肽。本发明的融合蛋白可包含一个以上抗原序列。该清单并非意欲限制。表1.抗原合适抗原为本领域中已知的其他生物体包括(但不限于)沙眼衣原体(chlamydiatrachomatis)、化脓性链球菌(streptococcuspyogenes)(a群链球菌)、无乳链球菌(streptococcusagalactia)(b群链球菌)、肺炎链球菌(streptococcuspneumonia)、金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus)、大肠杆菌、流感嗜血杆菌(haemophilusinfluenzae)、脑膜炎奈瑟球菌(neisseriameningitidis)、淋病奈瑟菌(neisseriagonorrheae)、霍乱弧菌(vibriocholerae)、沙门氏菌属种(salmonellaspecies)(包括伤寒沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌)、肠道沙门氏菌(enterica)(包括幽门螺旋杆菌(helicobactorpylori)、弗氏志贺菌及其他d群志贺菌属菌种)、鼻疽伯克霍尔德氏菌(burkholderiamallei)、类鼻疽伯克霍尔德氏菌(burkholderiapseudomallei)、肺炎克雷伯杆菌(klebsiellapneumonia)、梭菌属种(clostridiumspecies)(包括艰难梭菌(c.difficile))、副溶血弧菌(vibrioparahaemolyticus)及创伤弧菌(v.vulnificus)。该列表并非意在限制。下表2公开了用于表达和分泌目标融合蛋白多肽的信号肽的许多非限制性实例，诸如抗原序列。信号肽倾向于含有三个结构域：带正电n-末端(1-5个残基长)；中央疏水性结构域(7-15个残基长)；以及中性但极性的c-末端结构域。表2.细菌信号途径。信号肽通过信号肽酶位点鉴定。在下文描述的某些示例性实施方案中，融合蛋白在其氨基末端处融合至单核细胞增多性李斯特菌acta或llo蛋白质的氨基末端部分，这允许在接种宿主内从细菌表达和分泌融合蛋白。acta信号序列为mglnrfmrammvvfitancitinpdiifa(seqidno:41)；llo信号序列为mkkimlvfitlilvslpiaqqte(seqidno:42)。优选地，构建体中所用天然信号序列未经修饰。抗原可表达为融合至单核细胞增多性李斯特菌acta蛋白质的氨基末端部分的单个多肽，该蛋白质包含其分泌信号序列且允许在宿主细胞内自细菌表达及分泌融合蛋白。该acta片段可包含acta的至少前59个氨基酸，或与acta的至少前59个氨基酸具有至少约80％序列同一性、至少约85％序列同一性、至少约90％序列同一性、至少约95％序列同一性或至少约98％序列同一性的序列。在一些实施方案中，经修饰的acta包含acta的至少前100个氨基酸，或与acta的至少前100个氨基酸具有至少约80％序列同一性、至少约85％序列同一性、至少约90％序列同一性、至少约95％序列同一性或至少约98％序列同一性的序列。acta的100残基n端片段具有以下序列(seqidno:25)：在该序列中，第一残基被描绘成缬氨酸；该多肽由李斯特菌属在此位置用甲硫氨酸合成。因此，也可使用val1met置换形式。本发明的融合蛋白可包含与acta(或其他分泌信号序列，诸如llo)、增强子序列、裂解序列或抗原序列不相关联的一个或多个额外的氨基酸残基。因此，例如，分泌信号序列可连接至第一氨基酸序列(包含增强子序列)或第二氨基酸序列(包含抗原序列)且第一氨基酸序列可通过与融合蛋白的表达或分泌、裂解或抗原性质无关的氨基酸残基连接至第二氨基酸序列。连接这些序列的这些任选氨基酸残基中的每一个可为一个或多个氨基酸，例如1-100个、1-50个、1-25个、1-20个、1-25个、1-10个、1-9个、1-8个、1-7个、1-6个、1-5个、1-4个、1-3个、1-2个或1个氨基酸。此外，其中融合蛋白包含一个以上增强子序列，并且各增强子序列被描述为在氨基末端与羧基末端均连接至裂解序列，裂解序列至增强子序列的连键可为肽键，或一个或多个氨基酸，诸如1-100个、1-50个、1-25个、1-20个、1-25个、1-10个、1-9个、1-8个、1-7个、1-6个、1-5个、1-4个、1-3个、1-2个或1个氨基酸。此外，其中融合蛋白包含一个以上抗原序列，并且各抗原序列描述为在氨基末端与羧基末端均连接至裂解序列，裂解序列至抗原序列的连键可为肽键，或一个或多个氨基酸，诸如1-100个、1-50个、1-25个、1-20个、1-25个、1-10个、1-9个、1-8个、1-7个、1-6个、1-5个、1-4个、1-3个、1-2个或1个氨基酸。举例而言，包含分泌信号序列、含有在氨基末端与羧基末端均连接至裂解序列的一个或多个增强子氨基酸序列的第一氨基酸序列以及含有在氨基末端与羧基末端均连接至裂解序列的一个或多个抗原序列的第二氨基酸序列的本发明融合蛋白可表示为包含(分泌信号序列)-l1-[第一氨基酸序列]-l2-[第二氨基酸序列]或(分泌信号序列)-l3-[第二氨基酸序列]-l4-[第一氨基酸序列]的多肽结构。进一步举例而言，其中融合蛋白包括两个增强子氨基酸序列和两个抗原序列，这可表示为(分泌信号序列)-l1-[(裂解序列1)-l5-(增强子序列1)-l6-(裂解序列1')-l7-(裂解序列2)-l8-(增强子序列2)-l9-(裂解序列2')]-l2-[(裂解序列3)-l10-(抗原序列1)-l11-(裂解序列3')-l12-(裂解序列4)-l13-(抗原序列2)-l14-(裂解序列4')]或(分泌信号序列)-l3-[(裂解序列3)-l10-(抗原序列1)-l11-(裂解序列3')-l12-(裂解序列4)-l13-(抗原序列2)-l14-(裂解序列4')]-l4-[(裂解序列1)-l5-(增强子序列1)-l6-(裂解序列1')-l7-(裂解序列2)-l8-(增强子序列2)-l9-(裂解序列2')]。在这些实例中，各l1、l2、l3、l4、l5、l6、l7、l8、l9、l10、l11、l12、l13和l14独立地选自由以下组成的组：直接键(即肽键)或一个或多个与分泌信号序列、增强子序列、裂解序列或抗原序列不相关的额外接头氨基酸残基。在一些实施方案中，各l1、l2、l3、l4、l5、l6、l7、l8、l9、l10、l11、l12、l13和l14为直接键或1-100个、1-50个、1-25个、1-20个、1-25个、1-10个、1-9个、1-8个、1-7个、1-6个、1-5个、1-4个、1-3个、1-2个或1个氨基酸。在一些实施方案中，各l1、l2、l3、l4、l5、l6、l7、l8、l9、l10、l11、l12、l13和l14为直接键、1个或2个氨基酸。在一些实施方案中，这些连键中的任一个或多个是用于制备编码融合蛋白的核酸序列的限制位点的结果。应理解本实例可适用于具有额外增强子或抗原序列的融合蛋白，即可包含l1、l2……lm此类连键，其中编号按需要续接lm以描述融合蛋白。在一些实施方案中，如本文所述的整个融合蛋白少于3,000个氨基酸、少于2,000个氨基酸、200至3,000个氨基酸、200至2,000个氨基酸、300至2,000个氨基酸之间、300至1,500个氨基酸之间或300至1,000个氨基酸之间。本发明的构建体还可包含一个或多个额外的非acta残基，位于经修饰的acta的c端残基与抗原序列之间，或当抗原序列与第一氨基酸序列的氨基末端融合时位于经修饰的acta的c端残基与第一氨基酸序列之间。在以下序列中，通过引入bamh1位点而添加的两个残基(gly-ser)使acta-n100延伸(同样，也可使用val1met置换形式)(seqidno:26)：称为actan100*的经修饰的acta可分别包含以下序列seqidno:27和seqidno:28或由其组成，当由李斯特菌属表达时按照val1met置换的讨论，不同之处仅在于第一氨基酸(破折号指示缺失且粗体字指示相对于actan100的置换)：用于抗原构建体的dna及蛋白质序列如下：当在李斯特菌属中表达时，表达actan100*蛋白质seqidno:28的dna(seqidno:36)(小写字母，无下划线：acta启动子；小写字母，加下划线：限制位点；大写字母，粗体：actan100*序列，后面插入测试构建体)：与syn1的5个拷贝融合得到以下序列(seqidno:43)(小写字母，无下划线：acta启动子；大写字母，粗体：actan100*序列；小写字母，加下划线：限制位点；大写字母，下划线：syn1x5)：当在李斯特菌属中表达时这翻译成以下蛋白质序列(seqidno:44)(大写字母，粗体：actan100*序列；小写字母，加下划线：通过限制位点增加的残基；大写字母，加下划线：syn1x5)：与syn2的5个拷贝融合得到以下序列(seqidno:45)(小写字母，无下划线：acta启动子；大写字母，粗体：actan100*序列；小写字母，加下划线：限制位点；大写字母，加下划线：syn2x5)：当在李斯特菌属中表达时这翻译成以下蛋白质序列(seqidno:46)(大写字母，粗体：actan100*序列；小写字母，加下划线：通过限制位点增加的残基；大写字母，加下划线：syn2x5)：与syn18的5个拷贝融合得到以下序列(seqidno:47)(小写字母，无下划线：acta启动子；大写字母，粗体：actan100*序列；小写字母，加下划线：限制位点；大写字母，加下划线：syn18x5)：当在李斯特菌属中表达时这翻译成以下蛋白质序列(seqidno:48)(大写字母，粗体：actan100*序列；小写字母，加下划线：通过限制位点增加的残基；大写字母，加下划线：syn18x5)：可替代地，抗原序列优选表达为融合至单核细胞增多性李斯特菌llo蛋白质的经修饰的氨基末端部分，该蛋白质允许在接种宿主内自细菌表达和分泌融合蛋白。