抗STEAP2抗体、抗体药物偶联物和结合STEAP2和CD3的双特异性抗原结合分子以及其用途的制作方法
本申请通过引用并入于2017年9月22日创建的并含有739964个字节序列的以计算机可读形式列表提交的文件10296wo01-sequence.txt。
本发明涉及特异于前列腺2(steap2)的六跨膜上皮抗原的抗体及其抗原结合片段以及其使用方法。本发明还涉及结合steap2和cd3的双特异性抗原结合分子，及其使用方法。发明进一步涉及抗体-药物偶联物，其包括抗steap2抗体或其片段以及治疗剂(例如，细胞毒性剂)。
背景技术：
前列腺2的六跨膜上皮抗原(steap2)，也称为steap-2、金属还原酶steap2、前列腺癌相关蛋白1、转移性前列腺癌中上调的蛋白、前列腺1的六跨膜蛋白(stamp1)和098p4b6，其是一种完整的六跨膜跨膜蛋白，其在正常和恶性前列腺细胞中上调。作为高尔基复合体与质膜之间的穿梭物的steap2是一种金属还原酶，其还原铁和铜，促进其进入细胞。steap2主要定位于前列腺的上皮细胞。steap2也在正常心脏、脑、胰腺、卵巢、骨骼肌、乳腺、睾丸、子宫、肾、肺、气管、结肠和肝脏中表达。steap2在以下癌组织中过表达，包含前列腺癌、膀胱癌、子宫颈癌、肺癌、结肠癌、肾癌、乳腺癌、胰腺癌、胃癌、子宫癌和卵巢癌(gomes,i.m.等人，2012，《分子癌症研究(mol.cancerres.)》，10:573-587；challita-eid-p.m.等人，2003，wo03/087306；emtage，p.c.r.，2005，wo2005/079490)。
cd3是与t细胞受体复合物(tcr)结合的在t细胞上表达的同型二聚体或异二聚体抗原，并且是t细胞活化所需要的。功能性cd3由以下四种不同链中的两种的二聚缔合形成：ε、ζ、δ和γ。cd3二聚体排列包含γ/ε、δ/ε和ζ/ζ。已显示针对cd3的抗体在t细胞上聚集cd3，从而以类似于通过肽负载的mhc分子参与tcr的方式引起t细胞活化。因此，已提出抗cd3抗体用于涉及t细胞活化的治疗目的。此外，已提出能够结合cd3和靶抗原的双特异性抗体用于涉及靶向对表达靶抗原的组织和细胞的t细胞免疫应答的治疗用途。
包含抗体-药物偶联物的靶向steap2的抗原结合分子以及结合steap2和cd3的双特异性抗原结合分子将在治疗环境中有用，在所述环境中期望表达steap2的细胞的特异性靶向和t细胞介导的杀死。
技术实现要素：
在第一方面，本发明提供了结合到人steap2的抗体及其抗原结合片段。根据本发明的此方面的抗体尤其可用于靶向表达steap2的细胞。本发明还提供了结合人steap2和人cd3的双特异性抗体及其抗原结合片段。根据本发明的此方面的双特异性抗体尤其可用于靶向表达cd3的t细胞，并用于刺激t细胞活化，例如，在对表达steap2的细胞的t细胞介导的杀死有益或费和符合期望的情况下。例如，双特异性抗体可以将cd3介导的t细胞活化引导到如前列腺肿瘤细胞等特定的steap2表达细胞。
本发明的示例性抗steap2抗体列于本文的表1和表2中。表1列出了重链可变区(hcvr)和轻链可变区(lcvr)的氨基酸序列标识符，以及示例性抗steap2抗体的重链互补决定区(hcdr1、hcdr2和hcdr3)和轻链互补决定区(lcdr1、lcdr2和lcdr3)。表2列出了编码示例性抗steap2抗体的hcvr、lcvr、hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2和lcdr3的核酸分子的序列标识符。
本发明提供抗体或其抗原结合片段，其包括hcvr，所述hcvr包括选自表1中所列出的任何hcvr氨基酸序列的氨基酸序列或其与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性的基本相似的序列。
本发明还提供抗体或其抗原结合片段，其包括lcvr，所述lcvr包括选自表1中所列出的任何lcvr氨基酸序列的氨基酸序列或其与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性的基本相似的序列。
本发明还提供了抗体或其抗原结合片段，其包括hcvr和lcvr氨基酸序列对(hcvr/lcvr)，所述序列对包括与表1中所列出的任何lcvr氨基酸序列配对的表1中所列出的任何hcvr氨基酸序列。根据某些实施例，本发明提供抗体或其抗原结合片段，其包括表1中所列出的任何示例性抗steap2抗体内含有的hcvr/lcvr氨基酸序列对。在某些实施例中，hcvr/lcvr氨基酸序列对选自由seqidno:250/258组成的组(例如，h2m11162n)。
本发明还提供抗体或其抗原结合片段，其包括重链cdr1(hcdr1)，所述重链cdr1包括选自表1中所列出的任何hcdr1氨基酸序列的氨基酸序列或其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性的基本相似的序列。
本发明还提供抗体或其抗原结合片段，其包括重链cdr2(hcdr2)，所述重链cdr2包括选自表1中所列出的任何hcdr2氨基酸序列的氨基酸序列或其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性的基本相似的序列。
本发明还提供抗体或其抗原结合片段，其包括重链cdr3(hcdr3)，所述重链cdr3包括选自表1中所列出的任何hcdr3氨基酸序列的氨基酸序列或其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性的基本相似的序列。
本发明还提供抗体或其抗原结合片段，其包括轻链cdr1(lcdr1)，所述轻链cdr1包括选自表1中所列出的任何lcdr1氨基酸序列或至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性的基本相似的序列。
本发明还提供抗体或其抗原结合片段，其包括轻链cdr2(lcdr2)，所述轻链cdr2包括选自表1中所列出的任何lcdr2氨基酸序列的氨基酸序列或其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性的基本相似的序列。
本发明还提供抗体或其抗原结合片段，其包括轻链cdr3(lcdr3)，所述轻链cdr3包括选自表1中所列出的任何lcdr3氨基酸序列的氨基酸序列或其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性的基本相似的序列。
本发明还提供了抗体或其抗原结合片段，其包括hcdr3和lcdr3氨基酸序列对(hcdr3/lcdr3)，所述序列对包括与表1中所列出的任何lcdr3氨基酸序列配对的表1中所列出的任何hcdr3氨基酸序列。根据某些实施例，本发明提供抗体或其抗原结合片段，其包括表1中所列出的任何示例性抗steap2抗体内含有的hcdr3/lcdr3氨基酸序列对。在某些实施例中，hcdr3/lcdr3氨基酸序列对选自由seqidno:256/264组成的组(例如，h2m11162n)。
本发明还提供了抗体或其抗原结合片段，其包括表1中所列出的任何示例性抗steap2抗体中含有的一组六个cdr(即，hcdr1-hcdr2-hcdr3-lcdr1-lcdr2-lcdr3)。在某些实施例中，hcdr1-hcdr2-hcdr3-lcdr1-lcdr2-lcdr3氨基酸序列组选自由seqidno:252-254-256-260-262-264组成的组(例如，h2m11162n)。
在相关实施例中，本发明提供抗体或其抗原结合片段，其包括由表1中所列出的任何示例性抗steap2抗体限定的hcvr/lcvr氨基酸序列内含有的一组六个cdr(即，hcdr1-hcdr2-hcdr3-lcdr1-lcdr2-lcdr3)。例如，本发明包含抗体或其抗原结合片段，其包括选自由seqseqidno:250/258组成的组(例如，h2m11162n)的hcvr/lcvr氨基酸序列对内含有的hcdr1-hcdr2-hcdr3-lcdr1-lcdr2-lcdr3氨基酸序列组。用于鉴定hcvr和lcvr氨基酸序列内的cdr的方法和技术是本领域熟知的，并且可以用于鉴定本文公开的特定hcvr和/或lcvr氨基酸序列内的cdr。可用于识别cdr的边界的示例性规约包含例如，kabat定义、chothia定义和abm定义。一般而言，kabat定义基于序列可变性，chothia定义基于结构环区域的位置，abm定义是kabat和chothia方式之间的折衷。参见例如，kabat，“免疫学蛋白质序列(sequencesofproteinsofimmunologicalinterest)”，国立卫生研究院，贝塞斯达(bethesda)，马里兰州，(1991)；al-lazikani等人，《分子生物杂志》；273:927-948(1997)；以及martin等人，美国国家科学院院刊(proc.natl.acad.sci.usa)，86:9268-9272，(1989)。公共数据库也可用于鉴定抗体内的cdr序列。
本发明还提供了编码抗steap2抗体或其部分的核酸分子。例如，本发明提供了编码表1中所列出的任何hcvr氨基酸序列的核酸分子；在某些实施例中，核酸分子包括选自表2中列出的任何hcvr核酸序列的多核苷酸序列或其与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性的基本相似的序列。
本发明还提供了编码表1中所列出的任何lcvr氨基酸序列的核酸分子；在某些实施例中，核酸分子包括选自表2中所列出的任何lcvr核酸序列的多核苷酸序列，或其与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性的基本相似的序列。
本发明还提供了编码表1中所列出的任何hcdr1氨基酸序列的核酸分子；在某些实施例中，核酸分子包括选自表2中列出的任何hcdr1核酸序列的多核苷酸序列或其与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性的基本相似的序列。
本发明还提供了编码表1中所列出的hcdr2氨基酸序列的核酸分子；在某些实施例中，核酸分子包括选自表2中所列出的任何hcdr2核酸序列的多核苷酸序列，或其与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性的基本相似的序列。
本发明还提供了编码表1中所列出的任何hcdr3氨基酸序列的核酸分子；在某些实施例中，核酸分子包括选自表2中列出的任何hcdr3核酸序列的多核苷酸序列或其与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性的基本相似的序列。
本发明还提供了编码表1中所列出的lcdr1氨基酸序列的核酸分子；在某些实施例中，核酸分子包括选自表2中所列出的任何lcdr1核酸序列的多核苷酸序列，或其与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性的基本相似的序列。
本发明还提供了编码表1中所列出的任何lcdr2氨基酸序列的核酸分子；在某些实施例中，核酸分子包括选自表2中列出的任何lcdr2核酸序列的多核苷酸序列或其与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性的基本相似的序列。
本发明还提供了编码表1中所列出的lcdr3氨基酸序列的核酸分子；在某些实施例中，核酸分子包括选自表2中所列出的任何lcdr3核酸序列的多核苷酸序列，或其与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性的基本相似的序列。
本发明还提供了编码hcvr的核酸分子，其中hcvr包括一组三个cdr(即，hcdr1-hcdr2-hcdr3)，其中hcdr1-hcdr2-hcdr3氨基酸序列组如表1中所列出的任何示例性抗steap2所定义。
本发明还提供了编码lcvr的核酸分子，其中lcvr包括一组三个cdr(即，lcdr1-lcdr2-lcdr3)，其中lcdr1-lcdr2-lcdr3氨基酸序列组如表1中所列出的任何示例性抗steap2抗体所定义。
本发明还提供了编码hcvr和lcvr二者的核酸分子，其中hcvr包括表1中所列出的任何hcvr氨基酸序列的氨基酸序列，并且其中lcvr包括表1中所列出的任何lcvr氨基酸序列的氨基酸序列。在某些实施例中，核酸分子包括选自表2中所列出的任何hcvr核酸序列的多核苷酸序列，或其与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性的基本相似的序列，以及选自表2中所列出的任何lcvr核酸序列的多核苷酸序列，或其与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性的基本相似的序列。在根据本发明的此方面的某些实施例中，核酸分子编码hcvr和lcvr，其中hcvr和lcvr均衍生自表1中所列出的同一抗steap2抗体。
本发明还提供了能够表达包括抗steap2抗体的重链或轻链可变区的多肽的重组表达载体。例如，本发明包含重组表达载体，其包括任何上述核酸分子，即，编码如表1中所列出的任何hcvr、lcvr和/或cdr序列的核酸分子。还包含在本发明范围内的是引入了此类载体的宿主细胞，以及通过在允许产生抗体或抗体片段的条件下培养宿主细胞而产生抗体或其部分，并回收如此产生的抗体和抗体片段的方法。
本发明包含具有经修饰的糖基化模式的抗steap2抗体。在一些实施例中，例如，可使用修饰以去除不期望的糖基化位点，或者在寡糖链上存在缺乏岩藻糖部分的抗体，以增加抗体依赖性细胞毒性(adcc)功能(参见shield等人，(2002)，jbc277:26733)。在其它应用中，可以进行半乳糖基化的修饰以修饰补体依赖性细胞毒性(cdc)。
在另一个方面，本发明提供了药物组合物，其包括特异性结合steap2的重组人抗体或其片段以及药学上可接受的载剂。在相关方面，本发明的特征在于一种组合物，其是抗steap2抗体和第二治疗剂的组合。在一个实施例中，第二治疗剂是有利地与抗steap2抗体组合的任何药剂。涉及本发明的抗steap2抗体的其它组合疗法和共制剂在本文其它地方公开。
在另一个方面，本发明提供了使用本发明的抗steap2抗体靶向/杀死表达steap2的肿瘤细胞的治疗方法，其中所述治疗方法包括向有此需要的受试者施用治疗有效量的包括本发明的抗steap2抗体的药物组合物。在一些情况下，抗steap2抗体(或其抗原结合片段)可以用于治疗前列腺癌，或者可以通过以下方法修饰为更具细胞毒性：包含但不限于用以增加adcc的经修饰的fc结构域(参见例如，shield等人，(2002)，jbc277:26733)、放射免疫疗法、抗体-药物偶联物或用于提高肿瘤消融效率的其它方法。
本发明还包含本发明的抗steap2抗体在制造用于治疗与steap2表达细胞相关或由其导致的疾病或病状(例如，癌症)的药物中的用途。在一个方面，本发明涉及用于医学中的包括如本文所公开的抗steap2抗体或抗原结合片段或steap2xcd3双特异性抗体的化合物。在一个方面，本发明涉及用于医学中的包括如本文所公开的抗体-药物偶联物(adc)的化合物。
在又另一个方面，本发明提供了用于诊断应用的单特异性抗steap2抗体，例如，成像试剂。
在又另一个方面，本发明提供了使用本发明抗体的抗cd3抗体或抗原结合部分刺激t细胞活化的治疗方法，其中所述治疗方法包括施用治疗有效量的包括抗体的药物组合物。
在另一个方面，本发明提供了分离的抗体或其抗原结合片段，其以如通过facs分析所测量的小于50nm的ec50结合steap2表达c4-2细胞。在另一个方面，本发明提供了分离的抗体或其抗原结合片段，其与steap2表达c4-2细胞结合并由其内化。
本发明进一步提供了抗体或抗原结合片段，其与包括如表1中所列出的hcvr/lcvr氨基酸序列对的参考抗体竞争结合到人steap2。在另一个方面，本发明提供了抗体或抗原结合片段，其与包括选自由以下组成的组的hcvr/lcvr氨基酸序列对的参考抗体竞争结合到steap2：seqidno:2/10；18/26；34/42；50/58；66/58；74/58；82/58；90/58；98/58；106/114；122/130；138/146；154/162；170/178；186/194；202/210；218/226；234/242；250/258；266/274；282/290；298/306；314/322；330/338；346/354；362/370；以及378/386。
本发明还提供了抗体或抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段与包括如表1所列出的hcvr/lcvr氨基酸序列对的参考抗体结合到人steap2上的同一抗原决定基。在另一个方面，抗体或抗原结合片段与包括选自由以下组成的组的hcvr/lcvr氨基酸序列对的参考抗体结合到人steap2上的同一抗原决定基：seqidno:2/10；18/26；34/42；50/58；66/58；74/58；82/58；90/58；98/58；106/114；122/130；138/146；154/162；170/178；186/194；202/210；218/226；234/242；250/258；266/274；282/290；298/306；314/322；330/338；346/354；362/370；以及378/386。
本发明还提供了结合人steap2的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段包括：具有如表1中所列出的氨基酸序列的重链可变区(hcvr)的互补决定区(cdr)；以及具有如表1中所列出的氨基酸序列的轻链可变区(lcvr)的cdr。在另一个方面，所述抗体或抗原结合片段包括选自由以下组成的组的hcvr/lcvr氨基酸序列对的重链cdr和轻链cdr：seqidno:2/10；18/26；34/42；50/58；66/58；74/58；82/58；90/58；98/58；106/114；122/130；138/146；154/162；170/178；186/194；202/210；218/226；234/242；250/258；266/274；282/290；298/306；314/322；330/338；346/354；362/370；以及378/386。在又另一个方面，所述分离的抗体或抗原结合片段包括分别选自由以下组成的组的hcdr1-hcdr2-hcdr3-lcdr1-lcdr2-lcdr3结构域：seqidno:4-6-8-12-14-16；20-22-24-28-30-32；36-38-40-44-46-48；52-54-56-60-62-64；68-70-72-60-62-64；76-78-80-60-62-64；84-86-88-60-62-64；92-94-96-60-62-64；100-102-104-60-62-64；108-110-112-116-118-120；124-126-128-132-134-136；140-142-144-148-150-152；156-158-160-164-166-168；172-174-176-180-182-184；188-190-192-196-198-200；204-206-208-212-214-216；220-222-224-228-230-232；236-238-240-244-246-248；252-254-256-260-262-264；268-270-272-276-278-280；284-286-288-292-294-296；300-302-304-308-310-312；316-318-320-324-326-328；332-334-336-340-342-344；348-350-352-356-358-360；364-366-368-372-374-376；以及380-382-384-388-390-392。
在另一个方面，本发明还提供了结合人steap2的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段包括：(a)具有选自由以下组成的组的氨基酸序列的重链可变区(hcvr)：seqidno:2、18、34、50、66、74、82、90、98、106、122、138、154、170、186、202、218、234、250、266、282、298、314、330、346、362以及378；以及(b)具有选自由以下组成的组的氨基酸序列的轻链可变区(lcvr)：seqidno:10；26；42；58；114；130；146；162；178；194；210；226；242；258；274；290；306；322；338；354；370；以及386。在进一步的方面，根据权利要求10所述的分离的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段包括选自由以下组成的组的hcvr/lcvr氨基酸序列对：seqidno:2/10；18/26；34/42；50/58；66/58；74/58；82/58；90/58；98/58；106/114；122/130；138/146；154/162；170/178；186/194；202/210；218/226；234/242；250/258；266/274；282/290；298/306；314/322；330/338；346/354；362/370；以及378/386。
根据另一个方面，本发明提供了抗体-药物偶联物，其包括抗steap2抗体或其抗原结合片段和治疗剂(例如，细胞毒性剂)。在一些实施例中，如本文所讨论的，抗体或抗原结合片段和细胞毒性剂通过连接子共价连接。在各种实施例中，抗steap2抗体或抗原结合片段可以是本文所描述的任何抗steap2抗体或片段。
在一些实施例中，所述细胞毒性剂选自奥瑞斯他汀、美登木素生物碱、妥布赖森、茅屋霉素衍生物，或多拉司他汀衍生物。在一些情况下，所述细胞毒性剂是选自mmae或mmaf的奥瑞斯他汀或选自dm1或dm4的美登木素。在一些实施例中，如本文所讨论的，所述细胞毒性剂是具有式(i)或式(ii)的结构的美登木素。
在一些实施例中，所述细胞毒性剂是具有以下结构的美登木素生物碱：
在一些实施例中，所述细胞毒性剂是具有以下结构的美登木素生物碱：
在一些实施例中，抗体-药物偶联物包括抗steap2抗体或其片段，以及
其中
在一些实施例中，抗体-药物偶联物包括抗steap2抗体或其片段，以及
其中
在一些实施例中，抗体-药物偶联物包括抗steap2抗体或其片段，以及
其中
在一些实施例中，所述键通过半胱氨酸残基的硫组分与所述抗体或其片段接触。
在一些实施例中，抗体-药物偶联物包括抗steap2抗体或其片段，以及
其混合物，
其中
在一些实施例中，所述键通过赖氨酸残基的氮组分与所述抗体或其片段接触。
在上文或本文所讨论的抗体-药物偶联物的任何各种实施例中，抗体-药物偶联物可以包括每抗steap2抗体或其片段1到4种细胞毒性剂。
根据另一个方面，本发明提供了结合steap2和cd3的双特异性抗原结合分子(例如，抗体)。此类双特异性抗原结合分子在本文中也称为“抗steap2/抗cd3双特异性分子”，“抗cd3/抗-steap2双特异性分子”或“steap2xcd3bsab”。抗steap2/抗cd3双特异性分子的抗steap2部分可用于靶向表达steap2(例如，前列腺肿瘤)的细胞(例如，肿瘤细胞)，并且双特异性分子的抗cd3部分可用于激活t细胞。steap2在肿瘤细胞和t细胞上的cd3的同时结合促进了活化的t细胞对靶肿瘤细胞的定向杀死(细胞裂解)。因此，本发明的抗steap2/抗cd3双特异性分子尤其可用于治疗与steap2表达肿瘤(例如，前列腺癌)相关或由其引起的疾病和病状。
根据本发明的此方面的双特异性抗原结合分子包括特异性结合人cd3的第一抗原结合域和特异性结合steap2的第二抗原结合域。本发明包含抗steap2/抗cd3双特异性分子(例如，双特异性抗体)，其中每个抗原结合域包括与轻链可变区(lcvr)配对的重链可变区(hcvr)。在本发明的某些示例性实施例中，抗cd3抗原结合域和抗steap2抗原结合域各自包括与共同lcvr配对的不同的去区独特的hcvr。例如，如本文的实例4中所示的，构建了包括以下的双特异性抗体：特异性结合cd3的第一抗原结合域，其中所述第一抗原结合域包括衍生自抗cd3抗体的hcvr，所述抗cd3抗体与衍生自抗steap2抗体的lcvr(例如，包含在抗steap2抗原结合域中的同一lcvr)配对；以及特异性结合steap2的第二抗原结合域，其中所述第二抗原结合域包括衍生自抗steap2抗体的hcvr/lcvr。换句话说，在本文公开的示例性分子中，来自抗cd3抗体的hcvr与来自抗steap2抗体的lcvr的配对产生特异性结合cd3(但不结合steap2)的抗原结合域。在此类实施例中，第一抗原结合域和第二抗原结合域包括不同的抗cd3和抗steap2hcvr，但共有共同的抗steap2lcvr。在其它实施例中，双特异性抗原结合分子包括不同的抗cd3和抗steap2hcvr，但共有共同的lcvr。此lcvr的氨基酸序列示于例如，seqidno:1890中，并且对应的cdr的氨基酸序列(即，lcdr1-lcdr2-lcdr3)分别示于seqidno:1892、1894和1896中。经遗传修饰的小鼠可以用于产生包括两条不同的重链的完全人双特异性抗原结合分子，所述重链与包括衍生自两个不同人轻链可变区基因区段中的一个的可变域的相同轻链缔合。可替代地，可变重链可以与一条共同轻链配对并在宿主细胞中重组表达。如此，本发明的抗体可以包括与单个重排轻链相关的免疫球蛋白重链。在一些实施例中，轻链包括衍生自人vκ1-39基因区段或vκ3-20基因区段的可变域。在其它实施例中，轻链包括衍生自用人jκ5或人jκ1基因区段重排的人vκ1-39基因区段的可变域。
本发明提供了抗cd3/抗steap2双特异性分子，其中特异性结合cd3的第一抗原结合域包括于2014年3月27日公布的美国公开2014/0088295和于2016年7月29日提交的pct/us2016/044732中公开的任何hcvr氨基酸序列、任何lcvr氨基酸序列、任何hcvr/lcvr氨基酸序列对、任何重链cdr1-cdr2-cdr3氨基酸序列、或任何轻链cdr1-cdr2-cdr3氨基酸序列。
另外，本发明提供了抗cd3/抗steap2双特异性分子，其中特异性结合cd3的第一抗原结合域包括如本文的表9、表11和表15中所列出的任何hcvr氨基酸序列。特异性结合cd3的第一抗原结合域还可以包括如本文的表1、表9、表12和表17中所列出的任何lcvr氨基酸序列。根据某些实施例，特异性结合cd3的第一抗原结合域包括如本文的表9、表11、表12、表15和表17中所列出的任何hcvr/lcvr氨基酸序列对。本发明还提供了抗cd3/抗steap2双特异性分子，其中特异性结合cd3的第一抗原结合域包括如本文表9、表11和表15中所列出的任何重链cdr1-cdr2-cdr3氨基酸序列和/或如本文的表1、表9、表12和表17中所列出的任何轻链cdr1-cdr2-cdr3氨基酸序列。
根据某些实施例，本发明提供了抗cd3/抗steap2双特异性分子，其中特异性结合cd3的第一抗原结合域包括重链可变区(hcvr)，所述重链可变区具有如本文的表9、表11和表15中所列出的氨基酸序列或其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性的基本相似的序列。
本发明还提供了抗cd3/抗steap2双特异性分子，其中特异性结合cd3的第一抗原结合域包括轻链可变区(lcvr)，所述轻链可变区具有如本文的表1、表9、表12和表17中所列出的氨基酸序列或其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性的基本相似的序列。
本发明还提供了抗cd3/抗steap2双特异性分子，其中特异性结合cd3的第一抗原结合域包括如本文的表9、表11、表12、表15和表17中所列出的hcvr和lcvr(hcvr/lcvr)氨基酸序列对。
本发明还提供了抗cd3/抗steap2双特异性分子，其中特异性结合cd3的第一抗原结合域包括以下：重链cdr3(hcdr3)结构域，其具有如本文的表9、表11和表15中所列出的氨基酸序列或其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性的基本相似的序列；以及轻链cdr3(lcdr3)结构域，其具有如本文的表1、表9、表12和表17中所列出的氨基酸序列或其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性的基本相似的序列。
在某些实施例中，特异性结合cd3的第一抗原结合域包括如本文的表9、表11、表12、表15和表17中所列出的hcdr3/lcdr3氨基酸序列对。
本发明还提供了抗cd3/抗steap2双特异性抗原结合分子，其中特异性结合cd3的第一抗原结合域包括以下：重链cdr1(hcdr1)结构域，其具有如本文的表9、表11和表15中所列出的氨基酸或其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性的基本相似的序列；轻链cdr2(hcdr2)结构域，其具有如表9、表11和表15中所列出的氨基酸或其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性的基本相似的序列；重链cdr3(hcdr3)结构域，其具有如表9、表11和表15中所列出的氨基酸或其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性的基本相似的序列；轻链cdr1(lcdr1)结构域，其具有如本文的表1、表9、表12和表17中所列出的氨基酸序列或其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性的基本相似的序列；轻链cdr2(lcdr2)结构域，其具有如本文的表1、表9、表12和表17中所列出的氨基酸序列或其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性的基本相似的序列；以及轻链cdr3(lcdr3)结构域，其具有如本文的表1、表9、表12和表17中所列出的氨基酸序列或其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性的基本相似的序列。
本发明的某些非限制性、示例性抗cd3/抗steap2双特异性抗原结合分子包含分别特异性结合包括hcdr1-hcdr2-hcdr3-lcdr1-lcdr2-lcdr3结构域的cd3的第一抗原结合域，所述第一抗原结合域具有如本文的表9、表11、表12、表15和表17中所列出的氨基酸序列。
本发明进一步提供了双特异性抗原结合分子，其中特异性结合人cd3的所述第一抗原结合域包括来自重链可变区(hcvr)的重链互补决定区(hcdr1、hcdr2和hcdr3)和来自轻链可变区(lcvr)的轻链互补决定区(lcdr1、lcdr2和lcdr3)，所述重链可变区包括表9、表11或表15中所列出的氨基酸序列，并且所述轻链可变区来自包括表1、表9、表12或表17中所列出的氨基酸序列的轻链可变区(lcvr)。
在另一个方面，本发明提供了双特异性抗原结合分子，其中特异性结合人cd3的所述第一抗原结合域包括来自重链可变区(hcvr)的重链互补决定区(hcdr1、hcdr2和hcdr3)和来自轻链可变区(lcvr)的轻链互补决定区(lcdr1、lcdr2和lcdr3)，所述重链可变区选自由seqidno:1730、1762和1866组成的组，并且所述轻链可变区包括选自由seqidno:258组成的组的氨基酸序列。
本发明进一步提供了双特异性抗原结合分子，其中特异性结合人cd3的所述第一抗原结合域包括三个重链互补决定区(a1-hcdr1、a1-hcdr2和a1-hcdr3)和三个轻链互补决定区(a1-lcdr1、a1-lcdr2和a1-lcdr3)，其中a1-hcdr1包括选自由seqidno:1732、1764和1868组成的组的氨基酸序列；a1-hcdr2包括选自由seqidno:1734、1766和1870组成的组的氨基酸序列；a1-hcdr3包括选自由seqidno:1736、1768和1872组成的组的氨基酸序列；a1-lcdr1包括seqidno:260的氨基酸序列；a1-lcdr2包括seqidno:262的氨基酸序列；并且a1-lcdr3包括seqidno:264的氨基酸序列。
在进一步的方面，本发明提供了双特异性抗原结合分子，其中特异性结合人cd3的所述第一抗原结合域包括选自由以下组成的组的hcvr/lcvr氨基酸序列对的重链cdr和轻链cdr：seqidno:1730/258、1762/258和1866/258。
在另一个方面，本发明提供了双特异性抗原结合分子，其中特异性结合人cd3的所述第一抗原结合域包括三个重链互补决定区(a1-hcdr1、a1-hcdr2和a1-hcdr3)和三个轻链互补决定区(a1-lcdr1、a1-lcdr2和a1-lcdr3)，并且其中特异性结合人steap2的所述第二抗原结合域包括三个重链互补决定区(a2-hcdr1、a2-hcdr2和a2-hcdr3)和三个轻链互补决定区(a2-lcdr1、a2-lcdr2和a2-lcdr3)；其中a1-hcdr1包括选自由seqidno:1732、1764和1868组成的组的氨基酸序列；a1-hcdr2包括选自由seqidno:1734、1766和1870组成的组的氨基酸序列；a1-hcdr3包括选自由seqidno:1736、1768和1872组成的组的氨基酸序列；a1-lcdr1包括seqidno:260的氨基酸序列；a1-lcdr2包括seqidno:262的氨基酸序列；并且a1-lcdr3包括seqidno:264的氨基酸序列；并且其中a2-hcdr1包括seqidno:252的氨基酸序列；a2-hcdr2包括seqidno:254的氨基酸序列；a2-hcdr3包括seqidno:256的氨基酸序列；a2-lcdr1包括seqidno:260的氨基酸序列；a2-lcdr2包括seqidno:262的氨基酸序列；并且a2-lcdr3包括seqidno:264的氨基酸序列。
本发明的某些非限制性、示例性抗cd3/抗steap2双特异性抗原结合分子包含特异性结合cd3的第一抗原结合域，所述第一抗原结合域包括具有选自由fr1(seqidno:1903)、fr2(seqidno:1904)、fr3(seqidno:1905)和fr4(seqidno:1906)的氨基酸序列的可变域框架区的重链。
在更多的实施例中，本发明的示例性抗cd3/抗steap2双特异性抗原结合分子包含双特异性抗原结合分子，其中特异性结合人cd3的第一抗原结合域包括hcvr，所述hcvr包括具有seqidno:1907-1908-1909的氨基酸序列的hcdr1-hcdr2-hcdr3的hcvr。
本发明还提供了抗cd3/抗steap2双特异性分子，其中特异性结合steap2的所述第二抗原结合域包括具有选自由以下组成的组的氨基酸序列的重链可变区(hcvr)：seqidno:2、18、34、50、66、74、82、90、98、106、122、138、154、170、186、202、218、234、250、266、282、298、314、330、346、362和378或其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性的基本相似的序列。
本发明还提供了抗cd3/抗steap2双特异性分子，其中特异性结合steap2的所述第二抗原结合域包括具有选自由以下组成的组的氨基酸序列的轻链可变区(lcvr)：seqidno:10；26；42；58；114；130；146；162；178；194；210；226；242；258；274；290；306；322；338；354；370；以及386或其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性的基本相似的序列。
本发明还提供了抗cd3/抗steap2双特异性分子，其中特异性结合steap2的第二抗原结合域包括seqidno:250/258的hcvr和lcvr(hcvr/lcvr)氨基酸序列对。
本发明还提供了抗cd3/抗steap2双特异性分子，其中特异性结合steap2的第二抗原结合域包括以下：重链cdr3(hcdr3)结构域，其具有seqidno:256的氨基酸序列或其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性的基本相似的序列；和轻链cdr3(lcdr3)结构域，其具有seqidno:264的氨基酸或其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性的基本相似的序列。
在某些实施例中，特异性结合steap2的第二抗原结合域包括选自由seqidno:256/264组成的组的hcdr3/lcdr3氨基酸序列对。
本发明还提供了抗cd3/抗steap2双特异性抗原结合分子，其中特异性结合steap2的所述第二抗原结合域包括以下：重链cdr1(hcdr1)结构域，其具有选自由以下组成的组的氨基酸序列：seqidno:4、20、36、52、68、76、84、92、100、108、124、140、156、172、188、204、220、236、252、268、284、300、316、332、348、364和380或其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性的基本相似的序列；重链cdr2(hcdr2)结构域，其具有选自由以下组成的组的氨基酸序列：seqidno:6、22、38、54、70、78、86、94、102、110、126、142、158、174、190、206、222、238、254、270、286、302、318、334、350、366和382或其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性的基本相似的序列；重链cdr3(hcdr3)结构域，其具有选自由以下组成的组的氨基酸序列：seqidno:8、24、40、56、72、80、88、96、104、112、128、144、160、176、182、208、224、240、256、272、288、304、320、336、352、368和384或其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性的基本相似的序列；具有选自由以下组成的组的氨基酸序列的轻链cdr1(lcdr1)结构域：seqidno:12、28、44、60、116、132、148、164、180、196、212、228、244、260、276、292、308、324、340、356、372和388或其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性的基本相似的序列；以及轻链cdr2(lcdr2)结构域，其具有选自由以下组成的组的氨基酸序列：seqidno:14、30、46、62、118、134、150、166、182、198、214、230、246、262、278、294、310、326、342、358、374和390或其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性的基本相似的序列；以及轻链cdr3(lcdr3)结构域，其具有选自由以下组成的组的氨基酸序列：seqidno:16、32、48、64、120、136、152、168、184、200、216、232、248、264、280、296、312、328、344、360、376和392或其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性的基本相似的序列。
本发明的某些非限制性、示例性抗cd3/抗steap2双特异性抗原结合分子包含分别特异性结合包括hcdr1-hcdr2-hcdr3-lcdr1-lcdr2-lcdr3结构域的steap2的第二抗原结合域，所述第二抗原结合域具有选自由以下组成的组的氨基酸序列：seqidno:252-254-256-260-262-264。
在相关实施例中，本发明包含抗cd3/抗steap2双特异性抗原结合分子，其中特异性结合steap2的第二抗原结合域包括在选自由seqidno:250/258组成的组的重链和轻链可变区(hcvr/lcvr)序列内含有的重链和轻链cdr结构域。
在另一个方面，本发明提供了双特异性抗原结合分子，其包括结合人cd3的第一抗原结合域和结合人steap2的第二抗原结合域，其中所述第二抗原结合域衍生自本发明的任何一种抗steap2抗体的的抗体或抗原结合片段。在进一步的方面，本发明提供了双特异性抗原结合分子，其包括特异性结合人cd3的第一抗原结合域和特异性结合人steap2的第二抗原结合域。
本发明进一步提供了双特异性抗原结合分子，其结合表达人cd3的人细胞和表达食蟹猴cd3的食蟹猴细胞。在另一个方面，双特异性抗原结合分子结合表达人steap2的人细胞。
在另一个方面，本发明提供了双特异性抗原结合分子，其抑制在携带人前列腺癌异种移植物的免疫受损小鼠中的肿瘤生长。
在某些实施例中，本发明的抗cd3抗体、其抗原结合片段和双特异性抗体通过基于种系序列和亲本抗体序列之间的差异以逐步方式替代亲本的氨基酸残基来制备。
在一些实施例中，本发明提供了特异性抗原结合分子，其中所述第二抗原结合域与包括三个重链互补决定区(a2-hcdr1、a2-hcdr2和a2-hcdr3)以及三个轻链互补决定区(a2-lcdr1、a2-lcdr2和a2-lcdr3)的参考抗原结合蛋白竞争结合到人steap2，其中a2-hcdr1包括选自由seqidno:252组成的组的氨基酸序列；a2-hcdr2包括seqidno:254的氨基酸序列；a2-hcdr3包括seqidno:256的氨基酸序列；a2-lcdr1包括seqidno:260的氨基酸序列；a2-lcdr2包括seqidno:262的氨基酸序列；并且a2-lcdr3包括seqidno:264的氨基酸序列。在一些实施例中，本发明提供了特异性抗原结合分子，其中所述第二抗原结合域与包括重链可变区(hcvr)和轻链可变区(lcvr)的参考抗原结合蛋白竞争结合到人steap2，所述重链可变区包括seqidno:250的氨基酸序列，并且所述轻链可变区包括seqidno:258的氨基酸序列。
在一些实施例中，本发明提供了特异性抗原结合分子，其中所述第一抗原结合域与包括三个重链互补决定区(a1-hcdr1、a1-hcdr2和a1-hcdr3)以及三个轻链互补决定区(a1-lcdr1、a1-lcdr2和a1-lcdr3)的参考抗原结合蛋白竞争结合到人cd3，其中a1-hcdr1包括选自由seqidno:1732、1764和1868组成的组的氨基酸序列；a1-hcdr2包括选自由seqidno:1734、1766和1870组成的组的氨基酸序列；a1-hcdr3包括选自由seqidno:1736、1768和1872组成的组的氨基酸序列；a1-lcdr1包括seqidno:260的氨基酸序列；a1-lcdr2包括seqidno:262的氨基酸序列；并且a1-lcdr3包括seqidno:264的氨基酸序列。在一些实施例中，本发明提供了特异性抗原结合分子，其中所述第一抗原结合域与包括重链可变区(hcvr)和轻链可变区(lcvr)的参考抗原结合蛋白竞争结合到人cd3，所述重链可变区包括选自由seqidno:1730、1762和1866组成的组的氨基酸序列，并且所述轻链可变区包括seqidno:258的氨基酸序列；
在一些实施例中，本发明提供了特异性抗原结合分子，其中所述第一抗原结合域与包括重链可变区(hcvr)和轻链可变区(lcvr)的参考抗原结合蛋白竞争结合到人cd3，所述重链可变区包括选自由seqidno:1730、1762和1866组成的组的氨基酸序列，并且所述轻链可变区包括seqidno:258的氨基酸序列；并且其中所述第二抗原结合域与包括重链可变区(hcvr)和轻链可变区(lcvr)的参考抗原结合蛋白竞争结合到人steap2，所述重链可变区包括seqidno:250的氨基酸序列，并且所述轻链可变区包括seqidno:258的氨基酸序列。
在一个方面，本发明提供了药物组合物，其包括抗steap2抗原结合分子或抗steap2/抗cd3双特异性抗原结合分子以及药学上可接受的载剂或稀释剂。本发明进一步提供治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括向受试者施用包括抗steap2抗原结合分子或抗steap2/抗cd3双特异性抗原结合分子以及药学上可接受的载剂或稀释剂的药物组合物。在一些实施例中，所述癌症选自前列腺癌、膀胱癌、宫颈癌、肺癌、结肠癌、肾癌、乳腺癌、胰腺癌、胃癌、子宫癌和卵巢癌。在一些情况下，所述癌症是前列腺癌。在一些情况下，所述前列腺癌是去势抵抗性前列腺癌。