在这些实施方案中，抗原构建体可为包含启动子可操作地连接至编码融合蛋白的核酸序列的多聚核苷酸，其中融合蛋白包含(a)经修饰的llo以及(b)在经修饰的llo序列后将表达为融合蛋白的一个或多个抗原表位。llo信号序列为mkkimlvfitlilvslpiaqqteak(seqidno:39)。在一些实施方案中，启动子为hly启动子。在一些实施方案中，融合蛋白包含(c)增强子氨基酸序列的一个或多个拷贝，各增强子氨基酸序列独立地选自由以下组成的组：seqidno:1和seqidno:37，或与其具有至少90％同一性或同源性的序列，或其具有1-5个保守性氨基酸置换的序列。在一些实施方案中，经修饰的llo包含llo的约前441个氨基酸的修饰形式，本文中称为llo-n441。llo-n441具有以下序列(seqidno:40)：在该序列中，pest基序(kensissmappasppaspk，seqidno:67)可通过用以下序列置换而在功能上缺失(破折号指示缺失且粗体字指示置换)：ke-----------------，或其完全缺失。这仅旨在为示例性的。因为由一种生物体编码的序列未必经受密码子优化以在所选疫苗平台细菌菌株中最佳表达，因此本发明还提供了通过密码子优化而改变的核酸，所述密码子优化是为了使核酸被诸如单核细胞增多性李斯特菌的细菌表达。在各种实施方案中，为提供最佳密码子，改变至少1％的任何非最佳密码子，更正常改变至少5％，最正常改变至少10％，经常改变至少20％，更经常改变至少30％，最经常改变至少40％，通常改变至少50％，更通常改变至少60％，最通常改变至少70％，理想改变至少80％，更理想改变至少90％，最理想改变至少95％，并且常规地，100％的所有非最佳密码子经密码子优化以用于李斯特菌属表达(表3)。表3.在李斯特菌属中表达的最佳密码子本发明提供许多李斯特菌属种和菌株，用于制备或工程化本发明的疫苗平台。本发明的李斯特菌不受下表中公开的种和菌株限制。适用于本发明，例如作为疫苗或核酸来源的李斯特菌属菌株。使抗原靶向专职抗原呈递细胞(apc)上的胞吞受体也代表一种增强疫苗功效的有吸引力的策略。此类靶向apc的疫苗具有将外源性蛋白质抗原引导至囊泡的特殊能力，所述囊泡有效地加工抗原以用于主要组织相容性复合物i类和ii类呈递。有效靶向不但需要对在apc表面上大量表达的受体具有高特异性，而且需要能够快速内化且加载至含有抗原加工机构元件的隔室内。在这些实施方案中，本发明的抗原是作为融合构建体提供的，所述融合构建体包括免疫原性多肽和所需的胞吞受体靶向部分。合适apc胞吞受体包括dec-205、甘露糖受体、clec9、fc受体。该清单并非意欲限制。受体靶向部分可通过重组体或使用化学交联来与抗原多肽偶联。4.治疗组合物本文所述的组合物，例如经工程化以表达如本文所述的融合蛋白用作疫苗或癌症免疫治疗剂的细菌，可单独地或与药学上可接受的赋形剂组合以足以诱导适当免疫应答的量施用给宿主。免疫应答可包括(不限于)特异性免疫应答、非特异性免疫应答、特异性和非特异性应答、先天应答、初次免疫应答、适应性免疫、二次免疫应答、记忆免疫应答、免疫细胞活化、免疫细胞增殖、免疫细胞分化及细胞因子表达。本发明的疫苗或癌症免疫治疗剂可被储存，例如冷冻、冻干，作为悬浮液、细胞糊或与固体基质或凝胶基质复合。在某些实施方案中，在向受试者施用有效剂量的含有本发明的免疫原性融合蛋白的疫苗以激发免疫应答之前或之后，施用第二疫苗。这在本领域中称为“初免-加强”方案，即，其中第一次施用的疫苗激发免疫应答，并且第二次施用的疫苗加强应答。在此类方案中，本发明的组合物及方法可用作“初免”递送、“加强”递送或“初免”递送和“加强”递送两者。举例而言，由编码和表达一种或多种抗原多肽的被杀伤但具代谢活性的李斯特菌属构成的第一疫苗可作为“初免”递送，并且由编码一种或多种抗原多肽的减毒(活的或被杀伤但具代谢活性的)李斯特菌属构成的第二疫苗可作为“加强”递送。然而应理解，初免和加强中的每一者均无需利用本发明的方法和组合物。而是，本发明考虑了将其他疫苗形式与本发明的细菌疫苗方法和组合物一起使用。以下是合适的混合初免-加强方案的实例：dna(例如质粒)疫苗初免/细菌疫苗加强；病毒疫苗初免/细菌疫苗加强；蛋白质疫苗初免/细菌疫苗加强；dna初免/细菌疫苗加强加上蛋白质疫苗加强；细菌疫苗初免/dna疫苗加强；细菌疫苗初免/病毒疫苗加强；细菌疫苗初免/蛋白质疫苗加强；细菌疫苗初免/细菌疫苗加强加上蛋白质疫苗加强；等等。该清单并非意欲限制。初免疫苗和加强疫苗可通过相同途径或通过不同途径施用。术语“不同途径”包括(但不限于)身体上的不同部位，例如经口、非经口、经肠、肠胃外、经直肠、结内(淋巴结)、静脉内、动脉、皮下、肌内、肿瘤内、肿瘤周围、输注、粘膜、鼻、脑脊髓间隔或脑脊髓液内等的部位，以及通过不同方式，例如经口、静脉内及肌内。有效量的初免或加强疫苗可以一个剂量给予，但不局限于一个剂量。因此，施用可为二次、三次、四次、五次、六次、七次、八次、九次、十次、十一次、十二次、十三次、十四次、十五次、十六次、十七次、十八次、十九次、二十次或更多次的疫苗施用。在本发明的方法中疫苗或多种疫苗施用超过一次的情况下，施用可间隔一分钟、两分钟、三分钟、四分钟、五分钟、六分钟、七分钟、八分钟、九分钟、十分钟或更多分钟的时间间隔，约一小时、两小时、三小时、四小时、五小时、六小时、七小时、八小时、九小时、十小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时、24小时的间隔等等。在以小时计的情况下，术语“约”意指加或减30分钟内的任何时间间隔。施用也可间隔一天、两天、三天、四天、五天、六天、七天、八天、九天、十天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天及其组合的时间间隔。本发明不限于时间间隔相等的给药间隔，也包括非相等间隔的给药，，例如由在1天、4天、7天和25天施用组成的初免方案，这仅为了提供非限制性实例。在某些实施方案中，可在启动初免疫苗接种后约5天；在启动初免疫苗接种后约10天；在启动初免疫苗接种的施用后约15天、约20天、约25天、约30天、约35天、约40天、约45天、约50天、约55天、约60天、约65天、约70天、约75天、约80天、约6个月以及约1年启动加强疫苗接种的施用。初免疫苗接种和加强疫苗接种之一或两者优选包括递送本发明的组合物。“药学上可接受的赋形剂”或“诊断学上可接受的赋形剂”包括(但不限于)无菌蒸馏水、盐水、磷酸盐缓冲溶液、基于氨基酸的缓冲液或碳酸氢盐缓冲溶液。所选赋形剂及所用赋形剂的量将取决于施用模式。施用可为经口施用、静脉内施用、皮下施用、经皮施用、皮内施用、肌内施用、粘膜施用、肠胃外施用、器官内施用、病灶内施用、鼻内施用、吸入施用、眼内施用、肌内施用、血管内施用、结内施用、经划痕施用、经直肠施用、腹膜内施用或多种熟知施用途径中的任一种或组合。施用可包括注射、输注或其组合。在一个优选实施方案中，施用为静脉内施用。通过非经口途径施用本发明的疫苗和癌症免疫治疗剂可避免耐受性。本领域中已知用于静脉内施用、皮下施用、肌内施用、腹膜内施用、经口施用、粘膜施用、经由尿路施用、经由生殖道施用、经由胃肠道施用或通过吸入施用的方法。对于具体患者而言有效量可根据诸如所治疗的病状、患者总体健康状况、施用途径和剂量以及副作用严重程度的因素而变化。关于治疗和诊断方法的指南是可获得的(参见例如maynard等(1996)ahandbookofsopsforgoodclinicalpractice,interpharmpress,bocaraton,fl；dent(2001)goodlaboratoryandgoodclinicalpractice,urchpubl.,london,uk)。本发明的细菌可以一定的剂量或用量施用，其中每个剂量包含至少100个细菌细胞/kg体重或更多；在某些实施方案中，1000个细菌细胞/kg体重或更多；正常至少10,000个细胞/kg体重；更正常至少100,000个细胞/kg体重；最正常至少一百万个细胞/kg体重；经常至少一千万个细胞/kg体重；更经常至少1亿个细胞/kg体重；典型地至少十亿个细胞/kg体重；通常至少100亿个细胞/kg体重；常规地至少1000亿个细胞/kg体重；并且有时至少1万亿个细胞/kg体重。本发明提供以上剂量，其中细菌施用单位为集落形成单位(cfu)，在补骨脂素处理前的cfu当量，或其中单位为细菌细胞数目。