在另一个方面，本发明提供了编码本文公开的抗cd3/抗steap2双特异性抗原结合分子的任何hcvr、lcvr或cdr序列的核酸分子，所述核酸分子包含包括如本文的表2、表10、表13、表14、表16和表18中所列出的多核苷酸序列的核酸分子以及包括如表2、表10、表13、表14、表16和表18中所列出的多核苷酸序列的两种或更多种的任何功能组合或排列的核酸分子。携带本发明核酸的重组表达载体和引入了此类载体的宿主细胞也涵盖在本发明中，通过在允许产生抗体的条件下培养宿主细胞并回收产生的抗体来产生抗体的方法也是如此。
本发明包含抗cd3/抗steap2双特异性抗原结合分子，其中任何上述特异性结合cd3的抗原结合域与任何上述特异性结合steap2的抗原结合域组合、连接或以其它方式缔合，以形成结合cd3和steap2的双特异性抗原结合分子。
本发明包含具有经修饰的糖基化模式的抗cd3/抗steap2双特异性抗原结合分子。在一些应用中，例如，可使用修饰以去除不期望的糖基化位点，或者在寡糖链上存在缺乏岩藻糖部分的抗体，以增加抗体依赖性细胞毒性(adcc)功能(参见shield等人，(2002)，jbc277:26733)。在其它应用中，可以进行半乳糖基化的修饰以修饰补体依赖性细胞毒性(cdc)。
在另一个方面，本发明提供了药物组合物，其包括如本文所公开的抗cd3/抗steap2双特异性抗原结合分子以及药学上可接受的载剂。在相关方面，本发明的特征在于一种组合物，其是抗cd3/抗steap2双特异性抗原结合分子和第二治疗剂的组合。在一个实施例中，第二治疗剂是有利地与抗cd3/抗steap2双特异性抗原结合分子组合的任何试剂。可以有利地与抗cd3/抗steap2双特异性抗原结合分子组合的示例性试剂在本文的其它地方详细讨论。
在另一个方面，本发明提供了用于使用本发明的抗cd3/抗steap2双特异性抗原结合分子靶向/杀死表达steap2的肿瘤细胞的治疗方法，其中所述治疗方法包括向有需要的受试者将施用治疗有效量的包括本发明的抗cd3/抗steap2双特异性抗原结合分子的药物组合物。
本发明还包含本发明的抗cd3/抗steap2双特异性抗原结合分子在制造用于治疗与steap2表达细胞相关或由其导致的疾病或病状的药物中的用途。
通过阅读随后的详细描述，其它实施例将变得显而易见。
附图说明
图1示出了在移植后第13天以10mg/kg、20mg/kg或40mg/kgh1h7814n-7剂量施用的h1h7814n-7在steap2阳性前列腺癌异种移植模型(植入c4-2细胞的scid小鼠)中的疗效。
图2示出了在移植后第14天以20mg/kgh1h7814n-7剂量施用的h1h7814n-7在steap2阳性前列腺癌异种移植模型(植入c4-2细胞的scid小鼠)中的疗效。
图3示出了在移植后第17天以150μg/kgh1h7814n-7剂量施用的h1h7814n-7在steap2阳性前列腺癌异种移植模型(植入c4-2细胞的scid小鼠)中的疗效。
图4示出了在移植后第29天以2.5mg/kg(dar3.6tv)h1h7814n-60剂量施用的h1h7814n-60在steap2阳性前列腺癌异种移植模型(植入c4-2细胞的scid小鼠)中的疗效。
图5示出了steap2xcd3双特异性抗体与jurkat细胞的结合。
图6示出了steap2xcd3双特异性抗体与经工程改造以表达steap2/1嵌合构建体的人前列腺癌细胞系(pc3)的结合。
图7和图8示出了steap2xcd3双特异性抗体与食蟹猴t细胞的结合。
图9示出了steap2xcd3双特异性抗体对人pbmc增殖的诱导。
图10示出了steap2xcd3双特异性抗体对食蟹猴pbmc增殖的诱导。
图11示出了人pbmc存在下通过代表性steap2xcd3双特异性抗体在细胞毒性测定中的c4-2细胞(携带steap2的靶细胞)耗竭。
图12示出了代表性steap2xcd3双特异性抗体对人t细胞的活化，其与图11中所示的所观察到的靶细胞裂解相关。
具体实施方式
在描述本发明之前，应当理解的是本发明不限于所描述的具体方法和实验条件，因为此类方法和条件可以变化。还应当理解的是，本文使用的术语仅是为了描述具体实施例的目的，而并不旨在进行限制，因为本发明的范围仅由所附权利要求限定。
除非另外限定，否则本文使用的所有技术和科学术语具有的含义与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同。如本文所使用的，当用于提及具体所列举的数值时，术语“约”意指数值可以与所引用的值相差不超过1％。例如，如本文所使用的，表述“约100”包含99和101以及其之间的所有值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。
虽然类似或等效于本文描述的那些方法和材料的任何方法和材料也可以用于本发明的实践或测试，但现在描述优选的方法和材料。本说明书中提及的所有专利、申请和非专利出版物均通过引用整体并入本文。
定义
本文所使用的表述“cd3”是指作为多分子t细胞受体(tcr)的一部分在t细胞上表达的抗原，并且其由以下四个受体链中的两个缔合形成的同二聚体或异二聚体组成：cd3-ε、cd3-δ、cd3-ζ和cd3-γ。人cd3-ε包括seqidno:1897所示的氨基酸序列；人cd3-δ包括seqidno:1898所示的氨基酸序列。本文对蛋白质、多肽和蛋白质片段的所有提及旨在指代相应蛋白质、多肽或蛋白质片段的人类形式，除非明确指出其来自非人类物种。因此，表述“cd3”意指人cd3，除非指定为来自非人物种，例如，“小鼠cd3”、“猴cd3”等。
如本文所使用的，“结合cd3的抗体”或“抗cd3抗体”包含特异性识别单个cd3亚基(例如，ε、δ、γ或ζ)的抗体及其抗原结合片段，以及特异性识别两个cd3亚基的二聚体复合物(例如，γ/ε、δ/ε和ζ/ζcd3二聚体)的抗体及其抗原结合片段。本发明的抗体及抗原结合片段可以结合可溶性cd3和/或在细胞表面表达的cd3。可溶性cd3包含天然cd3蛋白以及如单体和二聚体cd3构建体等重组cd3蛋白变体，其缺乏跨膜结构域或以其它方式与细胞膜无关。
如本文所使用的，表述“在细胞表面表达的cd3”是指在体外或体内在细胞表面上表达的一种或多种cd3蛋白，使得cd3蛋白的至少一部分是暴露于细胞膜的细胞外侧的并且可被抗体的抗原结合部分接近。“在细胞表面表达的cd3”包含在细胞的膜中的功能性t细胞受体的背景下所含有的cd3蛋白。表述“在细胞表面表达的cd3”包含表达为细胞表面上的同型二聚体或异二聚体的一部分的cd3蛋白(例如，γ/ε、δ/ε和ζ/ζcd3二聚体)。表述“在细胞表面表达的cd3”还包含cd3链(例如，cd3-ε、cd3-δ或cd3-γ)，其在细胞表面上自身表达而没有其它cd3链类型。“在细胞表面表达的cd3”可以包括通常表达cd3蛋白的细胞表面上表达的cd3蛋白或由其组成。可替代地，“在细胞表面表达的cd3”可以包括在细胞表面上表达的cd3蛋白或由其组成，所述细胞通常在其表面上不表达人cd3，但已被人工工程化以在其表面上表达cd3。
本文所使用的表述“steap2”是指前列腺2的六跨膜上皮抗原。steap2是一种完整的六跨膜跨膜蛋白，在前列腺上皮细胞中高表达，并且是前列腺癌的细胞表面标志物，例如发现steap2在lncap前列腺细胞系中以显著水平表达(porkka等人，《实验室调查(labinvest)，2002，82:1573–1582)。steap2(uniprotkb/swiss-prot：q8nft2.3)是由定位在人类染色体区域7q21的steap2基因编码的490氨基酸蛋白质，参见例如如seqidno:1899所示的人steap2的氨基酸序列。
如本文所使用的，“结合steap2的抗体”或“抗steap2抗体”包含特异性识别steap2的抗体及其抗原结合片段。
术语“抗原结合分子”包含抗体和抗体的抗原结合片段，包含例如，双特异性抗体。
如本文所使用的，术语“抗体”意指包括至少一个与特定抗原(例如steap2或cd3)特异性结合或相互作用的互补决定区(cdr)的任何抗原结合分子或分子复合物。术语“抗体”包含免疫球蛋白分子，所述分子包括四条多肽链、通过二硫键相互连接的两条重(h)链和两条轻(l)链以及其多聚体(例如igm)。每条重链包括重链可变区(本文缩写为hcvr或vh)和重链恒定区。重链恒定区包括三个结构域ch1、ch2和ch3。每条轻链包括轻链可变区(本文缩写为lcvr或vl)和轻链恒定区。轻链恒定区包括一个结构域(cl1)。可以将vh区域和vl区域进一步细分为称作互补决定区(cdr)的高变区，其散布着更保守的称作构架区(fr)的区域。每个vh和vl由自氨基端到羧基端按以下顺序排列的三个cdr及四个fr构成：fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3、fr4。在本发明的不同实施例中，抗steap2抗体或抗cd3抗体(或其抗原结合部分)的fr可以与人种系序列相同，或者可以是天然的或人工修饰的。可以基于两个或更多个cdr的并列分析来定义氨基酸共有序列。
如本文所使用的，术语“抗体”还包含完整抗体分子的抗原结合片段。如本文所使用的，术语抗体的“抗原结合部分”、抗体的“抗原结合片段”等包含任何天然存在的、可酶促获得的、合成的或基因工程化的多肽或糖蛋白，其特异性结合抗原以形成复合物。抗体的抗原结合片段可以例如使用任何合适的标准技术从完整抗体分子衍生，如蛋白水解消化或涉及操纵和表达编码抗体可变以及任选地恒定结构域的dna的重组基因工程技术。这种dna是已知的和/或易于从例如，商业来源、dna文库(包含例如，噬菌体-抗体文库)获得，或可以合成。dna可以通过化学方法或通过分子生物学技术进行测序和操作，例如，将一个或多个可变和/或恒定结构域排列成合适的构型、或引入密码子、产生半胱氨酸残基、修饰、添加或缺失氨基酸等。
抗原结合片段的非限制性实例包含：(i)fab片段；(ii)f(ab')2片段；(iii)fd片段；(iv)fv片段；(v)单链fv(scfv)分子；(vi)dab片段；以及(vii)由模拟抗体的高变区的氨基酸残基组成的最小识别单位(例如，分离的互补决定区(cdr)，如cdr3肽)或受约束的fr3-cdr3-fr4肽。其它工程分子，如结构域特异性抗体、单结构域抗体、结构域缺失抗体、嵌合抗体、cdr嫁接抗体、双抗体、三抗体、四抗体、微抗体、纳米抗体(例如单价纳米抗体、二价纳米抗体等)，小型模块化免疫药物(smip)和鲨鱼变异ignar结构域也涵盖在本文所使用的表述“抗原结合片段”内。
抗体的抗原结合片段通常包括至少一个可变域。可变域可以具有任何大小或氨基酸组成，并且通常包括至少一个与一个或多个框架序列相邻或在框内的cdr。在具有与vl结构域相关的vh结构域的抗原结合片段中，vh和vl结构域可以以任何合适的排列相对于彼此定位。例如，可变区可以是二聚体并含有vh-vh、vh-vl或vl-vl二聚体。可替代地，抗体的抗原结合片段可以含有单体vh或vl结构域。
在某些实施例中，抗体的抗原结合片段可以含有至少一个与至少一个恒定结构域共价连结的可变域。可以在本发明的抗体的抗原结合片段内发现的可变域和恒定结构域的非限制性示例性构型包含：(i)vh-ch1；(ii)vh-ch2；(iii)vh-ch3；(iv)vh-ch1-ch2；(v)vh-ch1-ch2-ch3；(vi)vh-ch2-ch3；(vii)vh-cl；(viii)vl-ch1；(ix)vl-ch2；(x)vl-ch3；(xi)vl-ch1-ch2；(xii)vl-ch1-ch2-ch3；(xiii)vl-ch2-ch3；以及(xiv)vl-cl。在可变区和恒定区的任何构型中，包含上文所列出的任何示例性构型、可变域和恒定结构域可以彼此直接连结或可以通过完整或部分铰链或连接子区域连结。铰链区可以由至少2个(例如，5、10、15、20、40、60或更多个)氨基酸组成，其导致单个多肽分子中相邻可变域和/或恒定结构域之间的柔性或半柔性连结。此外，本发明的抗体的抗原结合片段可以包括上文所列出的任何可变域和恒定结构域构型的同二聚体或异二聚体(或其它多聚体)，其彼此非和/或与一个或多个单体vh或vl结构域共价缔合(例如，通过一个或多个二硫键)。
与完整抗体分子一样，抗原结合片段可以是单特异性的或多特异性的(例如，双特异性的)。抗体的多特异性抗原结合片段通常包括至少两个不同的可变域，其中每个可变域能够特异性结合到单独的抗原或同一抗原上的不同抗原决定基。任何多特异性抗体形式，包含本文公开的示例性双特异性抗体形式，可以使用本领域可用的常规技术适用于本发明抗体的抗原结合片段。
本发明的抗体可以通过补体依赖性细胞毒性反应(cdc)或抗体依赖性细胞介导的细胞毒性反应(adcc)起作用。“补体依赖性细胞毒性反应”(cdc)是指在补体存在下本发明抗体对抗原表达细胞的裂解。“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性反应”(adcc)是指如下细胞介导的反应：在其中表达fc受体(fcr)的非特异性细胞毒性细胞(例如，自然杀死细胞(nk)细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)识别靶细胞上的结合抗体，并且从而导致靶细胞的裂解。可以使用本领域熟知和可用的测定来测量cdc和adcc。(参见例如，美国专利号5,500,362和5,821,337以及clynes等人，(1998)，《美国国家科学院院刊》，95:652-656)。抗体的恒定区对于抗体固定补体和介导细胞依赖性细胞毒性翻译的能力是重要的。因此，可以基于抗体是否需要介导细胞毒性翻译来选择抗体的同种型。
在本发明的某些实施例中，本发明的抗steap2单特异性抗体或抗steap2/抗cd3双特异性抗体是人抗体。如本文所使用的，术语“人抗体”旨在包含具有来源于人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。本发明的人抗体可以包含并非由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变导入的突变)，例如在cdr区中，特别是在cdr3区中。然而，如本文所使用的，术语“人抗体”不旨在包含其中衍生自如小鼠等另一种哺乳动物物种的种系的cdr序列已经移植到人框架序列上的抗体。
在一些实施例中，本发明的抗体可以是重组人抗体。如本文所使用，的术语“重组人抗体”旨在包含通过重组方式制备、表达、产生或分离的所有人抗体，如使用转染到宿主细胞(以下进一步描述)内的重组表达载体表达的抗体、自重组、组合人抗体库(以下进一步描述)中分离的抗体、从对于人类免疫球蛋白基因而言为转基因的动物(例如，小鼠)中分离的抗体(参见例如，taylor等人，(1992)，《核酸研究(nucl.acidsres.)》，20:6287-6295)，或通过任何其它方式制备、表达、产生或分离的抗体，所述方式涉及将人免疫球蛋白基因序列剪接到其它dna序列上。这种重组人抗体具有从人种系免疫球蛋白序列衍生的可变区和恒定区。然而，在某些实施例中，这种重组人抗体经历体外诱变(或，当使用转基因人ig序列的动物时，经历体内体细胞诱变)，并且因此重组抗体的vh区和vl区的氨基酸序列是如下序列：虽然衍生自人种系vh序列和vl序列并与之相关，但可能并非天然在体内存在于人抗体种系库中。
人抗体可以以与铰链异质性相关的两种形式存在。在一种形式中，免疫球蛋白分子包括约150kda到160kda的稳定四链构建体，其中二聚体通过链间重链二硫键保持在一起。在第二种形式中，二聚体不通过链间二硫键连结，并且形成约75kda到80kda的分子，其由共价偶联的轻链和重链(半抗体)构成。即使在亲和纯化后，这些形式也极难分离。
在各种完整igg同种型中出现第二种形式的频率是基于但不限于与抗体的铰链区同种型相关的结构差异。人igg4铰链的铰链区中的单个氨基酸取代可以显著降低第二种形式的出现(angal等人，(1993)，《分子免疫学(molecularimmunology)》，30:105)到通常使用人igg1铰链所观察到的水平。本发明涵盖在铰链、ch2区或ch3区具有一个或多个突变的抗体，其可能是例如，在生产中所期望的，以提升所期望的抗体形式的产量。
本发明的抗体可以是分离的抗体。如本文所使用的，“分离的抗体”意指已经从其天然环境的至少一种组分中鉴定和分离和/或回收的抗体。例如，已经从生物体的至少一种组分，或从抗体天然存在或天然产生的组织或细胞中分离或除去的抗体是用于本发明的目的的“分离的抗体”。分离的抗体还包含重组细胞内的原位抗体。分离的抗体是已经历至少一个纯化或分离步骤的抗体。根据某些实施例，分离的抗体可以基本上不含其它细胞物质和/或化学品o
本发明还包含结合steap2单臂抗体。如本文所使用的，“单臂抗体”意指包括单抗体重链和单抗体轻链的抗原结合分子。本发明的单臂抗体可以包括表1中所列出的任何hcvr/lcvr或cdr氨基酸序列。
如与衍生抗体的对应种系序列相比，本文公开的抗steap2或抗steap2/抗cd3抗体可以在重链和轻链可变域的框架和/或cdr区中包括一个或多个氨基酸取代、插入和/或缺失。通过将本文公开的氨基酸序列与可以从例如，公共抗体序列数据库获得的种系序列进行比较，可以容易地确定这种突变。本发明包含抗体及其抗原结合片段，其衍生自本文公开的任何氨基酸序列，其中一个或多个框架和/或cdr区内的一个或多个氨基酸突变为衍生抗体的一个或多个对应的残基、或突变为另一种人种系序列的一个或多个对应的残基、或突变为一个或多个对应的种系残基的保守氨基酸取代(此类序列变化在本文中统称为“种系突变”)。从本文公开的重链和轻链可变区序列开始，本领域普通技术人员可以容易地生产包括一个或多个个体种系突变或其组合的许多抗体和抗原结合片段。在某些实施例中，vh结构域和/或vl结构域内的框架和/或cdr残基的全部突变回在衍生抗体的原始种系序列中所发现的残基。在其它实施例中，仅将某些残基突变回原始种系序列，例如，仅在fr1的前8个氨基酸内或在fr4的最后8个氨基酸内所发现的突变后的残基，或仅在cdr1、cdr2或cdr3中发现的突变后的残基。在其它实施例中，框架中和/或一个或多个cdr残基的一个或多个突变为不同种系序列(即，与最初衍生抗体的种系序列不同的种系序列)的一个或多个对应的残基。此外，本发明的抗体可以含有框架和/或cdr区内的两个或更多个种系突变的任何组合，例如，其中某些个体残基突变为特定种系序列的对应残基，而与原始种系序列不同的某些其它残基可以维持或突变为不同种系序列的对应残基。一旦获得，可以容易地测试含有一个或多个种系突变的抗体和抗原结合片段的一种或多种所期望的特性，如经改善的结合特异性、增加的结合亲和力、经改善或增强的拮抗或激动的生物学特性(视情况而定)、降低的免疫原性等。以这种通用方式获得的抗体和抗原结合片段涵盖在本发明内。
本发明还包含抗steap2或抗steap2/抗cd3抗体，其包括具有一个或多个保守取代的本文公开的任何hcvr、lcvr和/或cdr氨基酸序列的变体。例如，本发明包含具有hcvr、lcvr和/或cdr氨基酸序列的抗steap2或抗steap2/抗cd3抗体，相对于如本文的表1中所列出的或如本文的表9、表11、表12、表15和表17所列出的任何hcvr、lcvr和/或cdr氨基酸序列，所述hcvr、lcvr和/或cdr氨基酸序列具有例如，10个或更少、8个或更少、6个或更少、4个或更少等的保守氨基酸取代。
术语“抗原决定基”是指与称为互补位的抗体分子的可变区中的特定抗原结合位点相互作用的抗原决定簇。单个抗原可以具有多于一个抗原决定基。因此，不同的抗体可以结合抗原上的不同区域并且可以具有不同的生物效应。抗原决定基可以是构象的也可以是线性的。通过来自线性多肽链的不同区段的空间并列的氨基酸产生构象抗原决定基。线性抗原决定基是由多肽链中的相邻氨基酸残基产生的抗原决定基。在某些情况下，抗原决定基可以包含抗原上的糖、磷酰基或磺酰基的部分。
当提及核酸或其片段时，术语“基本同一性”或“基本相同”表示当通过适当的核苷酸插入或缺失与另一种核酸(或其互补链)最佳对齐时，如通过如fasta、blast或gap等任何众所周知的序列同一性算法所测量的为至少约95％，更优选地至少约96％、97％、98％或99％的核苷酸碱基的核苷酸序列同一性，如下所讨论的。在某些情况下，与参考核酸分子具有实质同一性的核酸分子可以编码具有与参考核酸分子编码的多肽相同或基本相似的氨基酸序列的多肽。
当应用于这些多肽时，术语“基本相似性”或“基本上相似”意指如通过程序gap或bestfit使用默认间隙权重最佳对齐时的两个肽序列在共享至少95％的序列同一性，甚至更优选地至少98％或99％的序列同一性。优选地，不相同的残基位置因保守性氨基酸置换而不同。“保守氨基酸取代”是一个氨基酸残基被具有化学特性(例如，电荷或疏水性)类似的侧链(r基团)的另一个氨基酸残基取代的氨基酸取代。总体而言，保守氨基酸取代不会实质上改变蛋白质的功能特性。在两个或更多个氨基酸序列因保守取代而彼此不同的情况下，序列一致性百分比或相似性程度可以向上调整以校正所述取代的保守性质。作出此调整的方法是本领域技术人员所熟知的。参见，例如，pearson，(1994)，通过引用并入本文的《分子生物学方法(methodsmol.biol.)，24:307-331。具有相似化学性质的侧链的氨基酸组的实例包含(1)脂肪族侧链：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；(2)脂肪族羟基侧链：丝氨酸与苏氨酸；(3)含酰胺的侧链：天冬酰胺和谷氨酰胺；(4)芳香族侧链：苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；(5)碱性侧链：赖氨酸、精氨酸和组氨酸；(6)酸性侧链：天冬氨酸和谷氨酸，以及(7)含硫侧链：半胱氨酸和蛋氨酸。优选的保守氨基酸取代基是：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、谷氨酸-天冬氨酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。可替代地，保守替代是在通过引用并入本文的gonnet等人，(1992)，《科学(science)》，256：1443-1445中公开的pam250对数似然矩阵中具有正值的任何变化。“适度保守”替代是pam250对数似然矩阵中具有非负值的任何变化。
通常使用序列分析软件测量也称为序列同一性的多肽的序列相似性。蛋白质分析软件使用分配给各种取代、缺失和其它修饰，包含保守氨基酸取代的相似性的测量来匹配相似的序列。举例来说，工具gcg含有如gap和bestfit等程序，所述程序可以在默认参数下使用以确定紧密相关的多肽之间，如来自不同生物体物种的同源多肽之间或野生型蛋白质与其突变蛋白之间的序列同源性或序列一致性。参见例如，6.1版gcg。还可以使用使用默认的或推荐的参数的fasta来比较多肽序列，所述fasta为6.1版gcg中的程序。fasta(例如，fasta2和fasta3)提供了询问序列与搜索序列之间的最佳重叠区域的对齐和序列一致性百分比(pearson(2000)，同上文)。当比较本发明的序列与含有大量来自不同生物体的序列的数据库时，另一个优选的算法是使用默认参数的计算机程序blast，尤其是blastp或tblastn。参见例如，各自通过引用并入本文的altschul等人，(1990)，《分子生物学杂志(j.mol.biol.)》，215:403-410以及altschul等人，(1997)，《核酸研究》，25:3389-402。
种系突变
如与衍生抗体的对应种系序列相比，本文公开的抗cd3抗体在重链可变域的框架和/或cdr区中包括一个或多个氨基酸取代、插入和/或缺失。
本发明还包含抗体及其抗原结合片段，其衍生自本文公开的任何氨基酸序列，其中一个或多个框架和/或cdr区内的一个或多个氨基酸突变为衍生抗体的一个或多个对应的残基、或突变为另一种人种系序列的一个或多个对应的残基、或突变为一个或多个对应的种系残基的保守氨基酸取代(此类序列变化在本文中统称为“种系突变”)，并且与cd3抗原具有弱结合或无可检测的结合。识别cd3的几种此类示例性抗体描述于本文的表12和表18中。
此外，本发明的抗体可以含有框架和/或cdr区内的两个或更多个种系突变的任何组合，例如，其中某些个体残基突变为特定种系序列的对应残基，而与原始种系序列不同的某些其它残基可以维持或突变为不同种系序列的对应残基。一旦获得，可以容易地测试含有一个或多个种系突变的抗体和抗原结合片段的一种或多种所期望的特性，如经改善的结合特异性、弱或降低的结合亲和力、经改善或增强的药代动力学性质、降低的免疫原性等。在给出本公开的指导下以这种通用方式获得的抗体和抗原结合片段涵盖在本发明内。
本发明还包含抗cd3抗体，其包括具有一个或多个保守取代的本文公开的任何hcvr、lcvr和/或cdr氨基酸序列的变体。例如，本发明包含具有hcvr、lcvr和/或cdr氨基酸序列的抗cd3抗体，相对于如本文的表1、表9、表11、表12、表15和表17所列出的任何hcvr、lcvr和/或cdr氨基酸序列，所述hcvr、lcvr和/或cdr氨基酸序列具有例如，10个或更少、8个或更少、6个或更少、4个或更少等的保守氨基酸取代。如与衍生单个抗原结合域的对应的种系序列相比，本发明的抗体和双特异性抗原结合分子在重链和轻链可变域的框架和/或cdr区中包括一个或多个氨基酸取代、插入和/或缺失，同时维持或改善所期望的与cd3抗原的弱到无可检测的结合。“保守氨基酸取代”是一个氨基酸残基被具有化学特性(例如，电荷或疏水性)类似的侧链(r基团)的另一个氨基酸残基取代的氨基酸取代。通常，保守氨基酸取代基本上不会改变蛋白质的功能特性，换句话说，在抗cd3结合分子的情况下，氨基酸取代维持或改善所期望的弱到无可检测的结合亲和力。具有相似化学性质的侧链的氨基酸组的实例包含(1)脂肪族侧链：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；(2)脂肪族羟基侧链：丝氨酸与苏氨酸；(3)含酰胺的侧链：天冬酰胺和谷氨酰胺；(4)芳香族侧链：苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；(5)碱性侧链：赖氨酸、精氨酸和组氨酸；(6)酸性侧链：天冬氨酸和谷氨酸，以及(7)含硫侧链：半胱氨酸和蛋氨酸。优选的保守氨基酸取代基是：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、谷氨酸-天冬氨酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。可替代地，保守替代是在gonnet等人，(1992)，《科学》，256：1443-1445中公开的pam250对数似然矩阵中具有正值的任何变化。“适度保守”替代是pam250对数似然矩阵中具有非负值的任何变化。
本发明还包含抗原结合分子，其包括具有与本文公开的任何hcvr和/或cdr氨基酸序列基本相同的hcvr和/或cdr氨基酸序列的抗原结合域，同时维持或改善所期望的与cd3抗原的弱亲和力。当提及氨基酸序列时，术语“基本同一性”或“基本上相同”是指当如通过使用默认空位权重的程序gap或bestfit最佳对齐时，两个氨基酸序列共享至少95％的序列同一性，甚至更优选地至少98％或99％的序列同一性。优选地，不相同的残基位置因保守性氨基酸置换而不同。在两个或更多个氨基酸序列因保守取代而彼此不同的情况下，序列一致性百分比或相似性程度可以向上调整以校正所述取代的保守性质。作出此调整的方法是本领域技术人员所熟知的。参见，例如，pearson，(1994)，《分子生物学方法》，24:307-331。
通常使用序列分析软件测量也称为序列同一性的多肽的序列相似性。蛋白质分析软件使用分配给各种取代、缺失和其它修饰，包含保守氨基酸取代的相似性的测量来匹配相似的序列。举例来说，工具gcg含有如gap和bestfit等程序，所述程序可以在默认参数下使用以确定紧密相关的多肽之间，如来自不同生物体物种的同源多肽之间或野生型蛋白质与其突变蛋白之间的序列同源性或序列一致性。参见例如，6.1版gcg。还可以使用使用默认的或推荐的参数的fasta来比较多肽序列，所述fasta为6.1版gcg中的程序。fasta(例如，fasta2和fasta3)提供了询问序列与搜索序列之间的最佳重叠区域的对齐和序列一致性百分比(pearson(2000)，同上文)。当比较本发明的序列与含有大量来自不同生物体的序列的数据库时，另一个优选的算法是使用默认参数的计算机程序blast，尤其是blastp或tblastn。参见例如，altschul等人，(1990)，《分子生物学杂志》，215:403-410以及altschul等人，(1997)，《核酸研究》，25:3389-402。
一旦获得，利用一种或多种体外测定测试含有一种或多种种系突变的抗原结合域的降低的结合亲和力。尽管通常通过测试对抗原的高(即强)结合亲和力来筛选识别特定抗原的抗体用于其目的，但本发明的抗体展现出弱结合或无可检测的结合。包括以此通用方式获得的一个或多个抗原结合域的双特异性抗原结合分子也涵盖在本发明内，并且被发现对亲合力驱动的肿瘤疗法是有利的。
可以由本文描述的方法实现意想不到的益处，例如，经改善的药代动力学性质和对患者的低毒性。
抗体的结合特性
如本文所使用的，在抗体、免疫球蛋白、抗体结合片段或含fc的蛋白质与例如，预定抗原，如细胞表面蛋白质或其片段的结合的背景下，术语“结合”通常是指最少两个实体或分子结构之间的相互作用或缔合，如抗体-抗原相互作用。
例如，当通过例如，表面等离子体共振(spr)技术在biacore3000仪器中使用抗原作为配体和抗体，ig、抗体结合片段或含fc的蛋白质作为分析物(或抗配体)进行测定时，结合亲和力通常与约10-7m或更低的kd值，如约10-8m或更低，如约10-9或更低相对应。还常规使用如荧光激活细胞分选(facs)结合测定等基于细胞的结合策略，并且facs数据与其它方法具有较强相关，如放射性配体竞争结合和spr(benedict,ca，《免疫方法期刊(jimmunolmethods)》，1997，201(2):223-31；geuijen,ca等人，《免疫方法期刊》，2005，302(1-2):68-77)。
因此，本发明的抗体或抗原结合蛋白结合到预定的抗原或细胞表面分子(受体)，所述抗原或细胞表面分子具有与kd值相对应的亲和力，所述亲和力比所述抗原或细胞表面分子结合到非特异性抗原(例如，bsa、酪蛋白)的亲和力低至少十倍。根据本发明，等于或小于非特异性抗原的十倍的与kd值相对应的抗体的亲和力可以被认为是不可检测的结合，但是这种抗体可以与第二抗原结合臂配对，用于产生本发明的双特异性抗体。
术语“kd”(m)是指特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数或抗体或抗体结合片段与抗原结合的解离平衡常数。kd与结合亲和力之间存在反比关系，因此kd值越小，亲和力越高，即越强。因此，术语“较高亲和力”或“较强亲和力”涉及较高的形成相互作用的能力并因此涉及较小的kd值，并且相反，术语“较低亲和力”或“较弱亲和力”涉及较低的形成相互作用的能力，并且因此kd值更大。在某些情况下，与分子(例如抗体)对另一个相互作用的配偶体分子(例如，抗原y)的结合亲和力相比，特定分子(例如，抗体)对与其相互作用的配偶体分子(例如，抗原x)更高的结合亲和力(或kd)可以表述为通过将较大的kd值(较低或较弱的亲和力)除以较小的kd(较高或较强的亲和力)，例如视情况可以表述为5倍或10倍大的结合亲和力而确定的结合比。
术语“kd”(秒-1或1/s)是指特定抗体-抗原相互作用的解离速率常数或抗体或抗体结合片段的解离速率常数。所述值也称为koff值。
术语“ka”(m-1×秒-1或1/m)是指特定抗体-抗原相互作用的缔合速率常数或抗体或抗体结合片段的缔合速率常数。
术语“ka”(m-1或1/m)是指特定抗体-抗原相互作用的缔合平衡常数或抗体或抗体结合片段的缔合平衡常数。通过将ka除以kd获得缔合平衡常数。
术语“ec50”或“ec50”是指半数最大有效浓度，其包含在指定的暴露时间后介于基线与最大值中间诱导响应的抗体的浓度。ec50基本上代表抗体的浓度，其中观察到其最大效应的50％。在某些实施例中，ec50值等于本发明的抗体的浓度，所述抗体如通过例如facs结合测定确定的与表达cd3或肿瘤相关抗原的细胞进行最大值半数的结合。因此，观察到降低的或较弱的结合，所述结合具有增大的ec50或最大有效浓度值的半数。
在一个实施例中，降低的结合可以定义为增大的ec50抗体浓度，其能够结合最大值半数的靶细胞。
在另一个实施例中，ec50值代表本发明抗体的浓度，所述抗体通过t细胞细胞毒活性引发最大值半数的靶细胞的耗竭。因此，观察到增大的细胞毒活性(例如t细胞介导的肿瘤细胞杀死)，其具有降低的ec50或最大值半数的有效浓度值。
双特异性抗原结合分子
本发明的抗体可以是单特异性的、双特异性的或多特异性的。多特异性抗体可以对一种靶多肽的不同抗原决定基具有特异性，或者可以含有对多于一种的靶多肽具有特异性的抗原结合域。参见例如，tutt等人，1991，《免疫学期刊(j.immunol.)》，147:60-69；kufer等人，2004，《生物科技趋势(trendsbiotechnol.)》，22:238-244。本发明的抗steap2单特异性抗体或抗steap2/抗cd3双特异性抗体可以与另一种功能分子，例如，另一种肽或蛋白质连结或共表达。例如，抗体或其片段可以与如另一种抗体或抗体片段等一种或多种其它分子实体功能性连结(例如，通过化学偶联、遗传融合、非共价缔合或以其它方式)，以产生具有第二种或另外一种结合特异性的双特异性或抗体片段。
本文使用表述“抗cd3抗体”或“抗steap2抗体”的旨在包含单特异性抗cd3或抗steap2抗体以及包括cd3结合臂和steap2结合臂的双特异性抗体。因此，本发明包含双特异性抗体，其中免疫球蛋白的一个臂结合人cd3，并且免疫球蛋白的另一个臂对人steap2具有特异性。cd3结合臂可以包括如本文的表1、表9、表11、表12、表15和表17中所列出的任何hcvr/lcvr或cdr氨基酸序列。
在某些实施例中，cd3结合臂结合到人cd3并诱导人t细胞活化。在某些实施例中，cd3结合臂弱结合到人cd3并诱导人t细胞活化。在其它实施例中，cd3结合臂弱结合到人cd3并在双特异性或多特异性抗体的背景下诱导肿瘤相关抗原表达细胞杀死。在其它实施例中，cd3结合臂与人和食蟹猴(猴)cd3结合或弱结合，但是结合相互作用无法通过本领域已知的体外测定检测到。steap2结合臂可以包括如本文的表1中所列出的任何hcvr/lcvr或cdr氨基酸序列。
根据某些示例性实施例，本发明包含特异性结合cd3和steap2的双特异性抗原结合分子。此类分子在本文中可称为例如，“抗cd3/抗steap2”或“抗cd3xsteap2”或“抗cd3xsteap2”双特异性分子或其它类似术语(例如，抗steap2/抗cd3)。
如本文所使用的，术语“steap2”是指人steap2蛋白，除非指定为来自非人物种(例如，“小鼠steap2”、“猴子steap2”等)。人steap2蛋白具有seqidno:1899所示的氨基酸序列。
特异性结合cd3和steap2的上述双特异性抗原结合分子可以包括抗cd3抗原结合分子，所述抗cd3抗原结合分子以弱结合亲和力，如展现出如通过体外亲和力结合测定所测量的大于约40nm的kd结合到cd3。在一些情况下，cd3结合臂以大于约100nm、大于约200nm、大于约300nm、大于约400nm、大于约500nm或大于约1μm的kd或ec50结合cd3(例如，如表面等离子体共振测定中的测量)。在一些情况下，第一抗原结合域特异性结合cd3(例如，具有弱或无可测量的亲和力的人cd3和食蟹猴cd3之一或两者)。
如本文所使用的，表述“抗原结合分子”意指包括至少一个互补决定区(cdr)或由其组成的蛋白质、多肽或分子复合物，所述互补单独地或与一个或多个另外的cdr和/或框架区(fr)组合地特异性结合到特定抗原。在某些实施例中，抗原结合分子是抗体或抗体的片段，如在本文其它地方定义的那些术语。
如本文所使用的，表述“双特异性抗原结合分子”意指包括至少第一抗原结合域和第二抗原结合域的蛋白质、多肽或分子复合物。双特异性抗原结合分子内的每个抗原结合域包括至少一个cdr，所述cdr单独地或与一个或多个另外的cdr和/或fr组合地特异性结合到特定抗原。在本发明的背景下，第一抗原结合域特异性结合第一抗原(例如，cd3)，并且第二抗原结合域特异性结合第二不同抗原(例如，steap2)。
在本发明的某些示例性实施例中，双特异性抗原结合分子是双特异性抗体。双特异性抗体的每个抗原结合域包括重链可变域(hcvr)和轻链可变域(lcvr)。在包括第一抗原结合域和第二抗原结合域的双特异性抗原结合分子(例如，双特异性抗体)的背景下，第一抗原结合域的cdr可以用前缀“a1”表示，并且第二抗原结合域的cdr可以用前缀“a2”表示。因此，第一抗原结合域的cdr在本文中可以称为a1-hcdr1、a1-hcdr2和a1-hcdr3；并且第二抗原结合域的cdr在本文中可以称为a2-hcdr1、a2-hcdr2和a2-hcdr3。
第一抗原结合域和第二抗原结合域可以彼此直接或间接连接以形成本发明的双特异性抗原结合分子。可替代地，第一抗原结合域和第二抗原结合域可以各自连接到单独的多聚化结构域。一个多聚化结构域与另一个多聚化结构域的缔合促进了两个抗原结合域之间的缔合，从而形成双特异性抗原结合分子。如本文所使用的，“多聚化结构域”是具有与具有相同或相似结构或构成的第二多聚化结构域缔合的能力的任何大分子、蛋白质、多肽、肽或氨基酸。例如，多聚化结构域可以是包括免疫球蛋白ch3结构域的多肽。多聚化组分的非限制性实例是免疫球蛋白的fc部分(包括ch2-ch3结构域)，例如，选自同种型igg1、igg2、igg3和igg4的igg以及每个同种型组内的任何同种型的fc结构域。
本发明的双特异性抗原结合分子通常包括两个多聚化结构域，例如，两个fc结构域，其各自独立地是单独的抗体重链的一部分。第一多聚化结构域和第二多聚化结构域可以是如igg1/igg1、igg2/igg2、igg4/igg4等相同的igg同种型。可替代地，第一多聚化结构域和第二多聚化结构域可以是如igg1/igg2、igg1/igg4、igg2/igg4等不同的igg同种型。
在某些实施例中，多聚化结构域是fc片段或含有至少一个半胱氨酸残基的长度为1到约200个氨基酸的氨基酸序列。在其它实施例中，多聚化结构域是半胱氨酸残基或含短半胱氨酸的肽。其它多聚化结构域包含包括亮氨酸拉链、螺旋环基序或卷曲螺旋基序或由其组成的肽或多肽。
可以使用任何双特异性抗体形式或技术来制备本发明的双特异性抗原结合分子。例如，具有第一抗原结合特异性的抗体或其片段可以与如具有第二抗原结合特异性的另一种抗体或抗体片段等一种或多种其它分子实体功能性连结(例如，通过化学偶联、遗传融合、非共价缔合或以其它方式)，以产生双特异性抗原结合分子。可以在本发明的背景下使用的具体示例性双特异性形式包含但不限于以下：例如，基于scfv的或双抗体双特异性形式、igg-scfv融合、双可变域(dvd)-ig、四杂交瘤(quadroma)、结节入孔(knobs-into-holes)、普通轻链(例如，具有旋钮入孔的普通轻链等)、crossmab、crossfab，(seed)body、亮氨酸拉链、duobody、igg1/igg2、双作用fab(daf)-igg以及mab2双特异性形式(参见例如，klein等人，2012，mabs4:6，1-11，以及其中引用的参考文献，用于回顾前述格式)。
在本发明的双特异性抗原结合分子的背景下，如与天然存在形式的fc结构域相比，多聚化结构域，例如，fc结构域可以包括一个或多个氨基酸变化(例如，插入、缺失或取代)。例如，本发明包含双特异性抗原结合分子，其在fc结构域中包括一个或多个修饰，所述修饰带来在fc与fcrn之间具有修饰的结合相互作用(例如，增强或减弱)的修饰后的fc结构域。在一个实施例中，双特异性抗原结合分子包括在ch2区或ch3区中的修饰，其中所述修饰增加fc结构域在酸性环境中(例如，在ph范围为约5.5到约6.0的内体中)对fcrn的亲和力。此类fc修饰的非限制性实例包含，例如，第250位(例如，e或q)处的修饰；第250和428位(例如，l或f)处的修饰；第252(例如，l/y/f/w或t)、254(例如，s或t)和256(例如，s/r/q/e/d或t)位处的修饰；或在第428和/或433(例如，l/r/s/p/q或k)和/或434(例如，h/f或y)位处的修饰；或在第250和/或428位处的修饰；或在第307或308(例如，308f、v308f)和434位处的修饰。在一个实施例中，修饰包括428l(例如，m428l)和434s(例如，n434s)修饰；428l、259i(例如，v259i)和308f(例如，v308f)修饰；433k(例如，h433k)和434(例如，434y)修饰；252、254和256(例如，252y、254t和256e)修饰；250q和428l修饰(例如，t250q和m428l)；以及307和/或308修饰(例如，308f或308p)。
本发明还包含双特异性抗原结合分子，其包括第一ch3结构域和第二igch3结构域，其中第一ch3结构域和第二igch3结构域彼此相差至少一个氨基酸，并且其中如与缺乏氨基酸差异的双特异性抗体相比，至少一个氨基酸差异减少双特异性抗体与蛋白a的结合。在一个实施例中，第一igch3结构域结合蛋白a，并且第二igch3结构域含有降低或消除蛋白a结合的突变，如h95r修饰(通过imgt外显子编号；h435r，通过eu编号)。第二ch3可以进一步包括y96f修饰(通过imgt；y436f，通过eu)。参见例如，参见美国专利号8,586,713。可以在第二ch3内找到的进一步修改包括：在igg1抗体的情况下，d16e、l18m、n44s、k52n、v57m和v82i(通过imgt；d356e、l358m、n384s、k392n、v397m和v422i，通过eu)；在igg2抗体的情况下，n44s、k52n和v82i(imgt；n384s、k392n和v422i，通过eu)；以及在igg4抗体的情况下，q15r、n44s、k52n、v57m、r69k、e79q和v82i(通过imgt；q355r、n384s、k392n、v397m、r409k、e419q和v422i，通过eu)。
在某些实施例中，fc结构域可以是嵌合的，其组合衍生自多于一种的免疫球蛋白同种型的fc序列。例如，嵌合fc结构域可以包括衍生自人igg1ch2区、人igg2ch2区或人igg4ch2区的ch2序列的部分或全部以及衍生自人igg1、人igg2或人igg4的ch3序列的部分或全部。嵌合fc结构域还可以含有嵌合铰链区。例如，嵌合铰链可以包括衍生自人igg1铰链区、人igg2铰链区或人igg4铰链区的“上铰链”序列与衍生自人igg1铰链区、人igg2铰链区或人igg4铰链区的“下铰链”序列的组合。可以包含在本文所列出的任何抗原结合分子中的嵌合fc结构域的具体实例包括，从n-到c-末端：[igg4ch1]-[igg4上铰链]-[igg2下铰链]-[igg4ch2]-[igg4ch3]。可以包含在本文所列出的任何抗原结合分子中的嵌合fc结构域的另一种实例包括，从n-到c-末端：[igg1ch1]-[igg1上铰链]-[igg2下铰链]-[igg4ch2]-[igg1ch3]。可以包含在本发明的任何抗原结合分子中的嵌合fc结构域的这些和其它实例描述于整体并入本文的2014年8月28日公开的美国公布2014/0243504中。具有这些通用结构排列的嵌合fc结构域及其变体可以具有改变的fc受体结合，其反过来影响fc效应子功能。
在某些实施例中，本发明提供抗体重链，其中重链恒定区(ch区)包括与seqidno:1911、seqidno:1912、seqidno:1913、seqidno:1914、seqidno:1915、seqidno:1916、seqidno:1917、seqidno:1918、seqidno:1919或seqidno:1920中的任一个具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，重链恒定区(ch区)包括选自由以下组成的组的氨基酸序列：seqidno:1911、seqidno:1912、seqidno:1913、seqidno:1914、seqidno:1915、seqidno:1916、seqidno:1917、seqidno:1918、seqidno:1919以及seqidno:1920。
在其它实施例中，本发明提供抗体重链，其中fc结构域包括与seqidno:1921、seqidno:1922、seqidno:1923、seqidno:1924、seqidno:1925、seqidno:1926、seqidno:1927、seqidno:1928、seqidno:1929或seqidno:1930中的任一个具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，fc结构包括选自由以下组成的组的氨基酸序列：seqidno:1921、seqidno:1922、seqidno:1923、seqidno:1924、seqidno:1925、seqidno:1926、seqidno:1927、seqidno:1928、seqidn：1929以及seqidno:1930。