本发明的细菌可以一定的剂量或用量施用，其中每个剂量包含每70kg体重(或每1.7平方米表面积；或每1.5kg肝重)107至2×1015个cfu；每70kg体重(或每1.7平方米表面积；或每1.5kg肝重)107至1011个cfu；每70kg体重(或每1.7平方米表面积；或每1.5kg肝重)108至1010个cfu；每70kg体重(或每1.7平方米表面积；或每1.5kg肝重)107至108个cfu；每70kg体重(或每1.7平方米表面积；或每1.5kg肝重)2×107至2×108个cfu；每70kg体重(或每1.7平方米表面积；或每1.5kg肝重)5×107至5×108个cfu；每70kg体重(或每1.7平方米表面积；或每1.5kg肝重)108至109个cfu；每70kg(或每1.7平方米表面积或每1.5kg肝重)2×108至2×109个cfu；每70kg(或每1.7平方米表面积或每1.5kg肝重)5×108至5×109个cfu；每70kg(或每1.7平方米表面积或每1.5kg肝重)109至1010个cfu；每70kg(或每1.7平方米表面积或每1.5kg肝重)2×109至2×1010个cfu；每70kg(或每1.7平方米表面积或每1.5kg肝重)5×109至5×1010个cfu；每70kg(或每1.7平方米表面积或每1.5kg肝重)1011至1012个cfu；每70kg(或每1.7平方米表面积或每1.5kg肝重)2×1011至2×1012个cfu；每70kg(或每1.7平方米表面积或每1.5kg肝重)5×1011至5×1012个cfu；每70kg(或每1.7平方米表面积)1012至1013个cfu；每70kg(或每1.7平方米表面积或每1.5kg肝重)2×1012至2×1013个cfu；每70kg(或每1.7平方米表面积或每1.5kg肝重)5×1012至5×1013个cfu；每70kg(或每1.7平方米表面积或每1.5kg肝重)1013至1014个cfu；每70kg(或每1.7平方米表面积或每1.5kg肝重)2×1013至2×1014个cfu；每70kg(或每1.7平方米表面积或每1.5kg肝重)5×1013至5×1014个cfu；每70kg(或每1.7平方米表面积或每1.5kg肝重)1014至1015个cfu；每70kg(或每1.7平方米表面积或每1.5kg肝重)2×1014至2×1015个cfu；等等，湿重。还提供以上剂量中的一者或多者，其中所述剂量通过每天注射一次、每两天注射一次、每三天注射一次、每四天注射一次、每五天注射一次、每六天注射一次或每七天注射一次进行施用，其中注射方案维持例如仅一天、两天、三天、四天、五天、六天、七天、两周、三周、四周、五周或更长时间。本发明还包括以上剂量与方案的组合，例如相对较大的初始细菌剂量，接着是相对较小的后续剂量，或相对较小的初始剂量，接着是大剂量。本发明可使用例如一次/周、两次/周、三次/周、四次/周、五次/周、六次/周、七次/周、每两周一次、每三周一次、每四周一次、每五周一次等的给药方案。所述给药方案包括持续总时间段为例如一周、两周、三周、四周、五周、六周、两个月、三个月、四个月、五个月、六个月、七个月、八个月、九个月、十个月、十一个月和十二个月的给药。提供以上给药方案的周期。该周期可约例如每七天、每14天、每21天、每28天、每35天、42天、每49天、每56天、每63天、每70天进行重复等。周期之间可存在非给药间隔，其中该间隔可为约例如七天、14天、21天、28天、35天、42天、49天、56天、63天、70天等。在此语境中，术语“约”意指加或减一天、加或减两天、加或减三天、加或减四天、加或减五天、加或减六天或者加或减七天。本发明包括一种经口施用细菌例如李斯特菌属的方法。还提供了一种静脉内施用李斯特菌属的方法。此外，提供了一种经口、肌内、静脉内、皮内和/或皮下施用李斯特菌属的方法。本发明提供李斯特菌属细菌或李斯特菌属细菌的培养物或悬浮液，其通过在基于肉的培养基或含有源自肉或动物产品的多肽的培养基中生长来制备。本发明还提供李斯特菌属细菌或李斯特菌属细菌的培养物或悬浮液，其通过在不含肉或动物产品的培养基中生长来制备，通过在含有植物多肽的培养基上生长来制备，通过在不基于酵母产品的培养基上生长来制备，或通过在含有酵母多肽的培养基上生长来制备。与另外的治疗剂共同施用的方法为本领域中所熟知(hardman等(编辑)(2001)goodmanandgilman’sthepharmacologicalbasisoftherapeutics，第10版，mcgraw-hill,newyork,ny；poole和peterson(编辑)(2001)pharmacotherapeuticsforadvancedpractice：apracticalapproach,lippincott,williams&wilkins,phila.,pa；chabner和longo(编辑)(2001)cancerchemotherapyandbiotherapy,lippincott,williams&wilkins,phila.,pa)。也可以使用有益于引起细胞溶解t细胞应答的附加试剂。此类试剂在本文中称为载剂。这些包括(不限于)b7共刺激分子、白细胞介素-2、干扰素-γ、gm-csf、ctla-4拮抗剂、ox-40/ox-40配体、cd40/cd40配体、沙莫司亭(sargramostim)、左旋咪唑(levamisol)、痘苗病毒、卡介苗(bcg)、脂质体、明矾、弗氏完全或不完全佐剂、解毒内毒素、矿物油、表面活性物质(诸如脂质卵磷脂(lipolecithin))、普朗尼克多元醇(pluronicpolyol)、聚阴离子、肽和油或烃乳液。用于诱导t细胞免疫应答的优先于抗体应答而刺激细胞溶解t细胞应答的载剂为优选的，不过也可以使用刺激两种类型应答的载剂。在试剂为多肽的情况下，可施用多肽本身或编码多肽的多聚核苷酸。载剂可为细胞，诸如抗原呈递细胞(apc)或树突状细胞。抗原呈递细胞包括诸如巨噬细胞、树突状细胞和b细胞的细胞类型。其他专职抗原呈递细胞包括单核细胞、边缘区库普弗细胞(kupffercell)、小神经胶质细胞、朗格汉斯细胞、交错树突状细胞、滤泡树突状细胞和t细胞。也可以使用兼性抗原呈递细胞。兼性抗原呈递细胞的实例包括星形细胞、滤泡细胞、内皮和纤维母细胞。载剂可为经转化以表达多肽或递送随后在接种疫苗的个体的细胞中表达的多聚核苷酸的细菌细胞。可添加佐剂诸如氢氧化铝或磷酸铝以增加疫苗触发、增强或延长免疫应答的能力。诸如以下的附加材料也是潜在的佐剂：细胞因子、趋化因子和细菌核酸序列，如cpg、toll样受体(tlr)9激动剂以及针对tlr2、tlr4、tlr5、tlr7、tlr8、tlr9的附加激动剂，包括脂蛋白、lps、单磷酰基脂质a、脂磷壁酸、咪喹莫特(imiquimod)、瑞喹莫德(resiquimod)及其他类似免疫调节剂，其可单独地或与所述组合物组合使用。佐剂的其他代表性实例包括合成佐剂qs-21，其包含从皂树树皮纯化的均质皂角苷及小棒状杆菌(mccune等，cancer,1979；43:1619)。应理解，佐剂经受优化。换言之，熟练技术人员可进行常规实验以确定使用的最佳佐剂。在本发明的一个实施方案中，本发明的细菌结合一种或多种选自由以下组成的组的附加药物活性组分施用：免疫检查点抑制剂(例如ctla-4、pd-1、tim-3、vista、btla、lag-3和tigit途径拮抗剂；pd-1途径阻断剂；pd-l1抑制剂；包括(不限于)抗pd-1抗体尼沃单抗(nivolumab)、帕博利珠单抗(pembrolizumab)或皮利珠单抗(pidilizumab)；pd-1抑制剂amp-224；抗ctla-4抗体伊匹单抗(ipilimumab)；以及抗pd-l1抗体bms-936559、mpdl3280a、medi4736或阿维单抗(avelumab))；tlr激动剂(例如cpg或单磷脂酰基脂质a)；诱导先天免疫的失活或减毒细菌(例如失活或减毒单核细胞增多性李斯特菌)；经由toll样受体(tlr)、经由(nod)样受体(nlr)、经由基于视黄酸可诱导基因(rig)的i样受体(rlr)、经由c型凝集素受体(clr)或经由病原体相关分子模式(pamp)介导先天免疫活化的组合物；以及化学治疗剂。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂选自由以下组成的组：ctla-4途径拮抗剂、pd-1途径拮抗剂、tim-3途径拮抗剂、vista途径拮抗剂、btla途径拮抗剂、lag-3途径拮抗剂及tigit途径拮抗剂。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂为抗pd-1抗体、抗pd-l1抗体、抗ctla-4抗体、抗tim-3抗体、抗btla抗体、抗b7-h3抗体、抗cd70抗体、抗cd40抗体、抗cd137抗体、抗gitr抗体、抗ox40抗体、抗kir抗体或抗lag-3抗体。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂选自由以下组成的组：尼沃单抗、帕博利珠单抗、皮利珠单抗、pdr001、medi0680、regn2810、amp-224、伊匹单抗、bms-936559、mpdl3280a、medi4736及阿维单抗。在一些实施方案中，tlr激动剂为cpg或单磷酰基脂质a。在本发明的一个实施方案中，本发明的细菌结合sting激动剂施用。这种施用可以是单独的，或可优选作为单一药物组合物的一部分。环状-二-核苷酸(cdn)环状-二-amp(由单核细胞增多性李斯特菌和其他细菌产生)及其类似环状-二-gmp和环状-gmp-amp由宿主细胞识别为病原体相关分子模式(pamp)，其结合到被称为干扰素基因刺激因子(sting)的病原体识别受体(prr)。