序列变体
如与衍生单个抗原结合域的相应种系序列相比，本发明的抗体和双特异性抗原结合分子可以在重链和轻链可变域的框架和/或cdr区中包括一个或多个氨基酸取代、插入和/或缺失。通过将本文公开的氨基酸序列与可以从例如，公共抗体序列数据库获得的种系序列进行比较，可以容易地确定这种突变。本发明的抗原结合分子可以包括衍生自本文公开的任何示例性氨基酸序列的抗原结合域，其中一个或多个框架和/或cdr区内的一个或多个氨基酸突变为衍生抗体的一个或多个对应的残基、或突变为另一种人种系序列的一个或多个对应的残基、或突变为一个或多个对应的种系残基的保守氨基酸取代(此类序列变化在本文中统称为“种系突变”)。从本文公开的重链和轻链可变区序列开始，本领域普通技术人员可以容易地生产包括一个或多个个体种系突变或其组合的许多抗体和抗原结合片段。在某些实施例中，vh结构域和/或vl结构域内的框架和/或cdr残基的全部突变回在最初衍生抗原结合域的原始种系序列中所发现的残基。在其它实施例中，仅将某些残基突变回原始种系序列，例如，仅在fr1的前8个氨基酸内或在fr4的最后8个氨基酸内所发现的突变后的残基，或仅在cdr1、cdr2或cdr3中发现的突变后的残基。在其它实施例中，框架中和/或一个或多个cdr残基的一个或多个突变为不同种系序列(即，与最初衍生抗原结合域的种系序列不同的种系序列)的一个或多个对应的残基。此外，本发明的抗原结合域可以含有框架和/或cdr区内的两个或更多个种系突变的任何组合，例如，其中某些个体残基突变为特定种系序列的对应残基，而与原始种系序列不同的某些其它残基可以维持或突变为不同种系序列的对应残基。一旦获得，可以容易地测试含有一个或多个种系突变的抗原结合域的一种或多种所期望的特性，如经改善的结合特异性、增加的结合亲和力、经改善或增强的拮抗或激动的生物学特性(视情况而定)、降低的免疫原性等。包括以这种通用方式获得的抗原结合域的双特异性抗原结合分子涵盖在本发明内。
本发明还包含抗原结合分子，其中抗原结合域中的一个或两个包括具有一个或多个保守取代的本文公开的任何hcvr、lcvr和/或cdr氨基酸序列的变体。例如，本发明包含抗原结合分子，其包括具有hcvr、lcvr和/或cdr氨基酸序列的抗原结合域，相对于本文公开的任何hcvr、lcvr和/或cdr氨基酸序列，所述hcvr、lcvr和/或cdr氨基酸序列具有例如，10个或更少、8个或更少、6个或更少、4个或更少等的保守氨基酸取代。“保守氨基酸取代”是一个氨基酸残基被具有化学特性(例如，电荷或疏水性)类似的侧链(r基团)的另一个氨基酸残基取代的氨基酸取代。总体而言，保守氨基酸取代不会实质上改变蛋白质的功能特性。具有相似化学性质的侧链的氨基酸组的实例包含(1)脂肪族侧链：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；(2)脂肪族羟基侧链：丝氨酸与苏氨酸；(3)含酰胺的侧链：天冬酰胺和谷氨酰胺；(4)芳香族侧链：苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；(5)碱性侧链：赖氨酸、精氨酸和组氨酸；(6)酸性侧链：天冬氨酸和谷氨酸，以及(7)含硫侧链：半胱氨酸和蛋氨酸。优选的保守氨基酸取代基是：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、谷氨酸-天冬氨酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。可替代地，保守替代是在通过引用并入本文的gonnet等人，(1992)，《科学(science)》，256：1443-1445中公开的pam250对数似然矩阵中具有正值的任何变化。“适度保守”替代是pam250对数似然矩阵中具有非负值的任何变化。
本发明还包含抗原结合分子，其包括具有与本文公开的任何hcvr、lcvr和/或cdr氨基酸序列基本相同的hcvr、lcvr和/或cdr氨基酸序列的抗原结合域。当提及氨基酸序列时，术语“基本同一性”或“基本上相同”是指当如通过使用默认空位权重的程序gap或bestfit最佳对齐时，两个氨基酸序列共享至少95％的序列同一性，甚至更优选地至少98％或99％的序列同一性。优选地，不相同的残基位置因保守性氨基酸置换而不同。在两个或更多个氨基酸序列因保守取代而彼此不同的情况下，序列一致性百分比或相似性程度可以向上调整以校正所述取代的保守性质。作出此调整的方法是本领域技术人员所熟知的。参见，例如，pearson，(1994)，通过引用并入本文的《分子生物学方法》，24:307-331。
通常使用序列分析软件测量也称为序列同一性的多肽的序列相似性。蛋白质分析软件使用分配给各种取代、缺失和其它修饰，包含保守氨基酸取代的相似性的测量来匹配相似的序列。举例来说，工具gcg含有如gap和bestfit等程序，所述程序可以在默认参数下使用以确定紧密相关的多肽之间，如来自不同生物体物种的同源多肽之间或野生型蛋白质与其突变蛋白之间的序列同源性或序列一致性。参见例如，6.1版gcg。还可以使用使用默认的或推荐的参数的fasta来比较多肽序列，所述fasta为6.1版gcg中的程序。fasta(例如，fasta2和fasta3)提供了询问序列与搜索序列之间的最佳重叠区域的对齐和序列一致性百分比(pearson(2000)，同上文)。当比较本发明的序列与含有大量来自不同生物体的序列的数据库时，另一个优选的算法是使用默认参数的计算机程序blast，尤其是blastp或tblastn。参见例如，各自通过引用并入本文的altschul等人，(1990)，《分子生物学杂志》，215:403-410以及altschul等人，(1997)，《核酸研究》，25:3389-402。
ph依赖性结合
本发明包含具有ph依赖性结合特征的抗steap2抗体和抗cd3/抗steap2双特异性抗原结合分子。例如，如与中性ph相比，本发明的抗steap2抗体在酸性ph下可以展现出与steap2的结合降低。可替代地，如与中性ph相比，本发明的抗steap2抗体在酸性ph下可以展现出与steap2的结合增强。表述“酸性ph”包含小于约6.2的ph值，例如，约6.0、5.95、5.9、5.85、5.8、5.75、5.7、5.65、5.6、5.55、5.5、5.45、5.4、5.35、5.3、5.25、5.2、5.15、5.1、5.05、5.0或更小。如本文所使用的，表述“中性ph”意指ph为约7.0到约7.4。表述“中性ph”包含约7.0、7.05、7.1、7.15、7.2、7.25、7.3、7.35和7.4的ph值。
在某些情况下，“如与中性ph相比在酸性ph下的结合降低”是就在酸性ph下结合到抗原的抗体的kd值与在中性ph下结合到其抗原抗体的kd值的比率而言表述的(反之亦然)。例如，如果抗体或其抗原结合片段展现出约3.0或更大的酸性/中性kd比率，则为了本发明的目的可以认为抗体或其抗原结合片段展现出“如与中性ph相比在酸性ph下与steap2的结合降低”。在某些示例性实施例中，本发明的抗体或抗原结合片段的酸性/中性kd比率可以为约3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0、11.5、12.0、12.5、13.0、13.5、14.0、14.5、15.0、20.0、25.0、30.0、40.0、50.0、60.0、70.0、100.0或更大。
具有ph依赖性结合特征的抗体可以通过以下获得：例如，通过筛选如与中性ph相比在酸性ph下与特定抗原的结合降低(或增强)的抗体群。另外，氨基酸水平上的抗原结合域的修饰可以产生具有ph依赖性特征的抗体。例如，通过用组氨酸残基取代抗原结合域(例如，在cdr内)的一个或多个氨基酸，可以获得在相对于中性ph的酸性ph下与抗原的结合降低的抗体。
包括fc变体的抗体
根据本发明的某些实施例，提供了抗steap2抗体和抗cd3/抗steap2双特异性抗原结合分子，其包括fc结构域，所述fc结构域包括一个或多个增强或减少抗体与fcrn受体，例如，如与中性ph相比，在酸性ph下的结合的突变。例如，本发明包含在fc结构域的ch2区或ch3区中包括突变的抗体，其中一个或多个突变增加fc结构域在酸性环境中(例如，在ph范围为约5.5到约6.0的内体中)对fcrn的亲和力。当此类突变施用于动物时，其可以导致抗体的血清半衰期增加。此类fc修饰的非限制性实例包含，例如，第250位(例如，e或q)处的修饰；第250和428位(例如，l或f)处的修饰；第252(例如，l/y/f/w或t)、254(例如，s或t)和256(例如，s/r/q/e/d或t)位处的修饰；或在第428和/或433(例如，h/l/r/s/p/q或k)和/或434(例如，h/f或y)位处的修饰；或在第250和/或428位处的修饰；或在第307或308(例如，308f、v308f)和434位处的修饰。在一个实施例中，修饰包括428l(例如，m428l)和434s(例如，n434s)修饰；428l、259i(例如，v259i)和308f(例如，v308f)修饰；433k(例如，h433k)和434(例如，434y)修饰；252、254和256(例如，252y、254t和256e)修饰；250q和428l修饰(例如，t250q和m428l)；以及307和/或308修饰(例如，308f或308p)。
例如，本发明包含抗steap2抗体和抗cd3/抗steap2双特异性抗原结合分子，所述分子包括fc结构域，所述fc结构域选自由以下组成的组的一个或多个突变对或突变组：250q和248l(例如，t250q和m248l)；252y、254t和256e(例如，m252y、s254t和t256e)；428l和434s(例如，m428l和n434s)；以及433k和434f(例如，h433k和n434f)。前述fc结构域突变的所有可能的组合和本文公开的抗体可变域内的其它突变都在本发明的范围内。
抗体和双特异性抗原结合分子的生物学特性
本发明包含以高亲和力(例如，亚纳摩尔kd值)结合人steap2的抗体及其抗原结合片段。
本发明还包含抗cd3/抗steap2双特异性抗原结合分子，其抑制携带人前列腺癌异种移植物的免疫受损小鼠中的肿瘤生长。(参见例如，实例5)。
本发明包含以高亲和力结合人cd3的抗体及其抗原结合片段。本发明还包含以中等或低亲和力结合人cd3的抗体及其抗原结合片段，这取决于所期望的治疗背景和具体靶向性质。例如，在双特异性抗原结合分子，其中一个臂结合cd3而另一个臂结合靶抗原(例如，steap2)的背景下，可以期望靶抗原结合臂以高亲和力结合靶抗原高，而抗cd3臂仅以中等或低亲和力结合cd3。以这种方式，可以实现优先靶向抗原结合分子到表达靶抗原的细胞，同时避免一般/非靶向cd3结合以及随之产生的与之相关的不良副作用。
本发明包含能够同时结合到人cd3和人steap2的双特异性抗原结合分子(例如，双特异性抗体)。如在合适的体外结合测定中所测量的，与表达cd3的细胞相互作用的结合臂可具有弱到不可检测的结合。可以通过荧光激活细胞分选(facs)评估双特异性抗原结合分子结合表达cd3和/或steap2的细胞的程度。
本发明还包含抗体、抗原结合片段及其双特异性抗体，其以介于如使用实例2中所示的facs结合测定或基本上类似的测定所测定的介于约1nm与50nm之间的ec50值结合到steap2表达细胞和细胞系(例如，ca-2细胞)。在某些实施例中，抗体、抗原结合片段和双特异性抗体以以下ec50值结合steap2表达细胞和细胞系(例如ca-2细胞)：如使用实例2中所示的facs结合测定或基本上类似的测定所测定的50nm、约40nm、约30nm、约20nm、约小于15nm、约10nm、约5nm、约4nm、约3nm或约2nm、约1nm。
本发明包含抗体、抗原结合片段和其双特异性抗体，其以具有弱(即低)或甚至无可检测的亲和力结合人cd3。根据某些实施例，本发明包含抗体和抗体的抗原结合片段，其以如通过表面等离子体共振测量的大于约11nm的kd结合人cd3(例如，在37℃下)。在某些实施例中，本发明的抗体或抗原结合片段以以下kd或以无可检测的亲和力结合cd3：如通过表面等离子共振(例如，mab捕获或或抗原捕获形式)或基本相似的测定测量的大于约15nm、大于约20nm、大于约25nm、大于约30nm、大于约35nm、大于约40nm、大于约45nm、大于约50nm、大于约55nm、大于约60nm、大于约65nm、大于约70nm、大于约75nm、至少80nm、大于约90nm、大于约100nm、大于约110nm、至少120nm、大于约130nm、大于约140nm、大于约150nm、至少160nm、大于约170nm、大于约180nm、大于约190nm、大于约200nm、大于约250nm、大于约300nm、大于约400nm、大于约500nm或大于约1μm。
本发明包含抗体、抗原结合片段和其双特异性抗体，其以具有弱(即低)或甚至无可检测的亲和力结合猴(即食蟹猴)cd3。
本发明包含抗cd3/抗steap2双特异性抗原结合分子，其结合到通过如通过本文的实例3所定义的测定形式或基本上类似的测定所测量的表达人steap2的细胞(例如，ca-2细胞)，并通过其内化。本发明包含特异性结合到人steap2的抗cd3/抗steap2双特异性抗原结合分子。在某些实施例中，本发明的抗cd3/抗steap2双特异性抗原结合分子结合如通过本文的实例3所定义的测定形式或基本相似的测定所测量的在hek293细胞中瞬时表达的人steap-2。在某些实施例中，本发明的抗cd3/抗steap2双特异性抗原结合分子不结合如通过本文的实例3所定义的测定形式或基本相似的测定所测量的在hek293细胞中瞬时表达的人steap1、人steap2或人steap4。
本发明包含能够抑制c4-2肿瘤生长的抗cd3/抗steap2双特异性抗原结合分子(参见例如，实例5)。例如，根据某些实施例，提供了抗cd3/抗steap2双特异性抗原结合分子，其中例如，与施用同种型对照双特异性抗体的动物相比，如使用例如，如本文的实例5所示的标准卡尺测量方法在受试者中检测的，以约0.1mg/kg或约0.01mg/kg的剂量)进行的单次施用使肿瘤大小减小(如当在肿瘤移植后46天测量时)。
本发明还包含抗steap2抗体药物偶联物，其在体内steap2阳性前列腺癌异种移植模型中抑制肿瘤生长(参见例如，实例7，或在基本相似的测定中)。在某些实施例中，提供了与化合物7偶联的抗steap2抗体药物，其中在肿瘤移植后第13天施用的10mg/kg、20mg/kg或40mg/kg的一顿剂量抑制在体内steap2阳性前列腺癌异种移植模型中的c4-2肿瘤生长。在某些实施例中，提供了与化合物7偶联的抗steap2抗体药物，其中在移植后第14天施用的5mg/kg或20mg/kg的一顿剂量抑制在体内steap2阳性前列腺癌异种移植模型中的c4-2肿瘤生长。在某些实施例中，提供了与化合物7偶联的抗steap2抗体药物其中在移植后第17天施用的150μg/kg的一顿剂量抑制在体内steap2阳性前列腺癌异种移植模型中的c4-2肿瘤生长。在其它实施例中，提供了与化合物60偶联的抗steap2抗体药物，其中在移植后第29天施用的2.5mg/kg的一顿剂量抑制在体内steap2阳性前列腺癌异种移植模型中的c4-2肿瘤生长。
抗原决定基作图和相关技术
本发明的抗原结合分子所结合到的cd3和/或steap2上的抗原决定基可以由3个或更多个的单个连续序列组成(例如，3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多)cd3或steap2蛋白的氨基酸。或者，抗原决定基可以由cd3或steap2的多个非连续氨基酸(或氨基酸序列)组成。本发明的抗体可以与单个cd3链(例如，cd3-ε、cd3-δ或cd3-γ)中含有的氨基酸相互作用，或者可以与两个或更多个不同cd3链上的氨基酸相互作用。如本文所使用的，术语“抗原决定基”是指与称为互补位的抗体分子的可变区中的特定抗原结合位点相互作用的抗原决定簇。单个抗原可以具有多于一个抗原决定基。因此，不同的抗体可以结合抗原上的不同区域并且可以具有不同的生物效应。抗原决定基可以是构象的也可以是线性的。通过来自线性多肽链的不同区段的空间并列的氨基酸产生构象抗原决定基。线性抗原决定基是由多肽链中的相邻氨基酸残基产生的抗原决定基。在某些情况下，抗原决定基可以包含抗原上的糖、磷酰基或磺酰基的部分。
可以使用本领域普通技术人员已知的各种技术来确定抗体的抗原结合域是否在多肽或蛋白质内“与一个或多个氨基酸相互作用”。示例性技术包含例如，常规交叉阻断测定，如在《抗体(antibodies》，harlow和lane(冷泉港出版社，冷泉港实验室，纽约)中描述的方法、丙氨酸扫描突变分析、肽印迹分析(reineke，2004，《分子生物学方法，248:443-463)和肽切割分析。另外，可以采用如抗原决定基切除、抗原决定基提取及抗原的化学修饰等方法(tomer，2000，《蛋白质科学(proteinscience)》，9:487-496)。可以用于鉴定与抗体的抗原结合域相互作用的多肽内的氨基酸的另一种方法是通过质谱法检测的氢/氘交换。一般而言，氢/氘交换方法涉及对感兴趣的蛋白质进行氘标记，然后将抗体与氘标记的蛋白质结合。接下来，将蛋白质/抗体复合物转移到水中以允许在除抗体保护的残基(其保持为氘标记的)之外的所有残基处发生氢-氘交换。在解离抗体后，使靶蛋白经历蛋白酶切割和质谱分析，从而揭示与抗体与之相互作用的特定氨基酸相对应的经氘标记的残基。参见例如，ehring，(1999)，《分析生物化学(analyticalbiochemistry)》，267(2):252-259；engen和smith，(2001)，《分析化学(anal.chem.)》，73:256a-265a。抗原/抗体复合物的x射线晶体学还可以用于抗原决定基作图。
本发明进一步包含抗steap2抗体，其与本文所述的任何特定示例性抗体(例如，包括本文的表1中所列出的任何氨基酸序列的抗体)结合同一抗原决定基。同样地，本发明还包含抗steap2抗体，其与本文所述的任何特定示例性抗体(例如，包括本文的表1中所列出的任何氨基酸序列的抗体)竞争结合到steap2。
本发明还包含双特异性抗原结合分子，其包括以低或可检测结合亲和力特异性结合人cd3和/或食蟹猴cd3的第一抗原结合域和特异性结合人steap2的第二抗原结合域，其中第一抗原结合域与本文所描述的任何特定示例性cd3特异性抗原结合域结合cd3上的同一抗原决定基，和/或其中第二抗原结合域与steap2上的相同抗原决定基结合，如本文所描述的任何特定示例性steap2特异性抗原结合域。
同样地，本发明还包含双特异性抗原结合分子，其包括特异性结合人cd3的第一抗原结合域和特异性结合人steap2的第二抗原结合域，其中第一抗原结合域与本文所描述的任何特定示例性cd3特异性抗原结合域竞争结合到cd3，和/或其中第二抗原结合域与本文所描述的任何特定示例性steap2特异性抗原结合域竞争结合到steap2。
通过使用本领域中已知的常规方法，可以容易地确定特定的抗原结合分子(例如，抗体)或其抗原结合域是否与本发明的参考抗原结合分子结合到同一抗原决定基或与其竞争结合。例如，为了确定测试抗体是否与本发明的参考双特异性抗原结合分子结合到的steap2(或cd3)上的同一抗原决定基，首先允许参考双特异性分子结合到steap2蛋白(或cd3蛋白)。接下来，评估测试抗体结合到steap2(或cd3)分子的能力。如果测试抗体在与参考双特异性抗原结合分子饱和结合后能够与steap2(或cd3)结合，则可以得出结论，测试抗体与参考双特异性抗原结合到steap2(或cd3)的不同抗原决定基。另一方面，如果测试抗体在与参考双特异性抗原结合分子饱和结合后无法与steap2(或cd3)分子结合，那么测试抗体可能结合到steap2(或cd3)的与本发明的参考双特异性抗原结合分子结合的抗原决定基相同的抗原决定基。然后可以进行另外的常规实验(例如，肽突变和结合分析)以确认所观察到的测试抗体的结合缺乏是否实际上是由于结合到与参考双特异性抗原结合分子相同的抗原决定基或者空间阻断(或其它现象)是否导致所观察到的结合缺乏。可以使用elisa、ria、biacore、流式细胞术或本领域可获得的任何其它定量或定性抗体结合测定来进行这种实验。根据本发明的某些实施例，如果例如，一个抗原结合蛋白质的1倍、5倍、10倍、20倍或100倍过量抑制另一种蛋白质(如在竞争性结合法中所测量的)至少50％，但优选75％、90％或甚至99％的结合，则两个抗原结合蛋白结合到同一(或重叠)抗原决定基(参见例如，junghans等人，《癌症研究(cancerres.)，1990:50:1495-1502)。可替代地，如果抗原中基本上所有减少或消除一种抗原结合蛋白的结合的氨基酸突变减少或消除另一种抗原结合，则认为两种抗原结合蛋白结合到同一抗原决定基。如果仅减少或消除一种抗原结合蛋白的结合的氨基酸突变的子集减少或消除另一种抗原的结合，则认为两种抗原结合蛋白具有“重叠抗原决定基”。
为确定抗体或其抗原结合域是否竞争结合到参考抗原结合分子，上述结合方法以两种定向进行：在第一种定向中，使参考抗原结合分子在饱和条件下结合到steap2蛋白(或cd3蛋白)，然后评估测试抗体与steap2(或cd3)分子的结合。在第二种定向中，使测试抗体在饱和条件下结合到steap2(或cd3)分子，然后评估参考抗原结合分子与steap2(或cd3)分子的结合。如果在两种定向上只有第一个(饱和的)抗原结合分子能够结合到steap2(或cd3)分子，那么可以得出结论，测试抗体和参考抗原结合分子竞争结合到steap2(或cd3)。如本领域普通技术人员所理解的，与参考抗原结合分子竞争结合的抗体可能不一定与参考抗体结合到同一抗原决定基，但是可以通过结合重叠或相邻抗原决定基来空间阻断参考抗体的结合。
抗原结合域的制备及双特异性分子的构建
对特异性抗原特异的抗原结合域可以通过本领域已知的任何抗体产生技术制备。一旦获得，对两种不同抗原(例如，cd3和steap2)特异的两种不同的抗原结合域可以相对于彼此适当地排列，以使用常规方法产生本发明的双特异性抗原结合分子。本文其它地方提供了可以用于构建本发明的双特异性抗原结合分子的示例性双特异性抗体形式的讨论)。在某些实施例中，本发明的多特异性抗原结合分子的一种或多种个体组分(例如，重链和轻链)衍生自嵌合抗体、人源化抗体或完全人抗体。制备此类抗体的方法是本领域熟知的。例如，可以使用velocimmunetm技术制备本发明的双特异性抗原结合分子的一条或多条重链和/或轻链。使用velocimmunetm技术(或任何它他人抗体产生技术)，将高亲和力嵌合抗体最初分离为具有人可变区和小鼠恒定区的特定抗原(例如cd3或steap2)。对抗体进行表征和选择以获得包含亲和力、选择性、抗原决定基等的所期望的特性。用所期望的人恒定区替代换小鼠恒定区以产生可以掺入本发明的双特异性抗原结合分子中的完全人重链和/或轻链。