sting是宿主哺乳动物细胞的细胞质中活化tank结合激酶(tbk1)-irf3和nf-κb信号传导轴，从而导致诱导强烈活化先天免疫的ifn-β及其他基因产物的衔接蛋白。现在认识到sting是宿主细胞溶质监督途径的组分(vance等，2009)，其感测胞内病原体的感染且作为响应而诱导ifn-β产生，从而导致产生由抗原特异性cd4+和cd8+t细胞以及病原体特异性抗体组成的适应性保护性病原体特异性免疫应答。环状嘌呤二核苷酸的实例在例如：美国专利7,709458和7,592,326；pct专利公开第wo2007/054279、wo2014/093936、wo2014/179335、wo2014/189805、wo2015/185565、wo2016/096174、wo2016/145102、wo2017/027645、wo2017/027646和wo2017/075477号；以及yan等，bioorg.med.chemlett.18:5631-4,2008中有较为详细的描述。在本发明的一个实施方案中，本发明的细菌结合选自由以下组成的组的一种或多种免疫检查点抑制剂施用：抗pd-1抗体、抗pd-l1抗体、抗ctla-4抗体、抗tim-3抗体、抗btla抗体、抗b7-h3抗体、抗cd70抗体、抗cd40抗体、抗cd137抗体、抗gitr抗体、抗ox40抗体、抗kir抗体或抗lag-3抗体。在一些实施方案中，本发明的细菌结合抗ctla-4抗体和/或抗pd-1抗体施用。治疗剂的有效量是将会使症状减轻或改善正常至少10％、更正常至少20％、最正常至少30％、典型地至少40％、更典型地至少50％、最典型地至少60％、经常至少70％、更经常至少80％并且最经常至少90％、常规地至少95％、更常规地至少99％及最常规地至少99.9％的量。本发明的试剂和方法提供了一种疫苗，其仅包含一次疫苗接种；或包含初次疫苗接种；或包含至少一次加强疫苗接种；至少两次加强疫苗接种；或至少三次加强疫苗接种。加强疫苗接种的参数的指南是可获得的。参见例如marth(1997)biologicals25:199-203；ramsay等(1997)immunol.cellbiol.75:382-388；gherardi等(2001)histol.histopathol.16:655-667；leroux-roels等(2001)actaclin.belg.56:209-219；greiner等(2002)cancerres.62:6944-6951；smith等(2003)j.med.virol.70:增刊1:s38-s41；sepulveda-amor等(2002)vaccine20:2790-2795)。可通过与生理学上可接受的载剂、赋形剂或稳定剂混合，将治疗剂的制剂制备成例如冻干粉剂、浆液、水溶液或悬浮液形式进行储存(参见例如hardman等(2001)goodmanandgilman’sthepharmacologicalbasisoftherapeutics,mcgraw-hill,newyork,ny；gennaro(2000)remington：thescienceandpracticeofpharmacy,lippincott,williams和wilkins,newyork,ny；avis等(编辑)(1993)pharmaceuticaldosageforms：parenteralmedications,marceldekker,ny；lieberman等(编辑)(1990)pharmaceuticaldosageforms：tablets,marceldekker,ny；lieberman等(编辑)(1990)pharmaceuticaldosageforms：dispersesystems,marceldekker,ny；weiner和kotkoskie(2000)excipienttoxicityandsafety,marceldekker,inc.,newyork,ny)。“疫苗”包括预防性疫苗。疫苗还包括治疗性疫苗，例如向具有与疫苗所提供的抗原或表位相关的病状或病症的哺乳动物施用的疫苗。已开发出许多细菌菌种用作疫苗并且可用于本发明中，包括(但不限于)弗氏志贺菌、大肠杆菌、单核细胞增多性李斯特菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、伤寒沙门氏菌或分枝杆菌属菌种。该清单并非意欲限制。参见例如wo04/006837；wo04/084936；wo04/110481；wo05/037233；wo05/092372；wo06/036550；wo08/109155；wo08/130551；wo08/140812；wo09/143085；wo09/143167；wo10/040135；wo11/060260；wo07/103225；wo07/117371；和wo14/074635，其各自据此通过引用整体并入，包括所有表格、附图和权利要求。用于疫苗组合物中的细菌载体可为兼性胞内细菌载体。细菌可用于在宿主生物体中将本文所述的多肽递送至抗原呈递细胞。如本文所述，单核细胞增多性李斯特菌提供了用于表达本发明抗原的优选疫苗平台。实施例以下实施例用于阐明本发明。这些实施例绝不旨在限制本发明的范围。实施例1：贯穿实施例使用的通用方法所有合成表达/分泌增强子都在称为actan100*的李斯特菌属蛋白质acta的经修饰氨基末端结构域下游且在acta启动子控制下被工程化成翻译融合物。合成这些全长(五个拷贝)启动子-增强子序列且针对在李斯特菌属中表达由dna2.0(menlopark,ca)进行密码子优化。使用标准的基于限制酶的克隆方法，将这些全长前导序列亚克隆至ppl2穿梭载体的衍生物中，与一组先前证实序列的抗原形成翻译融合物；iglc、pap(33-386)、间皮素(35-622)、间皮素(35-609)以及两个hbv抗原即pol(1-300)和x-ag的融合物。在xl1-blue细胞(agilent,santaclara,ca)中，使用t4dna连接酶(neb,ipswich,ma)进行初始克隆步骤。pint载体允许从大肠杆菌菌株sm10(内部制备的感受态细胞，zymoresearch,irvineca)轭合到李斯特菌属中，并且促进在trnaarg基因座处进行位点特异性整合。在李斯特菌属疫苗株lm11(△acta△inlb)中评估所有增强子。对于具有较少拷贝的增强子，使用pcr扩增适当长度产物(phusion聚合酶，neb,ipswichma)。通过纯化柱(qiagen,germantown,md)净化pcr产物，使用限制酶和证实的序列进行克隆。关于表达/分泌及免疫原性进行评估的所有菌株均示于表1中。蛋白质印迹使甘油储液中接种的李斯特菌属菌株的过夜培养物(1ml)在脑心浸液肉汤(bd)中于30℃下生长，不振荡。将dc2.4细胞储存在液氮中含10％dmso的胎牛血清(fbs)中。在感染前一天，将dc2.4细胞(每小瓶4×106个细胞)解冻，用不含抗生素的完全rpmi培养基(rpmi、10％fbs、非必需氨基酸、l-谷氨酰胺、丙酮酸钠、hepes缓冲液和2-巯基乙醇)冲洗一次，重悬于相同培养基中，以每孔1.5×105个细胞接种于24孔板中，并在37℃(5％co2)下孵育过夜。将上述过夜细菌培养物在不含抗生素的完全rpmi培养基中1：200(1ml中5μl)稀释，并且通过重复吸移充分混合。将培养基从前一天铺板的dc2.4细胞吸出，并使用过夜培养稀释液(300μl；3×106个细菌)感染含有dc2.4细胞的各个孔(感染复数为20)。使感染在37℃(5％co2)下进行1小时，通过抽吸移除上清液，将孔用pbs(2ml)冲洗一次，并添加含有50μg/ml庆大霉素的完全rpmi培养基(2ml)。将感染物在37℃(5％co2)下再孵育七小时。对于用于以下实施例中的蛋白质印迹，除非另有说明，否则通过抽吸移除培养基并且将细胞用pbs(1ml)洗涤并通过添加裂解缓冲液(100μl具有还原剂的1xlds缓冲液；lifetechnologies)和物理破坏来收集。将裂解物转移至1.5ml管中，在95℃下孵育10分钟，涡旋，并且储存在-20℃下。对于基于肉汤的蛋白质印迹分析，如以下实施例中所示，使李斯特菌属菌株的过夜培养物(1ml)在酵母培养基(yng)肉汤中在37℃下在～200rpm振荡下生长过夜。然后通过对细菌离心来分离培养基。将培养基的等分试样(50μl)转移至单独的管中，并添加4x负载染料(20μl；novex)且添加10x还原剂(8μl；novex)。将样品在95℃下孵育10分钟，涡旋，并且储存在-20℃下。将等分试样(20μl)在1xmes缓冲液(invitrogen)中的4％-12％bis-trispage凝胶上运行并转移至0.45μm硝酸纤维素膜以进行检测。膜在odyssey封闭缓冲液(li-cor)中在室温下封闭1小时。使用识别acta蛋白质的成熟的18个氨基酸的氨基末端的a18k多克隆兔抗体(1:4,000稀释)来检测异种抗原，所述氨基末端与各抗原的n末端融合。将组成性表达的李斯特菌属p60蛋白质用作每个样品负载的细菌数目的对照，并使用小鼠单克隆p60抗体(1:4,000；adipogenlifesciences)检测。