基因工程动物可以用于制备人双特异性抗原结合分子。例如，可以使用无法重排和表达内源性小鼠免疫球蛋白轻链可变序列的经遗传修饰的小鼠，其中小鼠仅表达由人免疫球蛋白序列编码的一个或两个人轻链可变域，所述人免疫球蛋白序列与内源小鼠κ基因座处的小鼠κ恒定基因可操作地连结。这种经遗传修饰的小鼠可以用于产生包括两条不同的重链的完全人双特异性抗原结合分子，所述重链与包括衍生自两个不同人轻链可变区基因区段中的一个的可变域的相同轻链缔合。(参见例如，us2011/0195454)。完全人是指包括由dna编码的氨基酸序列的抗体或其抗原结合片段或免疫球蛋白结构域，所述dna衍生自在抗体或其抗原结合片段或免疫球蛋白结构域的每个多肽的整个长度内的人序列。在一些情况下，完全人序列衍生自人内源性蛋白质。在其它情况下，完全人蛋白质或蛋白质序列包括嵌合序列，其中每个组分序列衍生自人序列。虽然不受任何一种理论的束缚，但例如，与任何野生型人免疫球蛋白区域或结构域相比，通常设计嵌合蛋白或嵌合序列以使组分序列的连接处的免疫原性抗原决定基的产生最小化。
生物等效物
本发明涵盖具有不同于本文公开的示例性分子的氨基酸序列但保留结合cd3和/或steap2的能力的抗原结合分子。当与亲本序列比较时，此类变体分子可以包括氨基酸的一个或多个添加、缺失或取代，但展现出与所述双特异性抗原结合分子的生物活性基本相同的生物活性。
本发明包含与本文所列出的任何示例性抗原结合分子生物等效的抗原结合分子。如果例如，两种抗原结合蛋白或抗体是吸收速率和吸收程度在相似的实验条件下以相同的摩尔剂量施用(单次剂量或多次剂量)时不显示显著差异的药物等效物或药物替代物，则其被认为是生物等效的。如果一些抗原结合蛋白在吸收程度上等效但其吸收速率不等效，则其被认为是等效物或药物替代物，并且可以被认为是生物等效的，因为这种有意的并且反映在标签上的吸收速率的差异在例如，长期使用时对于获得有效的身体药物浓度并非必需的，并且对于所研究的特定药物产品而言被认为是医学上无关紧要的。
在一个实施例中，如果两种抗原结合蛋白的安全性、纯度和效力没有临床上有意义的差异，则其是生物等效的。
在一个实施例中，如与没有这种转换的持续治疗相比，如果患者可以在参考产品和生物产品之间转换一次或多次而没有预期的不良反应风险增加，包含免疫原性的临床显著变化或有效性降低，则两种抗原结合蛋白是生物等效的。
在一个实施中，如果两种抗原结合蛋白均通过用于所述病症或使用条件的共同机制或作用机制起作用(只要这些机制是已知的)，则其是生物等效的。
生物等效性可以通过体内和体外方法证明。生物等效性测量包括，例如，(a)在人或其它哺乳动物中的体内试验，其中在血液、血浆、血清或其它生物流体中测量抗体或其代谢物的浓度随时间的变化；(b)与人体内生物利用度数据相关并且可合理预测的体外试验；(c)在人或其它哺乳动物中的体内试验，其中测量抗体(或其靶标)的适当急性药理作用随时间的变化；以及(d)在建立抗原结合蛋白的安全性、疗效或生物利用度或生物等效性的好对照的临床试验中。
本文所列出的示例性双特异性抗原结合分子的生物等效变体可以通过例如，进行残基或序列的各种取代或缺失非生物活性所必需的末端或内部残基或序列来构建。例如，可以缺失非生物活性所必需的半胱氨酸残基或用其它氨基酸替代，以防止在复性时形成不必要的或不正确的分子内二硫键。在其它情况下，生物等效抗原结合蛋白可以包含本文所列出的示例性双特异性抗原结合分子的变体，所述变体包括改变分子的糖基化特性的氨基酸变化，例如，消除或去除糖基化的突变。
物种选择性和物种交叉反应性
根据本发明的某些实施例，提供了结合到人cd3但不结合到来自其它物种的cd3的抗原结合分子。还提供了结合到人steap2但不结合来自其它物种的steap2的抗原结合分子。本发明还包含结合到人cd3并且结合到来自一种或多种非人物种的cd3的抗原结合分子；和/或结合到人steap2并且结合到来自一种或多种非人物种的steap2的抗原结合分子。
根据本发明的某些示例性实施例，提供了抗原结合分子，其结合到人cd3和/或人steap2，并且视情况可以结合到小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、沙鼠、猪、猫、狗、兔子、山羊、绵羊、牛、马、骆驼、食蟹猴、狨猴、恒河猴或黑猩猩cd3和/或steap2中的一种或多种或不与其结合。例如，在本发明的一个具体的示例性实施例中，提供了双特异性抗原结合分子，其包括结合人cd3和食蟹猴cd3的第一抗原结合域以及特异性结合人steap2的第二抗原结合域。
抗体-药物偶联物(adc)
本发明提供抗体-药物偶联物(adc)，其包括与如细胞毒性剂、化学治疗药、免疫抑制剂或放射性同位素等治疗部分偶联的抗steap2抗体或其抗原结合片段。一般而言，adc包括：a–[l–p]y，其中a是抗原结合分子，例如，抗steap2抗体或其片段(例如，包括至少选自表1中所列出的任何hcdr3氨基酸序列的hcdr3的片段)，l是连接子，p是有效载荷或治疗部分(例如，细胞毒性剂)，并且y是1到30的整数。在各种实施例中，adc包括抗steap2抗体或其抗原结合片段，其包括hcvr和lcvr的cdr，所述hcvr和lcvr具有如表1中所列出的seqidno(例如，seqidno:2和10)的氨基酸序列或特定的hcvr/lcvr对(例如，seqidno:2/10)。在一些情况下，抗steap2抗体或片段包括具有如表1中所列出的seqidno(例如，seqidno:4-6-8-12-14-16)的氨基酸序列的cdr。在一些情况下，抗steap2抗体或片段包括hcvr和lcvr，所述hcvr和lcvr具有如表1中所列出的seqidno(例如，seqidno:2和10)的氨基酸序列或特定的氨基酸序列对(例如，seqidno:2/10)。
细胞毒性剂包含对细胞的生长、活力或繁殖有害的任何试剂。本发明的抗原结合分子或抗体将这些细胞毒性剂(本文称为“有效载荷”)递送到靶细胞。用于形成adc的合适细胞毒性剂和化学治疗剂的实例是本领域已知的。
根据本发明的此方面可以与抗steap2抗体偶联的合适细胞毒性剂和化学治疗剂的实例包含以下：例如，1-(2-氯乙基)-1,2-二甲磺酰肼、1,8-二羟基-双环[7.3.1]十三碳-4,9-二烯-2,6-二炔-13-酮、1-脱氢睾酮、5-氟尿嘧啶、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、9-氨基喜树碱、放线菌素d、鹅膏蕈碱、氨喋呤、蛇形菌素、蒽环霉素、氨茴霉素(amc)、奥瑞斯他汀(一甲基奥瑞斯他汀e或一甲基奥瑞斯他汀f)、博莱霉素、白消安、丁酸、卡里奇霉素、喜树碱、洋红霉素、卡莫司汀、西马多丁、顺铂、秋水仙素、康普瑞汀、环磷酰胺、阿糖孢苷、细胞松弛素b、更生霉素、道诺霉素、鸨烯咪胺、二乙酰氧基戊基多柔比星、二溴甘露醇、二羟基炭疽菌二酮、双萨拉唑、尾海兔素、阿霉素、多卡米新、棘霉素、五加素、吐根碱、埃博霉素、埃斯佩拉霉素、雌氮芥、溴化乙锭、依托泊苷、氟二氧嘧啶、格尔德霉素、短杆菌肽d、糖皮质激素、伊立替康、轻肌蛋白、环氧长春碱、利多卡因、环己亚硝脲(ccnu)、美登木素生物碱、二氯甲基二乙胺、美法仑、疏基噪呤、甲噪呤、甲氨蝶呤、光神霉素、丝裂霉素、米托蒽醌、n8乙酰亚精胺、鬼臼毒素、普鲁卡因、普萘洛尔、蝶啶、嘌呤霉素、根霉素、链脲霉素、他利霉素、紫杉酚、替尼泊苷、丁卡因、噻替派苯丁酸氮芥、茅屋霉素、拓扑替康、土布力辛、长春花碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨以及任何前述的衍生物。
根据某些实施例，与抗steap2抗体偶联的细胞毒性剂是如单甲基奥瑞斯他汀e(mmae)或单甲基奥瑞斯他汀f(mmaf)等奥瑞斯他汀、如tub-oh或tub-omom等土布力辛、茅屋霉素衍生物，尾海兔素衍生物或如dm1或dm4等美登木素生物碱。在一些实施例中，细胞毒性剂是具有式(i)的结构的美登木素生物碱，其包含式(i)的化合物的立体异构体：
其中a是亚芳基或亚杂芳基。
在一些实施例中，a是苯、吡啶、萘或喹诺酮的二价基团，其任选被取代。
在一些实施例中，a是亚芳基。
在一些实施例中，a是：
其中：
r1在每次出现时独立地为烷基、烯基、炔基、芳基、烷芳基、芳烷基、卤素、杂芳基、杂环烷基、羟基、氰基、硝基
wherein其中ra是烷基或杂烷基；
n是0到4的整数；
m是0到3的整数；
p是0到6的整数；并且
q是0到5的整数。
在一些实施例中，式i的化合物选自由以下组成的组：
在一个实施例中，式(i)的化合物为：
在一些实施例中，式(i)的美登木素生物碱通过连接子与抗steap2抗体或其抗原结合片段偶联，如下式(ia)所示：
其中：
a是亚芳基或亚杂芳基，如上面结合式(i)所讨论的；
l是连接子；
ba是抗steap2抗体或其抗原结合片段；并且
k是1到30的整数。
在各种实施例中，l是：
其中：
sp是间隔物；
aa1是氨基酸；并且
aa2是氨基酸。
在一些实施例中，aa1-aa2是：缬氨酸-瓜氨酸、瓜氨酸-缬氨酸、赖氨酸-苯丙氨酸、苯丙氨酸-赖氨酸、缬氨酸-天冬酰胺、天冬酰胺-缬氨酸、苏氨酸-天冬酰胺、天冬酰胺-苏氨酸、丝氨酸-天冬酰胺、天冬酰胺-丝氨酸、苯丙氨酸-天冬酰胺、天冬酰胺-苯丙氨酸、亮氨酸-天冬酰胺、天冬酰胺-亮氨酸、异亮氨酸-天冬酰胺、天冬酰胺-异亮氨酸、甘氨酸-天冬酰胺、天冬酰胺-甘氨酸、谷氨酸-天冬酰胺、天冬酰胺-谷氨酸、瓜氨酸-天冬酰胺、天冬酰胺-瓜氨酸、丙氨酸-天冬酰胺或天冬酰胺-丙氨酸。
在一些实施例中，sp是：
其中：
b是2到8的整数。
在其它实施例中，l是：
其中：
b是2到8的整数。
在一个实施例中，与抗steap2抗体或其抗原结合片段结合的包含连接子的式(ia)的化合物是：
其中
在一个实施例中，与抗steap2抗体或其抗原结合片段结合的包含连接子的式(ia)的化合物是：
其中
在一些实施例中，细胞毒性剂是具有式(ii)的结构的美登木素生物碱，其包含式(ii)的化合物的立体异构体：
其中：
a3a是氨基酸、具有2到20个氨基酸的肽、烷基、炔基、链烯基、环烷基、芳基、杂芳基、杂环基、-cr5r6-、-o-、-c(＝o)-、
-o-c(＝o)-、-c(＝o)-o-、-o-c(＝o)-o-、-c(＝o)-(chx)p1-、-c(＝o)-o-(chx)p1-、
-(chx)p1-c(＝o)-、-(chx)p1-c(＝o)-o-、-(o-(ch2)p2-)p3-、-((ch2)p2-o-)p3-、-c(＝s)-、
-c(＝s)-s-、-c(＝s)-nh-、-s-c(＝s)-、-s-c(＝s)-s-、-s-、-so-、-so2-、
-nr4-、-n(r4)-c(＝o)-n(r8)-、-n(r4)-c(＝o)o-、-n(r4)-c(＝o)-、-c(＝o)-n(r4)-、
-c(＝o)-n(r4)-c(＝o)-或-o-c(＝o)-nr4-，其中烷基、炔基、烯基、环烷基、芳基、杂芳基和杂环基任选地被取代；并且
p1、p2和p3各自独立地是0或1到100的整数；
x是0、1或2；
r4、r5、r6和r8各自独立地是h或被取代的或未被取代的烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基或杂环基；并且
r4a是被取代的或未被取代的烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基或杂环基。
在一些实施例中，式(ii)的化合物选自由以下组成的组：
在一个实施例中，式(ii)的化合物为：
在一些实施例中，式(ii)的美登木素生物碱通过连接子与抗steap2抗体或其抗原结合片段偶联，如下式(iia)所示：
其中：
ba是抗steap2抗体或其抗原结合片段；
a是1到30的整数；
z2由以下结构式表示：–z2a-z2b-z2c-z2d，其中z2a、z2b、z2c和z2d各自独立地是氨基酸、具有2到20个氨基酸的肽、烷基、炔基、链烯基、环烷基、芳基、杂芳基、杂环基、-cr5r6-、-o-、-c(＝o)-、-o-c(＝o)-、-c(＝o)-o-、-o-c(＝o)-o-、
-c(＝o)-(chx)p1、-c(＝o)-o-(chx)p1、-(chx)p1-c(＝o)-、-(chx)p1-c(＝o)-o-、-(o-(ch2)p2-)p3-、-((ch2)p2-o-)p3-、-c(＝s)-、-c(＝s)-s-、-c(＝s)-nh-、-s-c(＝s)-、-s-c(＝s)-s-、-s-、-so-、
-so2-、-nr4-、-n(r4)-c(＝o)-n(r8)-、-n(r4)-c(＝o)o-、-n(r4)-c(＝o)-、-c(＝o)-n(r4)-、
-c(＝o)-n(r4)-c(＝o)-、-o-c(＝o)-n(r4)、-o-c(＝s)-n(r4)-、-c(＝s)-n(r4)-、-n＝c＝s、
-n＝c＝o、
a是天然或非天然氨基酸或包括2到20个氨基酸的肽；
w是-o-、-s-、-cr5r6-或-nr4-；
x是芳基、杂芳基、环烷基或杂环基，其中芳基、杂芳基、环烷基和杂环基是任选地被取代的；
其中a1、a3和r1各自独立地为氨基酸、具有2到20个氨基酸的肽、烷基、炔基、链烯基、环烷基、芳基、杂芳基、杂环基、-cr5r6-、-o-、-c(＝o)-、-o-c(＝o)-、-c(＝o)-o-、-o-c(＝o)-o-、
-c(＝o)-(chx)p1-、-c(＝o)-o-(chx)p1-、-(chx)p1-c(＝o)-、-(chx)p1-c(＝o)-o-、
-(o-(ch2)p2-)p3-、-((ch2)p2-o-)p3-、-c(＝s)-、-c(＝s)-s-、-s-c(＝s)-、-c(＝s)-nh-、
-s-c(＝s)-s-、-s-、-so-、-so2-、-nr4-、-n(r4)-c(＝o)-n(r8)-、-n(r4)-c(＝o)o-、
-n(r4)-c(＝o)-、-c(＝o)-n(r4)-、-c(＝o)-n(r4)-c(＝o)-或-o-c(＝o)-nr4-，其中烷基、炔基、烯基、环烷基、芳基、杂芳基和杂环基是任选地被取代的；
r17选自由o、s、nr18和cr5r6组成的组；
r18选自由h、烷基、炔基、烯基、环烷基、芳基、杂芳基、杂环基和酰基组成的组，其中烷基、炔基、烯基、环烷基、芳基、杂芳基、杂环基和酰基是任选地被取代的；
r4、r5、r6和r8各自独立地是h或被取代的或未被取代的烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基或杂环基；
r4a是被取代的或未被取代的烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基或杂环基；
p1、p2和p3各自独立地是0或1到100的整数；并且
x是0、1或2。
在式(iia)的一些实施例中，a是选自由以下组成的组的肽：肽缬氨酸-瓜氨酸、瓜氨酸-缬氨酸、赖氨酸-苯丙氨酸、苯丙氨酸-赖氨酸、缬氨酸-天冬酰胺、天冬酰胺-缬氨酸、苏氨酸-天冬酰胺、天冬酰胺-苏氨酸、丝氨酸-天冬酰胺、天冬酰胺-丝氨酸、苯丙氨酸-天冬酰胺、天冬酰胺-苯丙氨酸、亮氨酸-天冬酰胺、天冬酰胺-亮氨酸、异亮氨酸-天冬酰胺、天冬酰胺-异亮氨酸、甘氨酸-天冬酰胺、天冬酰胺-甘氨酸、谷氨酸-天冬酰胺、天冬酰胺-谷氨酸、瓜氨酸-天冬酰胺、天冬酰胺-瓜氨酸、丙氨酸-天冬酰胺和天冬酰胺-丙氨酸。
在一个实施例中，与抗steap2抗体或其抗原结合片段结合的式(iia)的化合物是：
其中
在一些实施例中，与抗steap2抗体或其片段偶联的细胞毒性剂是dm1的纯的或基本上纯的非对映异构体：
并且y是1到0的整数。
在另一个实施例中，adc包括“a–[l–p]y”结构，其中a是抗steap2抗体或其抗原结合片段，并且[l-p]是：
其混合物，并且
其中y是1到30的整数，并且
其它美登木素生物碱衍生物在wo2014/145090、wo2016/160615和wo2015/031396中讨论，其各自通过引用整体并入本文。
在一些实施例中，与抗steap2抗体或其片段偶联的细胞毒性剂是mmae或mmaf。
本领域已知的其它细胞毒性剂也被认为在本发明的范围内，包含例如，蛋白质毒素，如蓖麻毒素，艰难梭菌毒素、假单胞菌外毒素、白喉毒素、肉毒杆菌毒素、异株泻根毒蛋白、皂草素，商陆毒素(即，商陆毒素和商陆皂甙)，以及其它如sapra等人，《药理学与治疗学(pharmacol.&therapeutics)》，2013，138:452-469中所示出的。
细胞毒性剂(“有效载荷”)可以通过将有效载荷化合物与蛋白质分子(即抗体)共价结合的化学连接子与本发明的抗steap2抗原结合分子或抗体连接。以上讨论了特定连接子的示例性实施例。更普遍地，并且如本文所使用的，术语“连接子”是指将结合剂(例如，抗体或其抗原结合片段)与本文所述的有效载荷化合物连结、连接或结合的任何二价基团或部分。通常，本文所描述的抗体偶联物的合适的结合剂连接子是稳定性足够利用抗体的循环半衰期并且同时能够在抗体介导的偶联物内化后释放其有效载荷的那些。连接子可以是可切割的或不可切割的。可切割连接子是内化后被细胞内代谢切割的连接子，例如，通过水解、还原或酶促反应切割。不可切割的连接子是通过内化后的抗体的溶酶体降解释放附接的有效载荷的连接子。合适的连接子包含但不限于酸不稳定连接子、水解不稳定连接子、酶促可切割连接子、还原不稳定连接子、自我牺牲连接子以及不可切割连接子。合适的连接子还包含但不限于为或包括以下的那些：肽、葡糖苷酸、琥珀酰亚胺-硫醚、聚乙二醇(peg)单元、腙、马来酰亚胺己酰单元、二肽单元、缬氨酸-瓜氨酸单元和对氨基苄基(pab)。在一些情况下，连接子能够通过赖氨酸残基或半胱氨酸残基结合到抗体或抗原结合片段(例如，通过抗体或片段的二硫化物基团的切割或通过工程化为抗体或片段的半胱氨酸残基)。在一些情况下，连接子能够通过谷氨酰胺残基结合到抗体或片段，所述残基包含通过转谷氨酰胺酶介导的偶联衍生的那些。
可以用于本发明的背景的示例性连接子包括包含或由以下组成的连接子：例如，mc(6-马来酰亚胺基己酰基)、mcc(马来酰亚胺甲基环己烷-1-羧酸酯)、mp(马来酰亚胺丙酰基)、val-cit(缬氨酸-瓜氨酸)、val-ala(缬氨酸-丙氨酸)、ala-phe(丙氨酸-苯丙氨酸)、phe-lys(苯丙氨酸-赖氨酸)、蛋白酶可切割连接子中的二肽位点、pab(对氨基苄氧基羰基)、spp(n-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶硫基)戊酸酯)、smcc(n-琥珀酰亚胺基4-(n-马来酰亚胺甲基)环己烷-1羧酸酯)、siab(n-琥珀酰亚胺基(4-碘-乙酰基)氨基苯甲酸酯)及其变体和组合。可以用于本发明的背景的连接子的其它实例公开于以下：例如，美国专利号7,754,681、ducry，《生物共轭化学(bioconjugatechem.)》，2010，21:5-13以及其中引用的参考文献，其内容通过引用整体并入本文。在一些情况下，连接子是或含有自我牺牲的间隔物，如在以下中所讨论的那些：jin等人，《生物有机化学与医药化学(bioorganic&medicinalchemistry)》，2012，20:3465-3469和wu等人，《生物有机化学与医药化学》，2016，24:2697-2706。
有效载荷可以通过在抗体或抗原结合分子内的特定氨基酸处的附接连结到抗steap2抗体或抗原结合片段。可以用于本发明的此方面的背景的示例性氨基酸附接包含以下：例如，赖氨酸(参见例如，美国专利号5,208,020；us2010/0129314；hollander等人，《生物共轭化学》，2008，19:358-361；wo2005/089808；美国专利号5,714,586；us2013/0101546以及us2012/0585592)、半胱氨酸(参见例如，us2007/0258987；wo2013/055993；wo2013/055990；wo2013/053873；wo2013/053872；wo2011/130598；us2013/0101546以及美国专利号7,750,116)、硒代半胱氨酸(参见例如，wo2008/122039和hofer等人，《美国国家科学院院刊》，2008，105:12451-12456)、甲酰基甘氨酸(参见例如，carrico等人，《自然化学生物学(nat.chem.biol.)》，2007，3:321-322；agarwal等人，《美国国家科学院院刊》，2013，110:46-51以及rabuka等人，自然-实验室指南(nat.protocols)》，2012，10:1052-1067)、非天然氨基酸(参见例如，2013/068874和wo2012/166559)以及酸性氨基酸(参见例如，wo2012/05982)。连接子还可以通过与碳水化合物的附接而与抗原结合蛋白偶联(参见例如，us2008/0305497以及ryan等人，《粮食与农业免疫学(food&agricultureimmunol.)，2001，13:127-130)和二硫化物连接子(参见例如，wo2013/085925、wo2010/010324、wo2011/018611以及shaunak等人，《自然化学生物学》，2006，2:312-313)。
药物与抗体比率(dar)是与抗体或抗原结合片段偶联的药物的平均数量，其对adc的疗效、效能和药代动力具有重要影响。在各种实施例中，dar是每抗体1、2、3、4、5、6、7或8个药物分子。在一些实施例中，dar为1到4。在某些实施例中，dar为2到4。在一些情况下，dar为2到3。在某些情况下，dar为3到4。在一些实施例中，dar为1到10、1到20或1到30(换句话说，每抗体或其抗原结合片段1到30个药物分子)。
治疗配方和给药
本发明提供了包括本发明的抗原结合分子的药物组合物。本发明的药物组合物与合适的载剂、赋形剂和其它提供经改善的转移、递送、耐受性等的试剂一起配制。在为所有药物化学家所知的处方集中可以找到许多合适的配方：雷明顿氏药物科学(remington'spharmaceuticalsciences)，麦克出版公司，伊斯顿，宾夕法尼亚州。这些制剂包含例如，粉末、糊剂、软膏、凝胶、蜡、油、脂质、含有囊泡的脂质(阳离子或阴离子)(如lipofectintm，生命科技(lifetechnologies)，卡尔斯巴德，加利福尼亚州)、dna偶联物、无水吸收膏、水包油和油包水乳液、乳液聚乙二醇(各种分子量的聚乙二醇)、半固体凝胶和含有聚乙二醇的半固体混合物。还参见powell等人，“用于肠胃外制剂的赋形剂的汇编(compendiumofexcipientsforparenteralformulations)”，pda(1998)，《药物科学与技术杂志(jpharmscitechnol)》，52:238-311。