使用1:10,000稀释的有区别标记的山羊抗小鼠和山羊抗兔(分别为irdye800cw和680rd；odyssey)二抗。所有抗体均在具有0.2％tween的odyssey封闭缓冲液中稀释。将膜与两种一抗一起在4℃下孵育过夜，用含有0.1％tween的pbs洗涤三次，每次洗涤持续五分钟，然后与二抗一起在室温下孵育1小时。将膜再洗涤四次，最后一次仅用pbs洗涤，然后使用li-corodyssey系统扫描。用li-corimagestudio软件定量蛋白质印迹。将各个抗原或p60条带在代表适当信号的图像(即对于actan100*或p60，分别680nm或800nm波长扫描)上画框，并测定各框内的总强度。将强度测量值输出至excel，在excel中计算actan100*强度与p60强度的比率。免疫原性实验使细菌培养物在yng培养基中在37℃下振荡生长过夜至稳定期。第二天，将培养物在无菌hbss中稀释至约2.5×107个cfu/ml的浓度。6-8周龄balb/c小鼠(n＝5)通过在侧尾静脉中静脉注射200μl体积，接受如以下实施例中指示的近似剂量(例如5×106个cfu)。免疫接种后七天，收获脾脏，并且制备单细胞悬浮液以通过ifnγelispot分析进行t细胞分析。每孔4×105个脾细胞用pap肽汇集物或仅用培养基(未受刺激的对照)刺激过夜，pap肽汇集物由重叠有11个氨基酸的94种15mer肽构成。第二天，通过ifnγelispot对pap特异性t细胞应答进行定量，并使用graphpadprism进行双尾未配对t检验分析，确定统计显著性，其中p<0.05。类似测定用于评估表达hbvpol1-300-hbxag的菌株的免疫原性，在用hbv-pol140-148刺激的情况下下，通过ifnγelispot评估hbv-pol140-148特异性t细胞应答。所用序列egfrviii序列的单一重复单元及其合成syn1、syn2和syn18修饰用于以下实施例中。加下划线的是在egfrviii序列中以及syn1、syn2和syn18中的剩余部分中用作控制序列的完整egfrviii重复单元。egfrviii新抗原hla-a2限制的t细胞表位以粗体显示。syn1改变跨越整个egfrviiit细胞表位的重复单元中的21个氨基酸中的13个。syn2缺失基本重复单元中相同的13个氨基酸(描绘成破折号)。syn18改变重复单元中21个氨基酸中的15个。变体设计成避免与人类基因组中任何蛋白质具有显著同源性，如通过blastp检索所确定。这些序列中包括氨基末端(askvl)(seqidno:5)和羧基末端(adgsvk)(seqidno:2)蛋白酶体裂解序列(斜体字)。“5拷贝”syn1(seqidno:33)、syn2(seqidno:34)和syn18(seqidno:35)序列与5拷贝egfrviii构建体(seqidno:32)的比对：实施例2：egfrviii、syn1、syn2和syn18表达增强子序列对pap表达的作用如以下实施例中所示，当与egfrviii、syn1和syn18表达增强子序列融合时，癌症抗原修复性酸性磷酸酶(pap)的表达显著增强。测试以下构建体。如图1所示，actan100*(seqidno:28，以黑色显示)与四个不同重复单元的五个拷贝，接着是人pap的残基33-386框内融合。bh2869：无增强子序列bh4703：5xegfrviii(积木图案)bh5144：5xsyn1(对角交叉影线)bh5150：5xsyn2(水平交叉影线)，bh5337：5xsyn18(棋盘格图案)。pap33-386核酸序列(seqidno:51)：pap33-386蛋白质序列(seqidno:52)：将小鼠树突状细胞系dc2.4用lm△acta/△inlb感染，其中融合蛋白插入染色体trnaarg基因座中。七小时后，将细胞洗涤，裂解，在sds-page上运行，并转移至硝酸纤维素。将蛋白质印迹用针对acta蛋白质的氨基末端产生的兔多克隆抗体探测，并将表达水平相对于李斯特菌属p60蛋白质标准化，所述表达水平与受感染细胞中的细菌计数相关。研究和临床菌株两者均表达高水平的融合构建体。使用p60表达将表达标准化，所述表达与受感染细胞中的细菌数相关。最低表达构建体的相对表达任意设定为1；n.a.：不适用；n.d.：未检测出。图2显示融合蛋白表达的胞内蛋白质印迹结果。在完整重复单元下融合蛋白表达的有效加强得到改善，并且由于间隔区(裂解)序列而未显著增强(参见泳道5，使用syn2的构建体)。由actan100*-syn18-pap33-386构成的融合蛋白产生最高蛋白质表达(泳道6，菌株bh5337)。最低表达构建体的基于acta/p60比率的相对表达任意设定为1；n.a.：不适用；n.d.：未检测出。这汇总于下表中：泳道菌株表达盒预测kda相对表达1lm11无n.a.n.a.2bh2869actan100-pap33-38648.3n.d.3bh4703actan100*-egfrviii-pap33-38666.514.24bh5144actan100*-syn1-pap33-38666.519.15bh5150actan100*-syn2-pap33-38657.81.06bh5337actan100*-syn18-pap33-38666.530.6实施例3：egfrviii、syn1、syn2和syn18增强子序列对iglc表达的作用如以下实施例中所示，当与egfrviii、syn1和syn18表达增强子序列融合时，来自土拉热弗朗西斯菌的感染性疾病抗原iglc的表达也得到增强。用于实施例2中的pap序列未在actan100*融合系统中正常良好表达。本实施例如实施例2中进行；然而，iglc置换pap，作为用在actan100*融合系统中正常良好表达的抗原增强表达的测试。iglc核酸序列(seqidno:49)：iglc蛋白质序列(seqidno:50)：actan100*与包括egfrviii、syn1、syn2、syn18的四个不同重复单元的五个拷贝以及来自土拉热弗朗西斯菌的感染性疾病抗原iglc框内融合。图3描绘融合蛋白表达的胞内蛋白质印迹。同样，由actan100*-syn18-iglc构成的融合蛋白引起最高蛋白质表达(泳道6，菌株bh5333)。最低表达构建体的基于acta/p60比率的相对表达任意设定为1；n.a.：不适用；n.d.：未检测出。这汇总于下表中：泳道菌株抗原表达盒预测kda相对表达1lm11无n.a.n.a.2bh4203actan100*-iglc34.21.03bh4215actan100*-egfrviiix5-iglc50.85.74bh5128actan100*-syn1x5-iglc50.83.25bh5132actan100*-syn2x5-iglc43.72.16bh5333actan100*-syn18x5-iglc50.87.1实施例4：增强子序列拷贝数对syn1表达pap的作用当与pap融合时，增加syn1重复单元的拷贝数使得水平逐步提高。本实施例如实施例2中进行；然而，syn1增强子序列的拷贝数在0至5之间变化。图4示意性显示了用于本实施例的分子构建体。actan100*(黑色)与syn1(对角交叉影线)的零个、一个、两个、三个、四个或五个拷贝以及肿瘤抗原pap33-386框内融合。图5描绘融合蛋白表达的胞内蛋白质印迹。在未添加syn1重复单元的任何拷贝下，未检测到pap融合蛋白(泳道2)。在具有单个syn1重复单元的构建体(bh5624，泳道3)与具有重复单元的5个拷贝的构建体(bh5144，泳道7)之间观测到表达提高40倍。最低表达构建体的基于acta/p60比率的相对表达任意设定为1；n.a.：不适用；n.d.：未检测出。这汇总于下表中：泳道菌株抗原表达盒预测kda相对表达1lm11无n.a.n.a.2bh2869actan100-hpap33-38648.3n.d.3bh5624actan100*-syn1x1-pap33-38652.314bh5626actan100*-syn1x2-pap33-386562.15bh5628actan100*-syn1x3-pap33-38659.517.36bh5630actan100*-syn1x4-pap33-386632677bh5144actan100*-syn1x5-pap33-38666.540.5实施例5：增强子序列拷贝数对syn18表达pap的作用当与pap融合时，增加syn18重复单元的拷贝数使得水平逐步提高。本实施例如实施例2中进行；然而，syn18增强子序列的拷贝数在0至5之间变化。图6示意性显示了用于本实施例的分子构建体。actan100*(黑色)与syn18(棋盘格图案)的零个、一个、两个、三个、四个或五个拷贝以及肿瘤抗原pap33-386框内融合。图7描绘融合蛋白表达的胞内蛋白质印迹。在未添加syn18重复单元的任何拷贝下，检测到低水平pap融合蛋白(泳道2)。在无syn18重复单元的构建体(bh2869，泳道2)与具有重复单元的5个拷贝的构建体(bh5337，泳道7)之间观测到表达提高82倍。在具有单个syn18重复单元的构建体(bh5632，泳道3)与具有重复单元的5个拷贝的构建体(bh5337，泳道7)之间观测到表达提高51倍。最低表达构建体的基于acta/p60比率的相对表达任意设定为1；n.a.：不适用；n.d.：未检测出。