施用于患者的抗原结合分子的剂量可以根据患者的年龄和体型、目标疾病、病症、给药途径等而变化。优选的剂量通常根据体重或体表面积计算。当本发明的双特异性抗原结合分子用于成年患者的治疗目的时，通常以约0.01mg/kg到约20mg/kg体重、更优选地约0.02mg/kg到约7mg/kg体重、约0.03mg/kg到约5mg/kg体重或约0.05mg/kg到约3mg/kg体重的单剂量静脉内施用本发明的双特异性抗原结合分子可能是有利的。根据病症的严重程度，可以调整治疗的频率和持续时间。施用双特异性抗原结合分子的有效剂量和时间表可以凭经验确定；例如，可以通过定期评估来监测患者进展，并相应地调整剂量。此外，剂量的种间缩放可以使用本领域熟知的方法进行(例如，mordenti等人，1991，《药学研究(pharmaceut.res.)》，8:1351)。
各种递送系统是已知的并且可以用于施用本发明的药物组合物，例如，在脂质体、微粒、微胶囊内包封、能够表达突变病毒的重组细胞、受体介导的胞吞作用(参见例如，wu等人，1987，《生物化学杂志(j.biol.chem.)》，262:4429-4432)。引入的方法包含但不限于皮内、肌肉内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外和口服途径。可以通过任何方便的途径施用组合物，例如通过输注或快速浓注、通过经由上皮或皮肤粘膜内层(例如，口腔粘膜、直肠和肠道粘膜等)吸收，并且可以将其与其它生物活性剂一起施用。给药可以是系统的或局部的。
可以用标准针头和注射器皮下或静脉内递送本发明的药物组合物。另外，就皮下递送而言，笔递送装置易于应用于递送本发明的药物组合物。这种笔输送装置可以是可重复使用的或一次性的。可重复使用的笔递送装置通常利用含有药物组合物的可更换药筒。一旦施用了药筒内的药物组合物的全部并且药筒是空的，就可以轻易地丢弃空药筒并用含有药物组合物的新药筒替换。然后可以重复使用笔递送装置。在一次性笔递送装置中，没有可更换的盒。相反，一次性笔递送装置预装有固持在装置内的贮存器中的药物组合物。一旦储存器中的药物组合物清空，就丢弃整个装置。
许多可重复使用的笔和自动注射器递送装置应用于皮下递送本发明的药物组合物。实例包含但不限于autopentm(owenmumford公司(owenmumford,inc.)，伍德斯托克，uk)、disetronictm笔(disetronicmedicalsystems，bergdorf，瑞士)、humalogmix75/25tm笔、humalogtm笔、humalin70/30tm笔(礼来公司(elilillyandco.,)，印第安纳波利斯，印第安纳州)、novopentmi、ii和iii(诺和诺德(novonordisk)，哥本哈根，丹麦)、novopenjuniortm(诺和诺德，哥本哈根，丹麦)、bdtm笔(贝迪医疗(bectondickinson)，富兰克林湖，新泽西州)、optipentm、optipenprotm、optipenstarlettm以及opticliktm(赛诺菲(sanofi-aventis)，法兰克福市，德国)，仅举几例。应用于皮下递送的本发明的药物组合物的一次性笔递送装置的实例包含但不限于solostartm笔(赛诺菲)、flexpentm(诺和诺德)以及kwikpentm(礼来)、sureclicktm自我注射器(安进(amgen)，千橡市，加利福尼亚州)、penlettm(haselmeier，斯图加特，德国)、epipen(dey公司(dey,l.p.))以及humiratm笔(雅培实验室(abbottlabs)，雅培科技园il)，仅举几例。
在某些情况下，药物组合物可以在控释系统中递送。在一个实施例中，可以使用泵(参见langer，同上；sefton，1987，《crc：生物医学工程评论(crccrit.ref.biomed.eng.)》，14:201)。在另一实施例中，可以使用聚合物材料；参见，受控释放的医学应用(medicalapplicationsofcontrolledrelease)，langer和wise(编辑)，1974，crc出版社，波卡拉顿，佛罗里达州。在又另一个实施例中，控释系统可以放置在组合物靶标附近，因此仅需要全身剂量的一小部分(参见例如，goodson，1984，控释的医学应用(medicalapplicationsofcontrolledrelease)，同上，第2卷，第115到138页)。其它控释系统在langer，1990，《科学(science)》，249:1527-1533的评论中讨论。
可注射制剂可以包含用于静脉内、皮下、皮内和肌内注射、滴注等的剂型。这些可注射制剂可以通过公知的方法制备。例如，可注射制剂可以通过例如，将上述抗体或其盐溶解、悬浮或乳化在无菌水性介质或常规用于注射的油性介质中来制备。作为用于注射的水性介质，例如，有生理盐水、含有葡萄糖的等渗溶液以及其它助剂等，其可以与适当的增溶剂如醇(例如，乙醇)、多元醇(例如，丙二醇、聚乙二醇)、非离子表面活性剂[例如，聚山梨醇酯80、hco-50(氢化蓖麻油的聚氧乙烯(50摩尔)加合物)]等组合使用。作为油性介质，可以采用例如，芝麻油、大豆油等，其可以与如苯甲酸苄酯、苯甲醇等增溶剂组合使用。如此制备的注射剂优选地填充在适当的安瓿中。
有利地是，将上述用于口服或肠胃外使用的药物组合物制备成适于配合一定剂量活性成分的单位剂量的剂型。单位剂量的这种剂型包含例如片剂、丸剂、胶囊剂、注射剂(安瓿剂)、栓剂等。所含有的上述抗体的量通常为每单位剂量剂型约5mg到约500mg；特别是在注射形式下，优选地上述抗体的含量为约5mg到约100mg，对于其它剂型，约10mg到约250mg。
抗原结合分子的治疗用途
本发明包含包括向有需要的受试者施用治疗组合物的方法，所述治疗组合物包括抗steap2抗体或其抗原结合片段或特异性结合cd3和steap2的双特异性抗原结合分子。治疗组合物可以包括本文公开的任何抗体或双特异性抗原结合分子以及药学上可接受的载剂或稀释剂。如本文所使用的，表述“有此需要的受试者”意指表展现出一种或多种癌症症状或标志的人或非人动物(例如，表达肿瘤或患有下文提及的任何癌症的受试者)或者以其它方式受益于steap2活性的抑制或降低或steap2+细胞(例如，前列腺癌细胞)的耗竭的人或非人动物。
本发明的抗体和双特异性抗原结合分子(以及包括其的治疗组合物)尤其可用于治疗任何其中免疫应答的刺激、活化和/或靶向将会有益的疾病或病状。特别地，本发明的抗steap2抗体或抗cd3/抗steap2双特异性抗原结合分子可用于治疗、预防和/或改善与steap2表达或活性或steap2+细胞的增殖相关或由其介导的任何疾病或病状。实现本发明的治疗方法的作用机制包含在效应细胞存在下杀死表达steap2的细胞，例如，通过cdc、细胞凋亡、adcc、吞噬作用或通过这些机制中的两种或更多种的组合。可以使用本发明的双特异性抗原结合分子抑制或杀死的表达steap2的细胞包含例如，前列腺肿瘤细胞。
本发明的抗原结合分子可以用于治疗例如，前列腺、膀胱、子宫颈、肺、结肠、肾、乳腺、胰腺、胃、子宫和/或卵巢中发生的原发性和/或转移性肿瘤。在某些实施例中，本发明的双特异性抗原结合分子用于治疗以下癌症中的一种或多种：前列腺癌、膀胱癌、宫颈癌、肺癌、结肠癌、肾癌、乳腺癌、胰腺癌、胃癌、子宫癌以及卵巢癌。根据本发明的某些实施例，抗steap2抗体或抗steap2/抗cd3双特异性抗体可用于治疗患有去势抵抗性前列腺癌的患者。根据本发明的其它相关实施例，提供了包括向患有去势抵抗性前列腺癌的患者施用本文公开的抗steap2抗体或抗cd3/抗steap2双特异性抗原结合分子的方法。本领域已知的如肿瘤扫描等分析/诊断方法可以用于确定患者是否患有去势抵抗性肿瘤。
本发明还包含用于治疗受试者中残留癌症的方法。如本文所使用的，术语“残留癌症”意指在用抗癌疗法治疗后受试者中一种或多种癌细胞的存在或持续存在。
根据某些方面，本发明提供了用于治疗与steap2表达(例如，前列腺癌)相关的疾病或病状的方法，所述方法包括在确定受试者患有前列腺癌(例如，去势抵抗性前列腺癌)后，向受试者施用一种或多种本文其它地方描述的抗steap2或双特异性抗原结合分子。例如，本发明包含用于治疗前列腺癌的方法，所述方法包括在受试者接受激素治疗(例如，抗雄激素治疗)后给患者施用抗steap2抗体或抗cd3/抗steap2双特异性抗原结合分子1天、2天、3天、4天、5天、6天、1周、2周、3周、4周、2个月、4个月、6个月、8个月、1年或更长时间。
组合疗法和配方
本发明提供了包括使用药物组合物的方法，所述药物组合物包括本文所描述的任何示例性抗体和双特异性抗原结合分子与一种或多种另外的治疗剂的组合。可以与本发明的抗原结合分子组合或与其组合施用的示例性另外的治疗剂包含例如，egfr拮抗剂(例如，抗egfr抗体[例如，西妥昔单抗或帕尼单抗]或egfr的小分子抑制剂[例如，吉非替尼或厄洛替尼])，如her2/erbb2、erbb3或erbb4等另一种egfr家族成员的拮抗剂，(例如，抗erbb2、抗erbb3或抗erbb4抗体或erbb2、erbb3或erbb4活性的小分子抑制剂)，egfrviii的拮抗剂(例如，特异性结合egfrviii的抗体)、cmet拮抗剂(例如，抗cmet抗体)、igf1r拮抗剂(例如，抗igf1r抗体)、b-raf抑制剂(例如，维莫非尼、索拉非尼、gdc-0879、plx-4720)、pdgfr-α抑制剂(例如，抗pdgfr-α抗体)，pdgfr-β抑制剂(例如，抗pdgfr-β抗体)、vegf拮抗剂(例如，vegf-trap，参见例如，us7,087,411(在本文中也称为“vegf抑制性融合蛋白”)、抗vegf抗体(例如，贝伐单抗)、vegf受体的小分子激酶抑制剂(例如，舒尼替尼、索拉非尼或帕唑帕尼))、dll4拮抗剂(例如，us2009/0142354中公开的抗dll4抗体，如regn421)、ang2拮抗剂(例如，us2011/0027286中公开的抗ang2抗体，如h1h685p)、folh1(psma)拮抗剂、prlr拮抗剂(例如，抗prlr抗体)、steap1或steap2拮抗剂(例如，抗steap1抗体或抗steap2抗体)、tmprss2拮抗剂(例如，抗tmprss2抗体)，msln拮抗剂(例如，抗msln抗体)、ca9拮抗剂(例如，抗ca9抗体)，uroplakin拮抗剂(例如，抗uroplakin抗体)等。可以与本发明的抗原结合分子组合而有益地施用的其它药剂包含细胞因子抑制剂，所述抑制剂包含小分子细胞因子抑制剂以及结合到如il-1、il-2、il-3、il-4、il-5、il-6、il-8、il-9、il-11、il-12、il-13、il-17、il-18等细胞因子或其各自的受体的抗体。本发明的药物组合物(例如，包括如本文公开的抗cd3/抗steap2双特异性抗原结合分子的药物组合物)还可以作为包括一种或多种选自以下的治疗组合的治疗方案的一部分施用：“ice”：异环磷酰胺(例如，
本发明还包含治疗组合，其包括本文提及的任何抗原结合分子和vegf、ang2、dll4、egfr、erbb2、erbb3、erbb4、egfrviii、cmet、igf1r、b-raf、pdgfr-α、pdgfr-β、folh1(psma)、prlr、steap1、steap2、tmprss2、msln、ca9、uroplakin或任何上述细胞因子中的一个或多个的抑制剂，其中所述抑制剂是适体、反义分子、核酶、sirna、肽体、纳米抗体或抗体片段(例如，fab片段；f(ab')2片段；fd片段；fv片段；scfv；dab片段；或如双抗体、三抗体、四抗体、微抗体和最小识别单位等其它工程分子)。本发明的抗原结合分子还可以与抗病毒剂、抗生素、镇痛药、皮质类固醇和/或nsaid组合施用和/或共同配制。本发明的抗原结合分子还可以作为治疗方案的一部分施用，所述治疗方案还包含放射治疗和/或常规化疗。
一种或多种另外的治疗活性成分可以在施用本发明的抗原结合分子之前、同时或之后施用；(出于本公开的目的，此类给药方案被认为是抗原结合分子与另外的治疗活性组分“组合”给药)。
本发明包含药物组合物，其中本发明的抗原结合分子与一种或多种如本文其它地方所描述的另外的治疗活性组分共同配制。
给药方案
根据本发明的某些实施例，可以在限定的时间过程内向受试者施用多剂量的抗原结合分子(例如，抗steap2抗体或特异性结合steap2和cd3的双特异性抗原结合分子)。根据本发明的此方面的方法包括向受试者依次施用多剂量的本发明的抗原结合分子。如本文所使用的，“依次施用”意指每个剂量的抗原结合分子在不同时间点施用于受试者，例如，在隔开预定间隔(例如，数小时、数天、数周或数月)的不同日期。本发明包括以下方法：其包括向患者依次施用单一初始剂量的抗原结合分子，然后施用一种或多种第二剂量的抗原结合分子，并且任选地随后施用一种或多种第三剂量的抗原结合分子。
术语“初始剂量”、“第二剂量”和“第三剂量”是指本发明的抗原结合分子的时间给药顺序。因此，“初始剂量”是在治疗方案开始时施用的剂量(也称为“基线剂量”)；“第二剂量”是初始剂量后施用的剂量；“第三剂量”是在第二剂量后施用的剂量。初始剂量、第二剂量和第三剂量可以全部含有相同量的抗原结合分子，但是在给药频率方面通常可以彼此不同。然而，在某些实施例中，在治疗过程中初始剂量、第二剂量和/或第三剂量中含有的抗原结合分子的量彼此不同(例如，适当地调高或降低)。在某些实施例中，在治疗方案开始时施用两个或更多个(例如，2、3、4或5个)剂量作为“负荷剂量”，然后是在较不频繁的基础上施用后续剂量(例如，“维持剂量”)。
在本发明的一个示例性实施例中，每个二次剂量和/或三次剂量在前一剂量后施用1到26(例如，1、11/2、2、21/2、3、31/2、4、41/2、5、51/2、6、61/2、7、71/2、8、81/2、9、91/2、10、101/2、11、111/2、12、121/2、13、131/2、14、141/2、15、151/2、16、161/2、17、171/2、18、181/2、19、191/2、20、201/2、21、211/2、22、221/2、23、231/2、24、241/2、25、251/2、26、261/2或更多)周。如本文所使用的，短语“前一剂量”意指在多次给药的顺序中抗原结合分子的剂量，其在顺序中的下一剂量之前施用于患者，没有中间剂量。
根据本发明的此方面的方法可以包括向患者施用任何数量的第二剂量和/或第三剂量的抗原结合分子(例如，抗steap2抗体或特异性结合steap2和cd3的双特异性抗原结合分子)。例如，在某些实施例中，仅向患者施用单个第二剂量。在其它实施例中，向患者施用两个或更多个(例如，2、3、4、5、6、7、8或更多个)第二剂量。同样地，在某些实施例中，仅向患者施用单个第三剂量。在其它实施例中，向患者施用两个或更多个(例如，2、3、4、5、6、7、8或更多个)第三剂量。
在涉及多个第二剂量的实施例中，每个第二剂量可以以与其它第二剂量相同的频率施用。例如，可以在前一剂量后1到2周对患者施用每个第二剂量。类似地，在涉及多个第三剂量的实施例中，每个第三剂量可以以与其它第三剂量相同的频率施用。例如，可以在前一剂量后2到4周对患者施用每个第三剂量。可替代地，对患者施用第二剂量和/或第三剂量的频率可以在治疗方案的过程中变化。给药频率也可以在医师的治疗过程中根据临床检查后个体患者的需要进行调整。
抗体的诊断用途
本发明的抗steap2抗体还可以用于检测和/或测量样品中的steap2或steap2表达细胞，例如，用于诊断目的。例如，抗steap2抗体或其片段可以用于诊断以steap2的异常表达(例如，过表达、表达不足、缺乏表达等)为特征的病症或疾病。steap2的示例性诊断测定可以包括例如，使得从患者获得的样品与本发明的抗steap2抗体接触，其中抗steap2抗体用可检测的标记或报道分子标记。可替代地，未标记的抗steap2抗体可以与本身被可检测标记的第二抗体组合用于诊断应用。可检测的标记或报道分子可以是如3h、14c、32p、35s或125i等放射性同位素；如异硫氰酸荧光素或罗丹明等荧光或化学发光部分；或如碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、辣根过氧化物酶或荧光素酶等酶。本发明的抗steap2抗体的另一个示例性诊断用途包含如89zr-去铁胺标记的等89zr标记的抗体，用于非侵入性识别和跟踪受试者中的肿瘤细胞(例如，正电子发射断层扫描(pet)成像)。(参见例如，tavare,r等人，《癌症研究》，2016年1月1日；76(1):73-82；以及azad,bb等人，《肿瘤靶标(oncotarget.)》，2016年3月15号；7(11):12344-58)。可以用于检测或测量样品中steap2的具体示例性测定包括酶联免疫吸附测定(elisa)、放射免疫测定(ria)和荧光激活细胞分选(facs)。
可以用于根据本发明的steap2诊断测定的样品包含可从在正常或病理条件下含有可检测量的steap2蛋白或其片段的患者获得的任何组织或流体样品。通常，将测量从健康患者(例如，未患有与异常steap2水平或活性相关的疾病或病症的患者)获得的特定样品中steap2的水平，以初步建立steap2的基线或标准水平。然后可以将steap2的此基线水平与从怀疑患有steap2相关疾病或病症(例如，含有steap2表达细胞的肿瘤)的个体获得的样品中测量的steap2的水平进行比较。
实例
提出以下实施例以向本领域普通技术人员提供如何制备和使用本发明的方法和组合物的完整公开和描述，并且不旨在限制发明人认为是其发明的范围。虽然已经做出了努力以确保关于使用的数字(例如，量、温度等)的准确性，但是一些实验误差和偏差应当被计算在内。除非另外指明，份数是重量份，分子量是重量平均分子量，温度是摄氏度，并且压力是或接近大气压。
实例1：抗steap2抗体的产生
抗steap2抗体通过以下获得：用人steap2抗原免疫经遗传修饰的小鼠或用人steap2抗原免疫包括编码人免疫球蛋白重链和κ轻链可变区的dna的工程小鼠。
用hsteap2抗原(seqid：1899)免疫经遗传修饰的小鼠。免疫后，从每只小鼠收获脾细胞，并且(1)与小鼠骨髓瘤细胞融合以保持其活力并形成杂交瘤细胞并筛选steap2特异性，或(2)使用作为结合和鉴定反应性抗体(抗原阳性b细胞)的分选试剂的人steap2片段分选b细胞(如us2007/0280945a1中所描述)。
最初分离出具有人可变区和小鼠恒定区的针对steap2的嵌合抗体。对抗体进行表征和选择以获得包含亲和力、选择性等所期望的特性。如果需要，用期望的人恒定区，例如野生型或经修饰的igg1或igg4恒定区替换小鼠恒定区，以产生完全人的抗steap2抗体。虽然所选择的恒定区可以根据具体用途而变化，但高亲和力抗原结合和靶特异性特征存在于可变区中。如h1h11243n何h1m7804n等抗体名称指示表示完全人抗体“h1h”或嵌合人可变/小鼠恒定区抗体“h1m”。通过杂交瘤方法鉴定的抗体用抗体id号以“n”或“n2”结尾表示；通过b细胞分选方法鉴定的抗体用抗体id号以“p”或“p2”结尾表示。
根据此实例的方法产生的示例性抗steap2抗体的某些生物学特性在下面列出的实例中详细描述。
抗steap2抗体的重链和轻链可变区氨基酸以及核酸序列
表1列出了本发明的所选抗steap2抗体的重链和轻链可变区和cdr的氨基酸序列标识符。相应的核酸序列标识符列于表2中。
表1：氨基酸序列标识符
表2：核酸序列标识符
实例2：抗人steap2抗体通过facs选择性结合到表达steap2的细胞系
通过facs分析确定抗steap2抗体选择性结合到内源性表达前列腺2(steap2)的细胞系的人六跨膜上皮抗原的能力。
简言之，将1×105个细胞与10μg/ml抗steap2抗体或同种型对照抗体在抗体稀释缓冲液中在冰上孵育30分钟。用抗体稀释缓冲液洗涤一次后，将细胞与10μg/mlpe偶联的抗人或抗小鼠fc二抗在冰上孵育30分钟。在另外一次洗涤后，将样品与cytofix(1％甲醛)一起孵育20分钟。最后一次洗涤后，将样品通过pall96孔过滤块过滤，在
表3a和表3b抗steap2抗体对steap2表达和steap2阴性细胞系的facs结合特性
表3a：所选人fc抗steap2抗体的结合特性
f.a.b.：高于背景的倍数nd：未检测出
表3b：抗steap2杂交瘤产生的抗体的结合特性
f.a.b.：高于背景的倍数nd：未检测出
如表3a和图3b中的结果所示，通过facs，几种抗steap2抗体以大于高于背景50倍的失配和低nm的ec50特异性结合到高表达steap2的c4-2前列腺腺癌细胞系。一些抗steap2抗体还与低表达steap2的hek293细胞弱结合。对steap2阴性fadu、sk-br-3和raji细胞上的大多数抗steap2抗体观察到可忽略的结合。此实例示出了本发明的几种抗steap2抗体特异性和选择性地结合到高表达steap2细胞系的能力。
实例3：抗人steap2抗体显示人类steap2的强效内化和特异性
已经描述了本发明的抗steap2抗体选择性结合到steap2表达细胞系的能力(参见实例2-facs结合)。接下来，还评估了本发明的抗steap2抗体的内化特性。
简而言之，将20,000个c4-2细胞接种在pdl包被的96孔板中。第二天，将细胞与抗人steap2抗体(10μg/ml)在冰上孵育30分钟，然后进行两次pbs洗涤。然后将细胞与alexa488偶联的抗hfcfab二抗在冰上孵育30分钟，然后再进行两次pbs洗涤。使抗体在37℃下在内化缓冲液(pbs+2％fbs)中内化1小时或保持在4℃。将细胞固定在4％甲醛中，用draq5(细胞信号传导)染色细胞核，并在imagexpressmicroxl(美谷分子仪器(moleculardevices))上获得图像。
对内化到囊泡中的总结合强度和抗体强度进行定性视觉评估，并根据以下标准评分：-(无内化或结合)、+(弱内化或结合)、++(中度内化或结合)以及+++(强内化或结合)。
如表4中的结果所示，几种抗体在c4-2细胞系上显示出强内化能力。通常，强内化与总结合强度的最高水平相关。
然后测试所选择的steap2抗体与其它人(h)steap家族成员(steap1、steap3和steap4)的结合。为评估抗steap2抗体特异性，通过基于lipofectamine2000的方法将表达与绿色荧光蛋白(gfp)融合的hsteap1、hsteap2、hsteap3或hsteap4的质粒构建体瞬时导入hek293细胞中。48小时后，瞬时转染的细胞用抗steap2抗体染色，并如上所述进行成像以进行内化测定。具有结合抗steap2抗体的gfp阳性细胞的孔被评分为阳性(+)，并且未结合抗steap2抗体的那些被评为阴性(-)。所有所测试的抗体结合hsteap2-gfp阳性细胞但不结合steap1-gfp、steap3-gfp或steap4-gfp阳性细胞，证实结合到人steap2的特异性。结果汇总在表5中。