这汇总于下表中：泳道菌株抗原表达盒预测kda相对表达1lm11n.a.2bh2869actan100-hpap33-38648.313bh5632actan100*-syn18x1-pap33-38652.21.64bh5634actan100*-syn18x2-pap33-3865623.85bh5636actan100*-syn18x3-pap33-38659.544.26bh5843actan100*-syn18x4-pap33-3866384.57bh5337actan100*-syn18x5-pap33-38666.582.1实施例6：增强子序列拷贝数对syn1和syn18的hbv聚合酶-hbxag双抗原融合表达的作用当与pap融合时，增加syn1重复单元的拷贝数使得水平逐步提高。本实施例如实施例2中进行。图8示意性显示了用于本实施例的分子构建体。actan100*(黑色)与egfrviii(积木图案)的五个拷贝框内融合并与syn1(对角交叉影线图案)或syn18(棋盘格图案)的零个、一个或五个拷贝以及hbv聚合酶-hbxag双抗原框内融合，各抗原来自乙型肝炎病毒。具有c端sl8肽的hbvpol1-300-hbxag双抗原核酸序列(seqidnq:53)：具有c端sl8肽的hbvpol1-300-hbxag双抗原蛋白质序列(seqidno:54)：图9描绘融合蛋白表达的胞内蛋白质印迹。由actan100*-syn18x5-pol-hbxag构成的融合蛋白与无合成表达增强子(泳道7，菌株bh5695)相比，使表达提高近500倍。最低表达构建体的基于acta/p60比率的相对表达任意设定为1；n.a.：不适用；n.d.：未检测出。这汇总于下表中：实施例7：增强子序列拷贝数对pap免疫原性的作用雌性b10.br小鼠(每组n＝5)静脉内接种5×106个cfu的bh2869(仅actan100-pap)、bh4703(actan100*-egfrviiix5-pap)、bh5144(actan100*-syn1x5-pap)和bh5337(actan100*-syn18x5-pap)(根据图1中的示意图)。7天后通过胞内细胞因子染色(elispot)来测定pap特异性t细胞应答，并且在图10中描绘成每个脾脏ifn-γ阳性pap特异性cd8+t细胞的绝对数。结果表示为每4×105个细胞的平均斑点形成细胞数(sfc)。最高pap特异性免疫原性由具有最高表达的菌株诱导，其中bh5337诱导最高pap特异性免疫应答。实施例8：增强子序列拷贝数对hbv-pol免疫原性的作用雌性小鼠(每组n＝5)静脉内接种1×106个cfu的bh5687(actan100*-hbvpol1-300-hbxag)、bh5689(actan100*-syn1x1-hbvpol1-300-hbxag)、bh5691(actan100*-syn1x5-hbvpol1-300-hbxag)、bh5693(actan100*-syn18x1-hbvpol1-300-hbxag)和bh5695(actan100*-syn18x5-hbvpol1-300-hbxag)(根据图8中的示意图)。7天后通过胞内细胞因子染色(elispot)来测定hbv-pol特异性t细胞应答，并且在图11中描绘成每个脾脏ifn-γ阳性pap特异性cd8+t细胞的绝对数。结果表示为每4×105个细胞的平均斑点形成细胞数(sfc)。当与bh5687比较时，bh5689、bh5691和bh5695诱导统计上较高的免疫应答(且bh5693趋向于更高)。实施例9：增强子序列取向对syn18和syn1表达pap的作用syn18x5或syn1x5序列增强表达，不管其连接至抗原的氨基末端还是羧基末端。本实施例如实施例2中进行；然而，syn18x5或syn1x5增强子序列连接至pap33-386抗原序列的氨基末端或羧基末端。图12示意性显示了用于本实施例的分子构建体。actan100*(黑色)与连接至肿瘤抗原pap33-386的氨基末端或羧基末端的syn18(棋盘格图案)或syn1(对角交叉影线图案)的五个拷贝框内融合。图13描绘融合蛋白表达的胞内蛋白质印迹。对于syn18x5与syn1x5，检测到水平相当的pap融合蛋白，不管这些是连接至pap抗原的氨基末端(泳道2和4，cr782和cr789)还是连接至pap抗原的羧基末端(泳道3和5，cr784和cr794)。最低表达构建体的基于acta/p60比率的相对表达任意设定为1；n.a.：不适用；n.d.：未检测出。这汇总于下表中：泳道菌株抗原表达盒预测kda相对表达1lm11n.a.2cr782actan100*-syn18x5-pap33-38665.52.33cr784actan100*-pap33-386-syn18x565.51.64cr789actan100*-syn1x5-pap33-38664.615cr794actan100*-pap33-386-syn1x564.61.4实施例10：增强子序列对syn1x5和syn18x5的间皮素抗原融合表达的作用间皮素抗原随syn18x5连接至间皮素35-609的氨基末端或羧基末端以及syn1x5连接至间皮素35-609的氨基末端而增加。本实施例如实施例2中进行。图14示意性显示了用于本实例的分子构建体。actan100*(黑色)与间皮素35-622抗原、连接至间皮素35-622抗原的氨基末端的syn18(棋盘格图案)的五个拷贝或连接至肿瘤抗原间皮素35-609的氨基末端或羧基末端的syn1(对角交叉影线图案)或syn18的五个拷贝框内融合。间皮素35-622核酸序列(seqidno:55)：间皮素35-622蛋白质序列(seqidno:56)：间皮素35-609核酸序列(seqidno:57)：间皮素35-609蛋白质序列(seqidno:58)：图15描绘融合蛋白表达的肉汤培养蛋白质印迹。由actan100*-stn18x5-间皮素35-622构成的融合蛋白的融合蛋白表达水平高于crs-207对照构建体。由actan100*-syn18x5-间皮素35-622、actan100*-间皮素35-622-syn18x5或actan100*-syn1x5-间皮素35-609构成的融合蛋白的表达水平也高于crs-207对照。最低表达构建体的基于acta/p60比率的相对表达任意设定为1；n.a.：不适用；n.d.：未检测出。这汇总于下表中：泳道菌株抗原表达盒预测kda相对表达1lm11无n.a.02crs-207actan100-间皮素35-62272.71.73cr876actan100*-syn18x5-间皮素35-6228921.54cr866actan100*-syn18x5-间皮素35-60987.717.75cr788actan100*-间皮素35-609-syn18x587.77.36cr791actan100*-syn1x5-间皮素35-60986.87.77cr796actan100*-间皮素35-609-syn1x586.81实施例11：增强子序列对大肠杆菌中fopc抗原的表达的作用将编码具有或没有标签的重组蛋白的质粒转化成t7表达感受态大肠杆菌(neb)。蛋白质包括在羧基末端用6xhis标记且无氨基末端融合伴侣或在氨基末端具有sumo标签或syn18x5标签的fopc。所得集落用于接种具有抗生素的lb肉汤(1ml)，并将培养物在振荡下在37℃下孵育，直至其达到～0.5的od600。通过将培养物的等分试样(100μl)离心来收集未诱导的样品。添加异丙基β-d-1-硫代半乳糖吡喃糖苷(iptg)(0.5mm)，并将培养物在振荡下在37℃下再孵育两小时。通过将培养物的等分试样(50μl)离心来收集诱导的样品。将未诱导的样品和诱导的样品均重悬于裂解缓冲液(100μl具有还原剂的1xlds缓冲液；novex)中，在95℃下孵育10分钟，涡旋并储存在-20℃下。将等分试样(5μl)在4％-12％bis-trispage凝胶上在1xmes缓冲液(invitrogen)中运行并转移至0.45μm硝酸纤维素膜以进行检测。在转移之后，将膜在水中短暂冲洗，与revert总蛋白染剂一起孵育5分钟(5ml；li-cor)，用洗涤溶液短暂冲洗两次，然后使用li-corodyssey系统扫描。在成像后，将膜用水短暂冲洗，然后在室温下在odyssey封闭缓冲液(li-cor)中封闭1小时。使用多克隆抗polyhis抗体(1:4,000稀释；sigma#h1029)检测6xhis标记的重组蛋白。山羊抗小鼠(irdye680rd；odyssey)二抗以1:10,000稀释使用。所有抗体均在具有0.2％tween的odyssey封闭缓冲液中稀释。膜与一抗一起在4℃下孵育过夜，用含有0.1％tween的pbs洗涤三次，每次洗涤持续五分钟，然后与一种或多种二抗一起在室温下孵育1小时。将膜再洗涤四次，最后一次仅用pbs洗涤，然后使用li-corodyssey系统扫描。用li-corimagestudio软件定量蛋白质印迹。将各个含有his的条带在代表800nm信号的图像上画框，并测定各框内的总强度。未标记的fopc-6xhis核酸序列(seqidno:59)：未标记的fopc-6xhis蛋白质序列(seqidno:60)：sumofopc-6xhis核酸序列(seqidno:61)：sumofopc-6xhis蛋白质序列(seqidno:62)：syn18x5fopc-6xhis核酸序列(seqidno:63)：syn18x5fopc-6xhis蛋白质序列(seqidno:64)：syn18x5序列增强大肠杆菌中fopc抗原的表达。图16示意性显示了用于本实施例的分子构建体。fopc在羧基末端用6xhis标签(黑色)标记，并且在无氨基末端融合伴侣下表达，或与sumo(波浪线)或与syn18(棋盘格图案)框内融合。图17描绘融合蛋白表达的胞内蛋白质印迹，其中右侧印迹的第二拷贝已经调整以允许目视观察泳道2中未标记的fopc蛋白质。将表达水平相对于总蛋白质印迹上的匹配条带(底部印迹)标准化。与fopc融合的syn18x5的表达高于sumo融合的fopc的表达。这汇总于下表中：实施例12：李斯特菌属中连接至增强子序列羧基或氨基末端的多个新抗原序列的表达本实施例类似地如实施例2中所述进行。制备构建体以在李斯特菌属中表达，其中融合蛋白包含actan100*、含有来自受试者的9个单独的预测新抗原序列的多肽，并且有或无syn18x5增强子序列。这些构建体示于图18中，其中在存在时，syn18x5序列介于actan100*序列与含有9个抗原序列的序列之间。各新抗原序列编号为1-9，并且侧接各新抗原的裂解序列表示为a(seqidno:7)、b(seqidno:14)、c(seqidno:76)、c2(seqidno:15)或d(seqidno:4)。在bh5998和bh6000中，各预测新抗原序列为最小肽，而在另外四种菌株中，各新抗原序列为包含各最小肽序列的25个氨基酸。菌株bh5990和bh6002包括裂解序列，而bh5992和bh6008在各新抗原序列之间缺乏裂解序列。在各构建体对内(有和无syn18x5)，syn18x5与无增强子序列的菌株相比表现出较高的表达。含有侧接各新抗原的裂解序列的菌株与无裂解序列的菌株相比显示出较高的表达。最低表达构建体的基于acta/p60比率的相对表达任意设定为1；n.a.：不适用；n.c.：未计算(分母为0)。这汇总于下表中：制备另外的构建体以在李斯特菌属中表达，其中融合蛋白包含连接至syn18x5增强子序列的actan100*，syn18x5增强子序列连接至包含最多19条来自一名受试者的单独的预测新抗原序列(bh6609-19新抗原、bh6619-16新抗原、bh6613-14新抗原、bh6615-12新抗原及bh6617-10新抗原)以及9条来自另一受试者的单独的预测新抗原序列(bh6035)的多肽。这些构建体示于图19中，其中各新抗原序列编号为1-19或1-9，其中裂解序列侧接各新抗原，其中裂解序列表示为a(seqidno:7)、b(seqidno:14)、c(seqidno:76)、d(seqidno:4)、a2(seqidno:2)或d2(seqidno:75)。各新抗原序列为具有受试者突变序列的预测新抗原，其中突变在25个氨基酸序列中间。将表达与无融合蛋白构建体的李斯特菌属菌株进行比较，并且证实包含多个抗原序列的多肽表达融合蛋白。最低表达构建体的基于acta/p60比率的相对表达任意设定为1；n.a.：不适用。这汇总于下表中：本领域技术人员容易意识到，本发明非常适于实现目标以及获得所提及的目的和优点，以及本文固有的目的和优点。本文所提供的实施例代表优选实施方案，是示例性的，而非不意欲限制本发明的范围。对于本领域技术人员显而易见，可在不背离本发明的精神和范围的情况下对本文中所公开的发明作出不同的取代和修改。说明书中提及的所有专利和出版物指示本发明所属领域的普通技术人员的水平。所有专利和出版物均通过引用并入本文，其引用程度如同每篇单独的出版物被明确单独地指出通过引用并入一样。本文说明性描述的本发明可在缺乏本文未明确公开的任何一种或多种元件、一种或多种限制的情况下适当地实施。因此，例如，在本文中的各情况下，术语“包含”、“基本上由……组成”及“由……组成”中的任一个均可替换为另外两个术语中的任一个。已采用的术语及表述用作描述而非限制的术语，并且使用此类术语和表述时并非意欲排除所示和所述特征或其部分的任何等效内容，而是认识到，在要求保护的本发明的范围内可进行各种修改。因此，应理解，尽管已通过优选实施方案和任选特征明确地公开了本发明，但本领域技术人员可采取本文公开的概念的修改和变型，并且此类修改和变型均被视为在由所附权利要求所限定的本发明的范围之内。其他实施方案阐述于以下权利要求中。序列表<110>adurobiotech,inc.<120>蛋白质表达增强子序列及其用途<130>adr-1009-pct<150>us62/369,663<151>2016-08-01<150>us62/373,297<151>2016-08-10<160>77<170>patentin3.5版<210>1<211>18<212>prt<213>人工序列<220><223>合成<400>1gluserasnglnservalgluasplyshisasngluphemetleuthr151015glutyr<210>2<211>6<212>prt<213>人工序列<220><223>合成<400>2alaaspglyservallys15<210>3<211>5<212>prt<213>人工序列<220><223>合成<400>3alaserlysvalala15<210>4<211>5<212>prt<213>人工序列<220><223>合成<400>4leuserlysvalleu15<210>5<211>5<212>prt<213>人工序列<220><223>合成<400>5alaserlysvalleu15<210>6<211>6<212>prt<213>人工序列<220><223>合成<400>6glyaspglyserilelys15<210>7<211>5<212>prt<213>人工序列<220><223>合成<400>7alaaspglyserval15<210>8<211>5<212>prt<213>人工序列<220><223>合成<400>8leualalysserleu15<210>9<211>6<212>prt<213>人工序列<220><223>合成<400>9alaaspleualavallys15<210>10<211>5<212>prt<213>人工序列<220><223>合成<400>10alaservalvalala15<210>11<211>6<212>prt<213>人工序列<220><223>合成<400>11glyileglyserileala15<210>12<211>5<212>prt<213>人工序列<220><223>合成<400>12glyvalglulysile15<210>13<211>6<212>prt<213>人工序列<220><223>合成<400>13asnalaalaasnlysgly15<210>14<211>6<212>prt<213>人工序列<220><223>合成<400>14aspglyserlyslysala15<210>15<211>6<212>prt<213>人工序列<220><223>合成<400>15glyaspglyasnlyslys15<210>16<400>16000<210>17<211>32<212>prt<213>人工序列<220><223>合成<400>17alaserlysvalleuproalaserargalaleugluglulyslysgly151015asntyrvalvalthrasphisglysercysalaaspglyservallys202530<210>18<211>5<212>prt<213>单核细胞增多性李斯特菌<400>18thrglualalysasp15<210>19<211>5<212>prt<213>乳酸乳球菌<400>19valtyralaaspthr15<210>20<211>5<212>prt<213>炭疽杆菌<400>20ileglnalagluval15<210>21<211>5<212>prt<213>单核细胞增多性李斯特菌<400>21alaseralaserthr15<210>22<211>5<212>prt<213>单核细胞增多性李斯特菌<400>22valglyalaphegly15<210>23<211>5<212>prt<213>炭疽杆菌<400>23alaphealagluasp15<210>24<211>5<212>prt<213>金黄色葡萄球菌<400>24valglnalaalaglu15<210>25<211>100<212>prt<213>人工序列<220><223>合成<400>25valglyleuasnargphemetargalametmetvalvalpheilethr151015alaasncysilethrileasnproaspileilephealaalathrasp202530sergluaspserserleuasnthraspglutrpglugluglulysthr354045glugluglnprosergluvalasnthrglyproargtyrgluthrala505560arggluvalserserargaspileglugluleuglulysserasnlys65707580vallysasnthrasnlysalaaspleuilealametleulysalalys859095alaglulysgly100<210>26<211>102<212