总之发明的几种抗steap2抗体显示出有效的内化能力，并且是是结合到人steap2的特异性结合物。
表4定性评估抗steap2抗体在高表达steap2的c4-2细胞系中的内化和总结合特性
表5.抗steap2抗体的特异性：评估与gfp融合的hsteap1、hsteap2、hsteap3或hsteap4的结合
实例4：产生结合steap2和cd3的双特异性抗体
本发明提供结合cd3和steap2的双特异性抗原结合分子；这种双特异性抗原结合分子在本文中也称为“抗steap2/抗cd3或抗steap2xcd3双特异性分子”。抗steap2/抗cd3双特异性分子的抗steap2部分可用于靶向表达前列腺2的六跨膜上皮抗原(steap2)(steap2)的肿瘤细胞，并且双特异性分子的抗cd3部分可用于激活t细胞。steap2在肿瘤细胞和t细胞上的cd3的同时结合促进了活化的t细胞对靶肿瘤细胞的定向杀死(细胞裂解)。
通过标准分子克隆方法重组构建包括抗steap2特异性结合域和抗cd3特异性结合域的双特异性抗体，并在cho细胞中表达，其中抗steap2抗原结合域和抗cd3抗原结合域每种包括与共同lcvr配对的不同的独特的hcvr。在示例化双特异性抗体中，利用来自抗cd3抗体的重链、来自抗steap2抗体的重链和来自抗steap2抗体的共同轻链构建分子，并在cho细胞中表达。在一些情况下，可以利用来自抗cd3抗体的重链、来自抗steap2抗体的重链和来自抗cd3抗体的轻链或已知的与各种重链臂混杂或成对配对的抗体轻链，如vκ1-39jk5或vκ3-20jk1。
以下实例中描述的双特异性抗体由以下组成：对人可溶性异二聚体hcd3ε/δ蛋白具有不同结合亲和力的抗cd3结合臂(如本文实例12中所描述)；和人steap2(参见上面的实例1到2)。制造了具有a经修饰的(嵌合的)igg4fc结构域的示例化双特异性抗体，如2014年8月28日公开的美国专利申请公开号us20140243504a1中所示。
所构建的各种抗steap2xcd3双特异性抗体的抗原结合域的构成部分的概述列于表6中。
表6：steap2xcd3双特异性抗体的构建
表6中所列出的轻链对于双特异性抗体的cd3和steap2靶向臂是共有的。表1和表2分别列出了抗steap2臂的各种重链可变区及其对应的cdr的氨基酸和核酸序列标识符(即hcvr和lcvr衍生自h2m11162n)，以构建此实例的双特异性抗体。表15和表16分别列出了此实例的双特异性抗体的抗cd3臂的各种重链可变区及其对应的cdr的氨基酸和核酸序列标识符。
实例5：抗steap2/抗cd3双特异性抗体在体内显示出有效的抗肿瘤疗效
为确定示例性抗steap2/抗cd3双特异性抗体在体内的疗效，在携带前列腺癌异种移植物的免疫受损小鼠中进行研究。
抗steap2/抗cd3双特异性抗体在人肿瘤异种移植模型中的疗效
为评估抗steap2/抗cd3双特异性抗体在人肿瘤异种移植研究中的体内疗效，将nodscidγ(nsg)小鼠(杰克逊实验室(jacksonlaboratories)，巴尔港，缅因州)与人外周血单核细胞(pbmc，reachbio有限公司(reachbiollc.)，西雅图，华盛顿州)以及内源性表达steap2的人前列腺癌c4-2细胞(md安德森癌症中心(mdandersoncancercenter)，休斯敦，德克萨斯州)共同植入。
而言之，将5.0×106个c4-2细胞与基质胶基质(bd生物科学(biosciences)，圣何塞，加利福尼亚州)的50:50混合物中的1.25×106个人pbmc皮下(s.c.)共同植入雄性nsg小鼠的右胁腹。在植入当天(及时治疗模型)以0.1或0.01mg/kg(n＝5只小鼠/组)的剂量用抗steap2/抗cd3双特异性抗体bssteap2/cd3-001、bssteap2/cd3-002或bssteap2/cd3-003或同种型对照在腹膜内(ip)处理小鼠。
使用卡尺测量肿瘤大小2次/周，并且以体积＝(长度×宽度2)/2计算肿瘤体积。在肿瘤移植后46天的研究终点处数据显示为肿瘤大小(mm3)(表7)。
表7：抗steap2/抗cd3双特异性抗体在免疫受损异种移植模型中的疗效：立即给药
如表7中的结果所示，当在研究终点测量肿瘤大小时，bssteap2/cd3-001、bssteap2/cd3-002和bssteap2/cd3-003与同种型对照相比显著抑制肿瘤生长。重要的是，即使在0.1mg/kg的最低剂量下，抗steap2/抗cd3双特异性抗体也能有效抑制c4-2肿瘤生长。
实例6：偶联物的制备和表征
所有单克隆抗体在cho细胞中表达并通过蛋白a纯化。还以类似方式制备同种型对照。非结合同种型对照抗体衍生自与肿瘤学无关的免疫抗原。
将ph7.5的50mmhepes、150mmnacl中的抗体(10mg/ml)用1mm二硫苏糖醇在37℃下处理30分钟。在凝胶过滤(g-25、ph4.5乙酸钠)后，将在dmso(10mg/ml)中的马来酰亚胺连接子有效载荷衍生物化合物7(1.2当量/sh组)加入到经还原的抗体中，并用1mhepes(ph7.4)将混合物调整到ph7.0。化合物7和制备所述化合物的方法描述于2014年9月18日公开的pct公开号wo2014/145090中，其通过引用整体并入本文。1小时后，用过量的n-乙基马来酰亚胺淬灭反应。通过尺寸排阻色谱法纯化偶联物并无菌过滤。通过uv光谱分析确定蛋白质和连接子有效载荷浓度。尺寸排阻hplc确定所使用的所有偶联物均>95％单体，并且rp-hplc确定存在＜0.5％未偶联的连接子有效载荷。基于蛋白质滴度测定，在表8中报告产率。根据hamblett等人，《癌症研究》，2004107063，通过uv分析所有偶联的抗体的连接子有效载荷负载值。结果汇总于表8中。
可以使用类似的方法制备包括化合物60的偶联物。化合物60和制备所述化合物的方法描述于2016年10月6日公开的pct公开号wo2016/160615(实例20)中，其通过引用整体并入本文。化合物60是美登素-n-甲基-l-丙氨酸-(3-甲氧基-4-氨基)苯甲酰胺基-cit-val-cap-mal。
表8：有效载荷(化学毒性药物)和抗体-药物偶联物参数的汇总
实例7：抗steap2抗体药物偶联物(adc)是体内steap2阳性前列腺癌异种移植模型中肿瘤生长的有效抑制剂
a.为确定与化合物7偶联的抗steap2抗体的体内疗效，在携带steap2阳性前列腺癌异种移植物的免疫受损小鼠中进行研究。
对于这些研究，将雄性scid小鼠(泰康利(taconic)，哈得孙河，纽约)中植入内源性表达steap2的c4-2细胞。一旦肿瘤达到平均体积200mm3到250mm3(约第13到第17天)，将小鼠随机分入治疗组，并给药抗steap2偶联的抗体、非结合偶联的抗体或媒剂。在这些体内研究中，给药抗体一次，并且然后监测肿瘤，直到在仅用媒剂给药的组(约40到50天)中达到约1500mm3到2000mm3的平均肿瘤大小。显示疗效的治疗组维持较长时间(80到110天)。
在初始研究中，检验了与化合物7偶联的示例性抗steap2抗体在降低c4-2肿瘤体积方面的疗效。在植入后第13天，小鼠接受单剂量的抗steap2和对照adc，剂量为10mg/kg、20mg/kg或40mg/kg。如图1中所总结的，h1h7841n-7(dar2.92)在所有测试的剂量下有效抑制肿瘤生长。在最高剂量(40mg/kg)下，h1h784n-7有效地减小了肿瘤大小，尽管非结合对照抗体(40mg/kg)也显示出对肿瘤体积的影响。在所有所研究的剂量中，h1h784n-7比对照偶联的抗体更有效地减小肿瘤大小。
在第二项研究中，抗steap2adc以5mg/kg和20mg/kg施用，并且对照抗体在植入后第14天以20mg/kg施用。如图2中所总结的，h1h7841n-7(dar2.92)在前一实验中在20mg/kg剂量下有效抑制肿瘤生长，但在5mg/kg剂量下显示疗效下降。20mg/kg剂量的对照抗体显示与媒剂对照无差异。
在进一步的研究中，基于adc药物与抗体比率(“dar”)，以μg/kg药物当量给药h1h7841n-7(dar2.7)和对照抗体。在植入后第17天施用150μg/kg剂量(图3)。h1h7841n-7在150μg/kg剂量下有效抑制肿瘤生长，显示在植入后42天和注射后25天肿瘤消退。此时，肿瘤生长开始反弹。用在此剂量下的对照抗体时肿瘤生长与载剂对照没有差异。
b.在类似的研究中，将雄性scid小鼠(泰康利，哈得孙河，纽约)中植入内源性表达steap2的c4-2细胞。检验与化合物60偶联的示例性抗steap2(h1h7814n)抗体在c4-2肿瘤消退中的疗效。在植入后第29天，小鼠接受2.5mg/kg的单剂量的抗steap2adc、同种型对照adc(结合无关抗原)或载剂(pbs)。在注射后第0天(注射当天)和第4、6、8、12、14和第20天记录肿瘤体积和体重。如图4中所总结的，h1h7814n-60(dar3.6)在所测试的剂量下有效抑制肿瘤生长，显示在注射后20天(植入后49天)肿瘤消退。与使用对照ab-adc治疗的小鼠相比，测试adc的体重的百分比变化在第14天(注射h1h7814n-60后)不超过-2.01％，其中到第14天观察到体重百分比变化从-4.02％到-11.55％。
实例8：抗cd3抗体的产生
通过用表达cd3的细胞或编码cd3的dna免疫包kuo编码人免疫球蛋白重链和κ轻链可变区的dna的工程小鼠获得抗cd3抗体。通过cd3特异性免疫测定监测抗体免疫应答。当达到所期望的免疫应答时，收获脾细胞并使其与小鼠骨髓瘤细胞融合以保持其活力并形成杂交瘤细胞系。筛选并选择杂交瘤细胞系以鉴定产生cd3特异性抗体的细胞系。使用此技术获得了几种抗cd3嵌合抗体(即，具有人可变域和小鼠恒定结构域的抗体)。另外，如us2007/0280945a1中所描述的，直接从抗原阳性b细胞分离几种完全人抗cd3抗体而不与骨髓瘤细胞融合。
根据此实例的方法产生的示例性抗cd3抗体的某些生物学特性在本文的实例中详细描述。
实例9：重链和轻链可变区氨基酸和核酸序列
表9列出了本发明的所选抗cd3抗体的重链和轻链可变区和cdr的氨基酸序列标识符。相应的核酸序列标识符列于表10中。制备本文公开的抗cd3抗体的方法还可以在2014年3月27日公开的美国公开2014/0088295中找到。
表9：氨基酸序列标识符
表10：核酸序列标识符
抗体通常根据以下命名法在本文中提及：fc前缀(例如“h1h”、“h1m”、“h2m”等)，后跟数字标识符(例如“2712”、“2692”等，如表1所示)，后跟“p”、“n”、或“b”后缀。因此，根据此命名法，抗体在本文中可称为例如，“h1h2712n”、“h1m2692n”、“h2m2689n”等。本文使用的抗体名称上的h1h、h1m和h2m前缀指示抗体的特定fc区同种型。例如，“h1h”抗体具有人igg1fc，“h1m”抗体具有小鼠igg1fc，并且“h2m”抗体具有小鼠igg2fc，(所有可变区是完全人，如抗体名称中的第一个‘h’所示)。如本领域普通技术人员所理解的，具有特定fc同种型的抗体可以转化为具有不同fc同种型的抗体(例如，具有小鼠igg1fc的抗体可以转化为具有人igg4的抗体等)，但无论如何，由表1中所示的数字标识符指示的可变域(包含cdr)将保持相同，并且无论fc结构域的性质如何，预期结合特性相同或基本相似。
表11和表12列出了可用于本发明的抗steap2x抗cd3双特异性抗体的另外的抗cd3hcvr和lcvr的重链可变区(表13)和轻链可变区(表14)及其对应的cdr的氨基酸序列标识符。
表11(重链可变区氨基酸序列)
表12(轻链可变区氨基酸序列)
cd3-vh-f和cd3-vl-f的重链和轻链可变区衍生自wo2004/106380中所描述的命名为“l2k”的抗cd3抗体。
另外，表13和表14列出了编码可用于本发明的抗steap2x抗cd3双特异性抗体的另外的抗cd3hcvr和lcvr的重链可变区(表13)和轻链可变区(表14)及其对应的cdr的核苷酸序列的序列标识符。
表13(编码重链可变区序列的核苷酸序列)
表14(编码轻链可变区序列的核苷酸序列)
以下实例中使用的对照构建体
为了比较目的，在以下实验中包含各种对照构建体(抗cd3抗体)：“okt-3”，一种针对人t细胞表面抗原的小鼠单克隆抗体，其可从美国典型培养物保藏中心(atcc)获得，目录号为crl-8001；和“sp34”，一种商业上可获得的小鼠单克隆抗体，例如从biolegend，圣地亚哥，加利福尼亚州获得(目录号302914)或从bdpharmagen，其目录号为55052，对人t淋巴细胞上的t3复合物的ε链具有反应性。
实例10：另外的抗cd3抗体的产生
以下程序旨在鉴定特异性识别cd3(t细胞共受体)作为抗原的抗体。
抗cd3抗体库眼霜自经遗传修饰的小鼠。简而言之，用cd3抗原免疫小鼠并产生包括多种人vh重排的b细胞，以表达高亲和力抗原特异性抗体的多样性库。表15到表18中所描述的抗体具有与vk1-39jk5相同的轻链序列(seqidno:1890中所示的lcvr)。
在体外结合测定中测试所产生的抗体对人和食蟹猴cd3抗原的亲和力，并且例如鉴定了一种cd3抗体：其被命名为cd3-vh-p(seqidno:1882中所示的hcvr)，在少数其它中发现与具有如分别在jurkat细胞和食蟹猴t细胞的facs滴定中所测定的介于1nm与40nm之间的亲和力的ec50人和食蟹猴cd3结合。参见例如，实例12和2016年7月29日提交的pct/us2016/044732中所概述的facs结合实验。
随后鉴定cd3-vh-p的种系氨基酸残基，并将名为“cd3-vh-g”的抗体工程化为仅含有种系框架。通过众所周知的分子克隆技术工程化其它抗体衍生物，以基于种系序列与cd3-vh-p序列之间的差异以逐步方式替代氨基酸残基。。每种抗体衍生物都具有“cd3-vh-g”编号名称。参见表15。
虽然cd3-vh-g和一些其它工程化抗体保留了其在facs测定中所见的结合亲和力，但是一些双特异性形式的抗cd3抗体在体外以弱到无可测量的结合亲和力，如大于100nmec50结合到人或食蟹猴cd3。随后进一步研究结合亲和力、结合动力和其它生物学特性以阐明毒性和药代动力学(pk)谱，作为包括示例性抗cd3抗体的双特异性抗体，并根据本实施例的方法产生。
实例11：重链和轻链可变区(cdr的氨基酸和核酸序列)
表15列出了本发明的所选抗cd3抗体的重链可变区和cdr的氨基酸序列标识符。相应的核酸序列标识符列于表16中。
测定每个抗体重链序列的氨基酸和核酸序列。衍生自种系序列(seqidno:1910)的每个抗体重链被分配“g”编号名称，用于一致的命名。表15列出了本发明的工程化抗cd3抗体的重链可变区和cdr的氨基酸序列标识符。相应的核酸序列标识符列于表16中。轻链可变区和cdr的氨基酸和核酸序列标识符也分别在下面的表17和表18中鉴定。
表15：重链氨基酸序列标识符
表16：重链核酸序列标识符
表17：轻链氨基酸序列标识符
表18：轻链核酸序列标识符
基于已知的抗cd3抗体(即，wo2004/106380中所示出的抗cd3抗体“l2k”)构建成称为“cd3-l2k”的对照1抗体。
在本文实例中提及的同种型对照抗体是与无关抗原，即feld1抗原相互作用的同种型匹配的(经修饰的igg4)抗体。
实例12：人单克隆抗cd3抗体的体外和体内研究
如通过引用并入本文的2014年3月27日公开的美国公开2014/0088295和2016年7月29日提交的pct/us2016/044732中所描述，完成了人单克隆抗cd3抗体的体内和体外研究。
本发明的一些人单克隆抗cd3抗体以抗体捕获或抗原捕获形式以高亲和力结合可溶性异二聚体cd3蛋白。用人fc标签(hfcδadp/hfc；seqidno:1931/1932)或小鼠fc标签(mfcδadp/mfc；seqidno:1933/1934)制备可溶性异二聚体cd3蛋白(hcd3-ε/hcd3-δ；seqidno:1900/1901)。使用如下中描述的方法纯化异二聚体cd3蛋白：davis等人，(us2010/0331527)。
本发明的一些人单克隆抗cd3抗体结合人t细胞并诱导t细胞增殖。本发明的一些人单克隆抗cd3抗体结合cd2+cd4+猴t细胞并诱导其增殖。一些人单克隆抗cd3抗体在基于钙黄绿素的u937杀死测定中支持通过fc/fcr相互作用重定向的t细胞介导的杀死。所观察到的杀死被认为依赖于导致相邻t细胞上cd3的聚集的抗体与u937细胞上的fc受体的fc结合，其通过添加非特异性人igg而被抑制(未显示数据)。
实例13：人类steap2xcd3双特异性抗体的体外研究
jurkat细胞、pc3_steap2/1细胞和食蟹猴t细胞的facs结合滴定：流式细胞术分析用于确定steap2xcd3双特异性抗体与jurkat细胞、pc3_steap2/1嵌合细胞和食蟹猴t细胞的结合，然后用藻红蛋白(pe)标记的抗人igg抗体检测。简而言之，将2×105个细胞/孔在4℃下与steap2xcd3双特异性抗体或范围从66.6nm到0.001nm的对照抗体(结合猫抗原的人igg1抗体，其与steap2或人或食蟹猴cd3无交叉反应性)的连续稀释液孵育30分钟。孵育后，用含有1％过滤的fbs的冷pbs洗涤细胞两次，并将pe偶联的抗人二抗加入细胞中并再孵育30分钟。不含抗体或仅含二抗的孔作为对照。孵育后，洗涤细胞，重悬于200μl含有1％过滤的fbs的冷pbs中，并在bdfacscantoii上通过流式细胞术分析。
表19：所选择的steap2xcd3双特异性抗体与jurkat细胞、pc3_steap2/1细胞和食蟹猴t细胞的facs结合
jurkat细胞衍生自表达人cd3的t细胞淋巴母细胞系。所测试的所有双特异性抗体(表19和图5)以范围为1.41e-08m到6.15e-10m的ec50结合到jurkat细胞。将为人前列腺癌细胞系的pc3细工程化以表达steap2/1嵌合构建体。几种双特异性抗体以范围为7.91e-08m到3.44e-09m的ec50结合到pc3_steap2/1细胞(表19和图6)。
还测试了steap2xcd3双特异性抗体与经纯化的食蟹猴t细胞表面的结合。几种双特异性抗体结合ec50范围为1.73e-08m到7.27e-09m。对照抗体不与任一细胞系结合。参见表19以及图7和图8。
t胞增殖测定：将解冻的人或新鲜分离的猴pbmc(50,000个细胞/孔)与3倍(人，浓度范围：5e-10m到2.82e-15m；食蟹猴，浓度范围：1e-09m到4.57e-13m)在完全培养基中的steap2xcd3双特异性抗体或同种型对照(用10％fbs、100u/ml青霉素、100μg/ml链霉素，292μg/mll谷氨酰胺补充的rpmi)的连续稀释液以及固定浓度(人：200ng/ml，食蟹猴：500ng/ml)的商业抗cd28抗体(biolegend，目录号#302914)在白色平底96孔板中在37℃下一起孵育72小时。分离的猴pbmc来自两个供体(鉴定为mk8781m或mk9381m)。孵育后，加入celltiter
所有αsteap2xαcd3双特异性抗体在共刺激性抗cd28抗体存在下诱导人pbmc增殖(参见表20和图9)。将pbmc与双特异性抗体或对照抗体的连续稀释液以及固定浓度的抗cd28一起孵育72小时，并在发光测定中测量细胞活力以检测活细胞。通过比较双特异性抗体刺激细胞的发光与不含抗体的细胞的发光来确定增殖。ec50值(定义为产生最大值半数增殖所需的抗体浓度)范围为3.68e-13m到1.60e-10m。相反，对照抗体在相同条件下没有展现出活性。
表20：由所选择的steap2xcd3双特异性抗体诱导的t细胞活化增殖
双特异性抗体bssteap2/cd3-0010和bssteap2/cd3-011还诱导食蟹猴pbmc增殖(采用供体mk8781m)，分别表现出7e-13和3.6e-12的ec50。bssteap2/cd3-004活性依赖于供体。另外两种双特异性抗体bssteap2/cd3-001和bssteap2/cd3-006在所有所测试的供体中诱导强烈的食蟹猴pbmc增殖。使用供体mk9381m的ec50值分别为4.6e-12m和1.53e-11m(参见表20和图10)。
bssteap2/cd3-007和bssteap2/cd3-008活性依赖于供体。相反，bssteap2/cd3-005、bssteap2/cd3-009以及同种型对照没有展现出活性。
在抗steap2xcd3双特异性抗体和人t细胞存在下靶向c4-2细胞的细胞毒性测定：为通过流式细胞术监测携带steap2的靶细胞的特异性杀死，用1μm荧光跟踪染料violetcelltracker(生命科技试剂盒，#c34557)标记c4-2细胞。标记后，使细胞在37℃下电镀过夜。单独地，将人pbmc以1×106个细胞/ml接种在补充的rpmi培养基中，并在37℃下孵育过夜，以通过耗竭粘附的巨噬细胞、树突细胞和一些单核细胞来富集淋巴细胞。第二天，将靶细胞与粘附细胞耗竭的原初pbmc(效应细胞/靶细胞4:1比例)和steap2xcd3双特异性抗体或igg1对照抗体(不结合到steap2)的连续稀释液(浓度范围66.7nm到0.25ρm)在37℃下共同孵育48小时。使用无酶细胞解离缓冲液从细胞培养板中除去细胞，并通过facs分析。对于facs分析，细胞用死/活远红细胞跟踪仪(invitrogen)染色。在facs分析之前立即向每个孔中加入5×105个计数珠。每个样品收集1×105个珠子。为了评估杀死的特异性，在活的violet标记的群体上对细胞进行门控。记录活人口百分比并用其计算标准化存活率。
通过将细胞与直接偶联的抗体孵育到cd2和cd69，并通过报告总t细胞(cd2+)中活化的(cd69+)t细胞的百分比来评估t细胞活化。测试了几种抗steap2xcd3双特异性抗体诱导原初t细胞杀死表达人steap2的靶细胞的能力(参见表21和图11)。所测试的所有抗体活化并指导人t细胞耗竭c4-2细胞(衍生自lncap细胞的人前列腺腺癌亚系)。仅在双特异性抗体存在下观察到靶细胞杀死，其中c4-2细胞用pmec50以剂量依赖性方式耗竭。另外，所观察的靶细胞裂解与使用ρmec50的cd2+t细胞上cd69细胞的上调有关，其中(参见表21和图12)。
表21：所选择的steap2xcd3双特异性抗体的细胞毒性和t细胞活化特性
本发明不被在本文所描述的具体实施例限于一定的范围。的确，除了在此说明的那些外，从上述的说明中的本发明的不同修改对于本领域中的普通技术人员将是清楚的。此类修改旨在落入所附权利要求书的范围内。
- 还没有人留言评论。精彩留言会获得点赞！