>prt<213>人工序列<220><223>合成<400>26valglyleuasnargphemetargalametmetvalvalpheilethr151015alaasncysilethrileasnproaspileilephealaalathrasp202530sergluaspserserleuasnthraspglutrpglugluglulysthr354045glugluglnprosergluvalasnthrglyproargtyrgluthrala505560arggluvalserserargaspileglugluleuglulysserasnlys65707580vallysasnthrasnlysalaaspleuilealametleulysalalys859095alaglulysglyglyser100<210>27<211>86<212>prt<213>人工序列<220><223>合成<400>27valglyleuasnargphemetargalametmetvalvalpheilethr151015alaasncysilethrileasnproaspileilephealaalathrasp202530sergluaspserserleuasnthraspglutrpglugluglutyrglu354045thralaarggluvalserserargaspileglugluleuglulysser505560asnlysvallysasnthrasnlysalaaspglnaspasnlysarglys65707580alalysalaglulysgly85<210>28<211>86<212>prt<213>人工序列<220><223>合成<400>28metglyleuasnargphemetargalametmetvalvalpheilethr151015alaasncysilethrileasnproaspileilephealaalathrasp202530sergluaspserserleuasnthraspglutrpglugluglutyrglu354045thralaarggluvalserserargaspileglugluleuglulysser505560asnlysvallysasnthrasnlysalaaspglnaspasnlysarglys65707580alalysalaglulysgly85<210>29<211>32<212>prt<213>人工序列<220><223>合成<400>29alaserlysvalleuproalaserargalavalaspasphishisala151015glnpheleuleuserglulysglysercysalaaspglyservallys202530<210>30<211>19<212>prt<213>人工序列<220><223>合成<400>30alaserlysvalleuproalaserargalaglysercysalaaspgly151015servallys<210>31<211>32<212>prt<213>人工序列<220><223>合成<400>31alaserlysvalleugluserasnglnservalgluasplyshisasn151015gluphemetleuthrglutyrglysercysalaaspglyservallys202530<210>32<211>162<212>prt<213>人工序列<220><223>合成<400>32alaserlysvalleuproalaserargalaleugluglulyslysgly151015asntyrvalvalthrasphisglysercysalaaspglyservallys202530thrseralaserlysvalalaproalaserargalaleugluglulys354045lysglyasntyrvalvalthrasphisglysercysglyaspglyser505560ilelysleuserlysvalleuproalaserargalaleugluglulys65707580lysglyasntyrvalvalthrasphisglysercysalaaspglyser859095vallysalaserlysvalalaproalaserargalaleugluglulys100105110lysglyasntyrvalvalthrasphisglysercysglyaspglyser115120125ilelysleuserlysvalleuproalaserargalaleugluglulys130135140lysglyasntyrvalvalthrasphisglysercysalaaspglyser145150155160vallys<210>33<211>162<212>prt<213>人工序列<220><223>合成<400>33alaserlysvalleuproalaserargalavalaspasphishisala151015glnpheleuleuserglulysglysercysalaaspglyservallys202530thrseralaserlysvalalaproalaserargalavalaspasphis354045hisalaglnpheleuleuserglulysglysercysglyaspglyser505560ilelysleuserlysvalleuproalaserargalavalaspasphis65707580hisalaglnpheleuleuserglulysglysercysalaaspglyser859095vallysalaserlysvalalaproalaserargalavalaspasphis100105110hisalaglnpheleuleuserglulysglysercysglyaspglyser115120125ilelysleuserlysvalleuproalaserargalavalaspasphis130135140hisalaglnpheleuleuserglulysglysercysalaaspglyser145150155160vallys<210>34<211>97<212>prt<213>人工序列<220><223>合成<400>34alaserlysvalleuproalaserargalaglysercysalaaspgly151015servallysthrseralaserlysvalalaproalaserargalagly202530sercysglyaspglyserilelysleuserlysvalleuproalaser354045argalaglysercysalaaspglyservallysalaserlysvalala505560proalaserargalaglysercysglyaspglyserilelysleuser65707580lysvalleuproalaserargalaglysercysalaaspglyserval859095lys<210>35<211>162<212>prt<213>人工序列<220><223>合成<400>35alaserlysvalleugluserasnglnservalgluasplyshisasn151015gluphemetleuthrglutyrglysercysalaaspglyservallys202530thrseralaserlysvalalagluserasnglnservalgluasplys354045hisasngluphemetleuthrglutyrglysercysglyaspglyser505560ilelysleuserlysvalleugluserasnglnservalgluasplys65707580hisasngluphemetleuthrglutyrglysercysalaaspglyser859095vallysalaserlysvalalagluserasnglnservalgluasplys100105110hisasngluphemetleuthrglutyrglysercysglyaspglyser115120125ilelysleuserlysvalleugluserasnglnservalgluasplys130135140hisasngluphemetleuthrglutyrglysercysalaaspglyser145150155160vallys<210>36<211>485<212>dna<213>人工序列<220><223>合成<400>36ggtaccgggaagcagttggggttaactgattaacaaatgttagagaaaaattaattctcc60aagtgatattcttaaaataattcatgaatattttttcttatattagctaattaagaagat120aattaactgctaatccaatttttaacggaataaattagtgaaaatgaaggccgaattt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